Isolamento de tecidos embrionários e formação de órgãos quiméricoes codorna-frango, usando o exemplo do Timo

Resumo

Este artigo fornece um método para isolar tecidos embrionários puros de codorna e galinha de embriões que podem ser combinados para formar ex vivo de órgãos quimérico.

Resumo

A capacidade de isolar tecidos embrionários foi um passo essencial para o estabelecimento do sistema de codorna-frango Quimera, que por sua vez tem proporcionado contribuições indiscutível para desvelar processos-chave na biologia do desenvolvimento.

Aqui é descrito um método otimizado para isolar tecidos embrionários de codornas e galinhas por microcirurgia e digestão enzimática, preservando suas propriedades biológicas. Após o isolamento, os tecidos de ambas as espécies são associados em um ensaio in vitro de organotypic para 48 h. codorniz e tecidos de frango podem ser discriminados por distintas características nucleares e marcadores moleculares, permitindo o estudo da Cruz-conversa entre celulares heterospecific Associação dos tecidos. Esta abordagem é, portanto, uma ferramenta útil para estudar interações do tecido complexo em processos de desenvolvimento com modificações espaciais altamente dinâmicas, tais como os que ocorrem durante a morfogênese da faringe e a formação do foregut órgãos derivados endoderme. Esta abordagem experimental foi desenvolvida para estudar as interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de formação do timo. Neste, a endoderme-derivado rudimento prospectivo do Timo e derivados mesoderme mesênquima, foram isoladas a partir de embriões de codorna e galinha, respectivamente.

A capacidade dos tecidos associados para gerar órgãos pode ser ainda mais testada por enxertia-los para a membrana corioalantoicas (CAM) de um embrião de galinha. O CAM fornece nutrientes e permite trocas gasosas aos tecidos explantados. Após 10 dias de no desenvolvimento do ovo, os órgãos quiméricoes podem ser analisados nos explantes colhidos pelos métodos convencionais de morfológicos. Este procedimento também permite estudar as contribuições específicas do tecido durante a formação do órgão, de seu desenvolvimento inicial (desenvolvimento in vitro) para as etapas finais da organogênese (no desenvolvimento do ovo).

Finalmente, o método de isolamento melhorada também fornece tridimensional (3D) preservado tecidos embrionários, que também podem ser usados para análise topográfica de alta resolução de padrões de expressão gênica-tecido-específica.

Introdução

Na década de 1970, um sistema de Quimera de codorna-frango elegante foi desenvolvido por Le Douarin, abrindo novas vias para compreender o papel da migração celular e interacções celulares durante o desenvolvimento,^1,2. O modelo foi concebido na premissa de que troca de células entre as duas espécies não incomodaria significativamente a embriogênese, confirmada mais tarde quando costumava estudar inúmeros processos de desenvolvimento, incluindo a formação do sistema nervoso e o hematopoiéticas sistemas de¹. Tomando este último como um exemplo, as ondas cíclicas de progenitores hematopoiéticos, colonizando o rudimento epitelial tímico foi observado pela primeira vez usando o sistema de codorna-frango Quimera³. Por isso, o território em perspectiva do timo, a endoderme de malotes (3/4PP), terceiros e quarto lugar da faringe foi mecanicamente e enzimaticamente isolado de embriões de codorna (q) 15 a 30 - fase somite [dia embrionário (E) 1.5-E2.5]. Estas fases correspondem a galinha de Hamburger e Hamilton⁴ (HH) - estágios 12-17. Os procedimentos de isolamento começaram com o uso de tripsina para dissociar enzimaticamente a endoderme da mesênquima anexada. A endoderme isolada foi enxertada na região somatopleura do embrião de galinha (c) anfitrião na E3-E3.5 (HH-estágios 20-21). Este mesênquima heteróloga foi considerada "permissiva" para desenvolvimento de epitélio tímico, contribuindo também para a formação de órgão³. Depois, sucessivas ondas frango progenitor pelo sangue das células do hospedeiro se infiltrou a codorna doador tímicas epiteliais contraparte contribuindo para formação do Timo no embrião do anfitrião³.

Mais recentemente, uma versão modificada desta abordagem também provou-se para ser importante para o estudo de interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de Timo formação⁵. A este respeito, os tecidos envolvidos na formação do Timo ectópico em embriões quimérico³ foram isolados, tanto a partir de embriões de doador e host e associados ex vivo. Um protocolo melhorado foi usado para isolar a endoderme 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) e mesoderme frango somatopleura (E2.5-E3). Brevemente, tecidos embrionários foram isolados por microcirurgia e sujeitas a digestão in vitro pancreatina. Além disso, as condições de digestão enzimática, temperatura e tempo de incubação foram otimizadas de acordo com o tipo de tecido e grau de desenvolvimento (tabela 1).

