АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта статья предоставляет метод для изоляции чисто эмбриональных тканей из перепелов и курица эмбрионов, которые могут быть объединены в ex vivo химерных органов.

Аннотация

Способность изолировать эмбриональных тканей является важным шагом для создания системы Химера перепела курица, которая в свою очередь неоспоримый вклад в открытие ключевых процессов в биологии развития.

Здесь будет описано оптимизированный метод для изоляции эмбриональных тканей из перепелов и куры микрохирургии и ферментативного пищеварения при сохранении его биологических свойств. После изоляции тканей из обоих видов связаны в assay в пробирке organotypic за 48 ч. перепела и курица тканей могут подвергаться ядерной особенностями и молекулярных маркеров, позволяя изучение клеточных кросс беседы между неспецифический Ассоциация тканей. Таким образом, этот подход является полезным инструментом для изучения взаимодействия сложных тканей в процессы развития с высокодинамичные пространственные изменения, например тех, кто во время глоточные морфогенеза и формирование Передняя кишка эндодермы производные органы. Этот экспериментальный подход был впервые разработан для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса. В этом, энтодермы производные перспективных тимуса рудимент и мезодермы производных мезенхимы, были изолированы от перепела и куриного эмбриона, соответственно.

Связанные тканей способность генерировать органов может быть далее проверена путем прививки их на chorioallantoic мембрану (CAM) куриного эмбриона. CAM позволяет обмена газа в explanted ткани и питательных веществ. После 10 дней в развитии ovo химерных органы могут быть проанализированы в заготовленной эксплантов обычные Морфологические методы. Эта процедура также позволяет изучать ткани конкретных взносов во время формирования органа, от его первоначальной разработки (в лабораторных условиях развития) на заключительных этапах органогенеза (в развитии ovo).

Наконец, метод улучшения изоляции также предоставляет трехмерно (3D) сохранились эмбриональных тканей, которые могут также использоваться для высокого разрешения топографический анализ экспрессии генов ткани конкретных моделей.

Введение

В начале 1970-х элегантный перепела курица Химера система была разработана Le Douarin, открывая новые возможности для понимания роли миграции клеток и клеточных взаимодействия во время разработки1,2. Модель была разработана исходя из того, что клетки обмен между двумя видами не будет значительно нарушить эмбриогенеза, позднее подтвердили, когда используется для изучения многочисленных процессов развития, включая формирование нервной и Кроветворная системы1. Принимая последний, как например, циклические гемопоэтических прародителей, колонизируя тимуса эпителиальные рудимент был впервые наблюдать волны с помощью системы перепела курица Химера3. Для этого перспективные территории тимуса, энтодермы третий и четвертый глоточные Чехлы (3/4PP), был механически и ферментативно изолирован от перепела (q) эмбрионов на 15-30 - Сомит стадии [1,5 E2.5 эмбриональных день (E)]. Эти этапы соответствуют куриный гамбургер и Хэмилтон4 (HH) - 12-17 этапов. Процедуры изоляции началась с использованием трипсина ферментативно не присоединяться энтодермы от прилагаемый мезенхимы. Изолированные энтодермы был привитые в регионе somatopleura эмбриона курицы (c) разместить на E3-E3.5 (HH-этапы 20-21). Этот гетерологичных Мезенхима считался «разрешительный» для развития тимуса эпителия, также способствующих формирования органа3. Потом последовательные волны Куриные хост кровь прогениторных клеток проникли перепелиные доноров тимуса эпителиальные двойники способствует формированию тимуса в принимающей эмбриона3.

Совсем недавно модифицированную версию этого подхода также было доказано, чтобы быть важным для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса5. В этом отношении ткани, участвует в формировании внематочная тимуса в эмбрионов химерных3 были изолированы, оба от доноров и принимающих эмбрионы и связанные ex vivo. Улучшенная протокол был использован для изолировать энтодермы Перепелиные 3/4PP (E2.5-E3) и куриные somatopleura мезодермы (E2.5-E3). Вкратце эмбриональных тканей были изолированы, микрохирургии и при условии соблюдения в пробирке Панкреатин пищеварение. Кроме того условия ферментативного пищеварения, температура и время инкубации были оптимизированы по ткани типа и стадии развития (Таблица 1).

Далее изолированные тканей были связаны в organotypic в системе in vitro в течение 48 часов, как сообщалось ранее5,6. В пробирке Ассоциация тканей имитирует местной сотовой взаимодействий в эмбрион, преодолеть некоторые ограничения в естественных условиях манипуляции. Эта система особенно полезна для изучения клеточных взаимодействия в сложных морфообразующих события, такие как развитие глоточные аппарата.