Em seguida, os tecidos isolados foram associados em um organotypic em vitro sistema durante 48 h, como relatado anteriormente^5,6. A associação in vitro de tecidos imita as locais interações celulares no embrião, superar algumas restrições da manipulação in vivo. Este sistema é particularmente útil para estudar interações celulares no complexo morphogenic eventos, tais como o desenvolvimento do aparato da faringe.

A contribuição de cada tecido na histogênese timo, bem como a capacidade da Associação heterospecific para gerar um timo pode ser ainda mais explorado usando a metodologia de CAM, anteriormente detalhadas^5,7,8. Sucintamente, os tecidos cultivados foram enxertados o CAM de embriões cE8 e permitiu desenvolver-se em ovo por 10 dias. Então, formação de Timo foi avaliada por análise morfológica nos explantes colhidos. Conforme os estudos clássicos de codorna-galinha³, o epitélio tímico codorna foi colonizado por células progenitoras hematopoiéticas (HPCs), derivadas do embrião de galinha, que mais tarde foi mostrado para contribuir para o desenvolvimento de órgão^9,10 . Os HPCs migraram do embrião para o Timo ectópico quimérico através do altamente vascularizado CAM^5,7,8. Codorniz epitélio tímico derivado pode ser identificado por imuno-histoquímica utilizando anticorpos espécie-específicos (i.e., QCPN - MAb codorna PeriNuclear), superando a necessidade de marcadores moleculares de tecido-específica.

Esse método experimental, como a abordagem em duas fases, relatada no anterior publicação⁸, permite a modulação das vias de sinalização regular Administração de agentes farmacológicos durante in vitro e no desenvolvimento do ovo. Além disso, explantes podem ser colhidas em qualquer ponto do tempo do curso do experimento⁸.

Por último, o protocolo de isolamento aqui detalhado permite a preservação das propriedades naturais e 3D-arquitetura de tecidos embrionários, particularmente útil para o detalhamento de padrões em situ-expressão do gene embrionário territórios caso contrário inacessível por métodos convencionais. Além disso, abordagens de análise do transcriptoma, incluindo RNA-seq ou microarrays, também podem ser aplicadas em tecidos isolados sem a necessidade de marcadores genéticos, proporcionando uma análise de "omics" alto throughput tecido-específica.

Protocolo

Todas estas experiências sigam os cuidados com animais e diretrizes éticas do Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. fertilizados incubação de ovos de codorna e galinha

1. Lugar fertilizado ovos de codornas japonesas (Coturnix japonica coturnix) numa incubadora umidificado de 38 ° C durante 3 dias. Incube os ovos (fim brusco do ovo) virada para cima na câmara de ar.
   Nota: O ambiente umidificado é conseguido colocando um recipiente de água na parte inferior da incubadora.
2. Incube os ovos fertilizados de galinha (Gallus gallus) 2,5 dias numa incubadora umidificado de 38 ° C. Incubar os ovos na posição horizontal e marcar a parte superior usando um pedaço de carvão para identificar a localização do embrião.
   Nota: Comece com 40 ovos de codorna e 60 ovos de galinha ao estabelecer esta experiência.

2. isolamento de endoderme codorna que contém o domínio em perspectiva do rudimento do Timo

Nota: Use uma capa de fluxo laminar horizontal e instrumentos esterilizados e materiais para procedimentos de manipulação de ovo em condições estéreis.