Вклад каждого ткани тимуса Гистогенез, а также способность неспецифический ассоциации для создания тимуса может быть изучены с использованием методологии CAM, ранее подробные5,,78. Лаконично культивированный тканей были привитым CAM Уэ8 эмбрионов и позволило разработать в ovo на 10 дней. Затем тимус формирования была оценена морфологического анализа в заготовленной эксплантов. Как в классических исследований куриные перепелиные3перепелиные тимуса эпителия была колонизирована гемопоэтических предшественников клетки (HPCs), полученные из куриного эмбриона, который позднее был показан вносить орган развития9,10 . HPCs мигрировали из эмбриона внематочная химерных тимуса через5,высоко васкуляризированной CAM,7,,8. Перепелка, производные тимуса эпителия может быть идентифицирован иммуногистохимии, используя вегетационных антитела (т.е., QCPN - МАБ перепелиные PeriNuclear), преодоление потребность тканей конкретных молекулярных маркеров.

Этот экспериментальный метод, как сообщалось в предыдущие публикации8, двухэтапный подход позволяет модуляции сигнальных путей регулярные администрации фармакологических агентов во время в пробирке и в развитии ovo. Кроме того эксплантов могут быть собраны в любой момент времени курс эксперимент8.

И наконец Протокол изоляции здесь подробно позволяет сохранение природных свойств и 3D-архитектура эмбриональных тканей, особенно полезно для детализации структуры на местах экспрессии генов эмбриональных территорий в противном случае недоступны обычные методы. Кроме того транскриптом анализ подходов, включая РНК seq или microarrays, может также применяться в отдельных тканях не требуя генетических маркеров, обеспечивая анализ «омику» ткани конкретных высокой пропускной способности.

протокол

Все эти эксперименты следовать ухода за животными и этические принципы Medicina де истории Centro de Lisboa.

1. перепела и куриные яйца инкубации оплодотворенной

  1. Место оплодотворенные яйца японского перепела (перепела перепела japonica) в увлажненные инкубатор 38 ° C в течение 3 дней. Инкубируйте яйца (яйцо тупой конец) вверх в воздушные камеры.
    Примечание: Увлажненный окружающей среды достигается путем размещения контейнер воды в нижней части инкубатора.
  2. Инкубируйте оплодотворенные яйца куриные (Gallus gallus) 2,5 дней в 38 ° C увлажненные инкубатора. Инкубировать яйца в горизонтальном положении и Марк верхней стороне, используя кусок древесного угля для определения местоположения эмбриона.
    Примечание: Начать с 40 перепелиные яйца и 60 Куриные яйца, при установлении этого эксперимента.

2. изоляция перепелиные энтодермы, содержащий перспективных домен тимуса рудимент

Примечание: Используйте горизонтальные Ламинарный шкаф и стерилизовать инструменты и материалы для процедур обработки яйцо в стерильных условиях.

  1. Удаление эмбриональных области, содержащие территории предполагаемого тимуса рудимент, глоточные арка региона, содержащий 3rd и 4й арки (3/4PAR), как описано в7,8.
    1. Заполните чашу большой боросиликатное стекло (100 мм х 50 мм; 100 см3) с 60 мл холодного фосфат буфер солевой раствор (PBS).
    2. С помощью изогнутые ножницы коснитесь и вырезать круглое отверстие в корпусе перепелиные яйца, инкубировали в течение 3 дней. Сделайте отверстие на противоположной стороне яйцо тупым и передачи желток (с эмбриона) в миску с холодной PBS.
    3. Удалите эмбриона от желтка, резка vitelline мембраны внешне экстра эмбриональных судов с использованием изогнутые ножницы.
    4. С помощью тонкой щипцы передачи эмбриона в небольшой миске (60 x 30 мм, 15 см3) заполнены с 10 мл холодного PBS.
    5. С скиммера, переместить эмбриона в 100 мм Петри с черным основанием (см. Таблицу материалы) содержащие 10 мл холодного PBS и поместите его под стереомикроскопом.
    6. Вскрыть 3/4PAR, как описано выше8.
    7. Аспирационная 3/4PAR и передачи в стеклянную посуду три четверти заполнены с холодной PBS с помощью 2 мл стерильные пипетки Пастера.
  2. Изолируйте энтодермы, содержащий территории предполагаемого тимуса рудимент (3/4PP эндодермы) путем ферментативного пищеварения с Панкреатин.
    1. С помощью шпателя и тонкий щипцы передачи 3/4PAR стекло блюдо три четверти заполнены с холодной Панкреатин (8 мг/мл; разбавления 1:3, 25 мг/мл с холодной PBS).
    2. Инкубируйте 1 час на льду для ферментативного пищеварения.
      Примечание: Время ферментативного пищеварения зависит от стадии развития (Таблица 1).
    3. Установите стеклянную посуду под стереомикроскопом (40 x-60 крат), чтобы изолировать энтодермы от 3/4PAR.
      Примечание: Сохраняйте все поверхности и решения холодной во время этой процедуры. Изменить в новое решение холодной Панкреатин, если слишком много времени для рассечения тканей (> 15 мин). Качестве источника освещения используйте светодиодные огни включены в стереомикроскопом или оптических волокон, учитывая ограниченные тепловой нагрузки.
    4. Чтобы изолировать энтодермы от окружающих тканей, используйте две из нержавеющей стали микроскальпели в Держатели PIN-код.
      Примечание: Используйте микроскальпели диаметром от 0,1 мм – 0,2 мм и никель ПИН Держатели с челюсть открытия диаметром 0 мм до 1 мм.
      1. Сначала удалите нервной трубки и мезодермы, на спинной поверхности глотки энтодермы.
      2. С спинной стороне вверх тщательно отсоединения и удаления Мезенхима между глотки арки и разоблачить глоточные чехлы. Выполните эту процедуру на обеих сторонах 3 4PAR.
      3. Удаление сердце трубки и мезенхимы, вокруг передней чехлы.
      4. С вентральной стороне вверх вырезать эктодермы 2nd и 3rd глоточные арки и тщательно удалить мезенхимы, придает чехлы. Повторите эту процедуру на другой стороне 3/4PAR. На данном этапе рудимент щитовидной железы должны быть видны.
      5. Удалите любые оставшиеся мезенхимальных клеток, придает глоточные энтодермы с двумя микроскальпели.
      6. Сделать поперечный разрез между 2-й и 3rd PP, отделения глоточные энтодермы, содержащий 3rd и 4й Чехлы из передней части энтодермы, рудимент щитовидной железы и 2nd глоточной сумке.
      7. С помощью шпателя и тонкий щипцы передачи изолированных энтодермы 3/4PP стекло блюдо три четверти заполнены с 100% холодной плода бычьим сывороточным (ФБС).
  3. Держите стеклянную посуду с изолированной тканей на льду во время подготовки в пробирке assay. Кроме того изолированные тканей могут сохраняться трехмерно и на месте проанализированы для выражения гена.

3. изоляция курица somatopleura мезодермы

Примечание: Выполнение яйцо процедур обработки в стерильных условиях, с использованием горизонтальной Ламинарный шкаф и стерилизации инструментов и материалов.

  1. Удаление эмбриональных территории, содержащие somatopleura мезодермы на уровне сегменты 19-24 (ss19-24).
    1. Удаление куриное яйцо из инкубатора после 2,5 дней инкубации.
    2. Изогнутые ножницы откройте небольшое отверстие в корпусе. Вставьте иглу и аспирационная 2 мл альбумина с 10 мл шприц для снижения альбумина объем внутри яйца и предотвращения повреждения зародыша (находится ниже регионе заметно оболочки). Отменить без наддува альбумина.
    3. Циркуляр вырезать отверстие в регионе заметно консоли с помощью изогнутые ножницы (до двух третей площади верхней поверхности).
    4. Вырежьте vitelline мембраны внешне extraembryonic сосудов, удерживая эмбриона тонким пинцетом.
    5. Под стереомикроскопом место эмбриона в 100 мм Петри с черная база, содержащая 10 мл холодного PBS.
      Примечание: Используйте стереомикроскопом от этой точки вперед для прогрессивного увеличения микрохирургии процедур.
    6. Используйте четыре тонкие штыри насекомых провести эмбриона в нижней части пластины. Место контакты в регионе extraembryonic, образуя квадратную форму.
    7. Выполнение двух разрезов между 19 и 24 поперечно к оси эмбриона сегменты и пересекает всю территорию эмбриона, ножницами Веккер глаз.
    8. Релиз разделе эмбриона, ss19-24, резка маргинальных эмбриональных края.
    9. Аспирационная ss19-24 тканей и передачи в стеклянную посуду три четверти заполнены с холодной PBS с помощью 2 мл стерильные пипетки Пастера.
  2. Изолируйте боковой мезодермы из района somatopleura (ss19-24), ферментативного пищеварения с Панкреатин (8 мг/мл; разбавления 1:3, 25 мг/мл с холодной PBS).
    1. С помощью шпателя и тонкий щипцы, передачи ss19-24 тканей на стакан блюдо три четверти заполнены раствором холодной Панкреатин.
    2. Инкубируйте 30 мин на льду для ферментативного пищеварения.
    3. Под стереомикроскопом изолируйте мезодермы от окружающих тканей, с использованием двух микроскальпели в держатель.
      Примечание: Сохраняйте все поверхности и решения холодной во время этой процедуры. Изменить в новое решение холодной Панкреатин, если слишком много времени для рассечения тканей (> 10 мин.). Качестве источника освещения используйте светодиодные огни включены в стереомикроскопом или оптических волокон, учитывая ограниченные тепловой нагрузки.
    4. Во время изоляции мезодермы сначала удалите эктодермы на поверхности после тщательного отряд вентрально расположен splancnopleura тканей.
    5. Релиз правой боковой мезодермы somatopleura путем разрезания его в параллельное движение к нервной трубки.
    6. Повторите разделение мезодермы в левой части зародыша.
      Примечание: Убедитесь, медленно microscalpel движений во время этой процедуры. Матрица подвергается внеклеточных белков прилипает к ткани и инструментов предотвращения движения жидкости.
    7. С помощью лопаточки и тонкий щипцы передачи изолированных мезодермы стеклянную посуду три четверти заполнены с холодной FBS.
  3. Держите стеклянную посуду с изолированной тканей на льду во время подготовки в пробирке assay.