1. Remover a região embrionária que contém o território presuntivo de rudimento do timo, região arco faríngea, contendo os 3^rd e 4^th arcos (3/4PAR), como descrito^7,8.
   1. Encha uma tigela grande de vidro de borosilicato (100 x 50 mm; 100 cm³) com 60 mL de solução salina tamponada de fosfato fria (PBS).
   2. Com a ajuda de uma tesoura curva, toque e cortar um buraco circular no shell de uma codorna ovo que tem sido incubado por 3 dias. Fazer o buraco no lado oposto do ovo sem corte e transferir a gema (com o embrião) para a tigela com PBS frio.
   3. Remova o embrião da gema cortando a membrana vitelínico externamente aos navios extra embrionários usando tesouras curvas.
   4. Com a ajuda da pinça fina, transferência do embrião para uma tigela pequena (60 x 30 mm; 15 cm³) preenchido com 10 mL de PBS frio.
   5. Com uma escumadeira, mover o embrião para uma placa de Petri com uma base preta de 100 mm (ver Tabela de materiais) contendo 10 mL de PBS frio e coloque-o sob um estereomicroscópio.
   6. Disse o 3/4PAR, como descrito anteriormente⁸.
   7. Aspire o 3/4PAR e transferir para um prato de vidro 3/4 cheio de PBS frio usando uma pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
2. Isole a endoderme contendo o território presuntivo de rudimento do timo (endoderme 3/4PP) por digestão enzimática com pancreatina.
   1. Com a ajuda de uma espátula e pinça fina, transferência a 3/4PAR para um prato de vidro 3/4 cheio de fria pancreatina (8 mg/mL; diluição de 1:3 de 25 mg/mL com PBS frio).
   2. Incube durante 1 h no gelo por digestão enzimática.
      Nota: O tempo de digestão enzimática depende do estágio de desenvolvimento (tabela 1).
   3. Coloque o prato de vidro sob o microscópio estereoscópico (ampliação de x-60 x 40) para isolar a endoderme do 4PAR/3.
      Nota: Mantenha todas as superfícies e soluções frio durante este procedimento. Mudar para uma nova solução de pancreatina frio se demorar muito tempo para dissecar os tecidos (> 15 min). Como uma fonte de iluminação, use luzes LED incorporadas no estereomicroscópio ou nas fibras ópticas, considerando a carga de calor limitada.
   4. Para isolar a endoderme os tecidos circundantes, use dois microscalpels de aço inoxidável em titulares de pino.
      Nota: Use microscalpels com um diâmetro entre 0,1 mm e 0,2 mm e detentores de pino de níquel com um diâmetro de abertura do maxilar de 0 mm a 1 mm.
      1. Primeiro remova o tubo neural e mesoderme anexado à superfície dorsal da endoderme da faringe.
      2. Com o lado dorsal para cima, desanexar e Retire cuidadosamente a mesênquima entre os arcos da faringe e expor as bolsas faríngeas. Execute este procedimento em ambos os lados da 4PAR/3.
      3. Remova o tubo de coração e a mesênquima circundante anteriores malotes.
      4. Com o lado ventral para cima, corte do ectoderma do^nd 2 e 3^rd arcos pharyngeal e remova cuidadosamente a mesênquima anexada para malotes. Repita este procedimento do outro lado do 3/4PAR. Nesta fase o rudimento da tireoide deve ser visível.
      5. Remova qualquer restantes células mesenquimais anexadas a endoderme da faringe com os dois microscalpels.
      6. Faça um corte transversal entre os 2^nd e 3^rd PP, dissociando a endoderme da faringe contendo os 3^rd e 4^th malotes da parte anterior da endoderme tendo o rudimento de tireoide e 2^nd bolsa faríngea.
      7. Com a ajuda de uma espátula e pinça fina, transferência isolada 3/4PP endoderme para um prato de vidro 3/4 cheio de 100% frio fetal de soro bovino (FBS).
3. Mantenha o prato de vidro com os tecidos isolados no gelo durante a preparação do ensaio in vitro. Como alternativa, os tecidos isolados podem ser preservados tridimensionalmente e analisadas no local para expressão do gene.

3. isolamento da mesoderme somatopleura de frango

Nota: Ovo de executar procedimentos de manipulação em condições estéreis, usando um capuz de fluxo laminar horizontal e instrumentos esterilizados e materiais.

1. Remova o território embrionário contendo a mesoderme somatopleura ao nível dos somitas 19-24 (ss19-24).
   1. Remova o ovo de galinha da incubadora após 2,5 dias de incubação.
   2. Com uma tesoura curva, abra um pequeno buraco no shell. Inserir uma agulha e aspirar 2 mL de albumina com uma seringa de 10 mL para diminuir volume dentro do ovo, albumina e impedir os danos do embrião (localizado abaixo da região marcada do reservatório). Descarte a albumina aspirada.
   3. Cortar uma circular do furo (até dois terços da superfície superior) na região do reservatório com uma tesoura curva marcada.
   4. Corte a membrana vitelínico externamente aos vasos extraembryonic mantendo o embrião com pinça fina.
   5. Sob um estereomicroscópio, coloca o embrião em um prato de Petri de 100 mm com uma base preta contendo 10 mL de PBS frio.
      Nota: Use um estereomicroscópio desse ponto em diante para ampliação progressiva dos procedimentos de microcirurgia.
   6. Use quatro pinos finos de insetos para manter o embrião à parte inferior da placa. Coloque os pinos na região extraembryonic, formando um quadrado.
   7. Execute dois cortes entre as somitas 19 e 24 transversalmente ao eixo do embrião e atravessando todo o território embrião, usando tesouras de olho wecker.
   8. Liberar a seção de embrião, ss19-24, por cortar bordas marginais embrionárias.
   9. Aspire o ss19-24 tecidos e transferir para um prato de vidro 3/4 cheio de PBS frio usando uma pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
2. Isole a mesoderme lateral da região somatopleura (ss19-24) por digestão enzimática com pancreatina (8 mg/mL; diluição de 1:3 de 25 mg/mL com PBS frio).
   1. Com a ajuda de uma espátula e pinça fina, transferência dos tecidos ss19-24 para um copo prato três quartos cheios de solução fria de pancreatina.
   2. Incube durante 30 min no gelo por digestão enzimática.
   3. Sob o microscópio estereoscópico, isole a mesoderme os tecidos circundantes, usando duas microscalpels em um suporte.
      Nota: Mantenha todas as superfícies e soluções frio durante este procedimento. Mudar para uma nova solução de pancreatina frio se demorar muito tempo para dissecar os tecidos (> 10 min.). Como uma fonte de iluminação, use luzes LED incorporadas no estereomicroscópio ou nas fibras ópticas, considerando a carga de calor limitada.
   4. Durante o isolamento da mesoderme, primeiro remova o ectoderma da superfície seguido por cuidadoso descolamento dos tecidos splancnopleura localizado ventralmente.
   5. Lançamento da somatopleura por cortá-lo em um movimento paralelo ao tubo neural mesoderme lateral direita.
   6. Repita a separação de mesoderme do lado esquerdo do embrião.
      Nota: Fazer diminuir microscalpel movimentos durante este procedimento. As proteínas de matriz extracelular expostas manter instrumentos impedindo movimentos fluidos e tecidos.
   7. Com a ajuda de uma espátula e pinça fina transferência a mesoderme isolada para um prato de vidro 3/4 cheio de frio FBS.
3. Mantenha o prato de vidro com os tecidos isolados no gelo durante a preparação do ensaio in vitro.

4. In vitro organotypic ensaio: Associação de heterospecific de codorna 3/4PP endoderme e mesoderme somatopleura de frango

1. Prepare o meio de cultura com RPMI-1640, suplementado com 10% FBS e 1% caneta/Strep^3,5.
2. Coloque uma grade de metal em um tubo de ensaio com 5 mL de meio de cultura de 35mm.
   Nota: Remova o excesso de líquido para nivelar a superfície média com a parte superior da grade.
3. Com a ajuda da pinça fina, mergulhe um filtro de membrana no meio de cultura e em seguida, coloque-o na parte superior da grade para ter uma superfície em contacto com o ar.
   Nota: Um quarto da área da membrana (com 13 mm de diâmetro) é adequado para a associação de tecido.
4. Sob o microscópio estereoscópico, associe os tecidos isolados na parte superior do filtro de membrana. Primeiro transferir 3/4PP endoderme (passo 2) do prato de vidro, deslizando suave com a ajuda de uma colher de transplante (ou espátula) e fina fórceps. Repita este procedimento para a mesoderma isolada (etapa 3).
   Nota: Com a ajuda de um microscalpel, mistura os tecidos para maximizar sua associação.
5. Coloque cuidadosamente os tecidos associados numa incubadora umidificado a 37 ° C com 5% de CO₂ para tecidos cultivadas de 48 h. podem ser enxertados a membrana corioalantoicas (CAM).
   Nota: Formação de órgão ectópica no CAM foi anteriormente detalhadas⁸.

Resultados

O protocolo detalha um método para isolar tecidos embrionários aviária para ser usado em várias abordagens técnicas de biologia celular e do desenvolvimento. Este método foi empregado anteriormente para estudar interações epitelial-mesenquimal durante as fases iniciais de Timo formação⁵. Neste documento, novos resultados são mostrados na Figura 1 e Figura 2, usando abordagens semelhantes.

Discussão

O procedimento de isolamento de tecido embrionário detalhado aqui foi melhorado de técnicas anteriores para produzir embriões quiméricoes de codorna-frango em diferentes contextos biológicos^3,5,6.

Essa abordagem é apropriada isolar tecidos embrionários puros sem a necessidade de manipulação genética ou o uso de marcadores de tecido-específica, que muitas vezes são indeterminadas, limitando...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		Poultry farm
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP centrifuge tubes	Corning	430052
50 mL PP centrifuge tubes	Corning	430290
60 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 48
Metal grid	Goodfellows		fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)			from supermarket
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)			from supermarket
Transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette	Normax	5426015
Clear plastic tape			from supermarket
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit	ELKEM/Silmid	RH141001KG	To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08	Curved scissors
Insect pins	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula	Fine Science Tools	10087-12	Transplantation spoon
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
Camera	Leica Microsystems	MC170 HD
Microscope	Leica Microsystems	DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner	Hamamatsu Photonics	C13220-01
Stereoscope	Leica Microsystems	Leica M80