4. В пробирке organotypic проба: неспецифический Ассоциация Перепелиные 3/4PP энтодермы и мезодермы курица somatopleura

  1. Подготовка питательной среды с среднего RPMI 1640, дополненная 10% FBS и 1% перо/Strep3,5.
  2. Установите металлическую сетку в 35 мм Петри с 5 мл питательной среды.
    Примечание: Удалите избыток жидкости до уровня средней поверхности с верхней части сетки.
  3. С помощью тонкой щипцы окунуть мембранный фильтр в питательной среды и затем поместите его в верхней сетке, чтобы иметь одну поверхность при контакте с воздухом.
    Примечание: Одна четверть области мембраны (с 13 мм диаметром) является достаточным для ассоциации ткани.
  4. Под стереомикроскопом свяжите изолированных тканей верхней части мембраны фильтра. Сначала передачи 3/4PP эндодермы (шаг 2) из стеклянную посуду с нежным скольжения с помощью трансплантации ложкой (или шпателем) и тонкого щипцами. Повторите эту процедуру для изолированных Мезодерма (шаг 3).
    Примечание: С помощью microscalpel, сочетание тканей, чтобы максимизировать свои ассоциации.
  5. Осторожно поместите связанные тканей в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO2 на 48 ч. искусственный тканей можно привитым chorioallantoic мембраны (CAM).
    Примечание: Внематочная орган формирования в CAM был ранее подробные8.

Результаты

Протокол подробно метод, чтобы изолировать птичьего эмбриональных тканей для использования в нескольких сотовых и развития биологии технических подходов. Этот метод был ранее работал учиться эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирова...

Обсуждение

От предыдущих методов для создания химерных перепела куриных эмбрионах в различных биологических условиях3,5,6была улучшена процедура изоляции эмбриональных тканей, подробно здесь.

Этот подход подходит для изоляции чис...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Изабель Alcobia для критического чтения рукописи, Марио Энрикес для видео повествования и Vitor Proa от службы гистология Instituto de Histologia e Biologia делать Desenvolvimento, прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa, для технической поддержки. Мы признательны особенно Паулу Caeiro и Уго Силва из Unidade de audiovisuais (аудиовизуальных единица), прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa за их выдающуюся приверженность производства этого видео. Мы признаем Leica Microsystems за любезно предоставление стереоскоп, оборудовано системой видео и для Interaves - Sociedade Агро-Pecuária, С.А. вклад с перепелиным оплодотворенных яиц. Эта работа была поддержана прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)Pintobar, PortugalPoultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)Interaves, PortugalBird farm 
15 mL PP centrifuge tubesCorning430052
50 mL PP centrifuge tubesCorning430290
60 x 20 mm pyrex dishesDuran group21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishesDuran group21 755 48
Metal gridGoodfellowsfine meshed  stainless steel grid
Membrane filterMilliporeDTTP013000.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)from supermarket 
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)from supermarket 
Transfer pipettesSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipetteNormax5426015
Clear plastic tapefrom supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
Fetal Bovine SerumInvitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
PancreatinSigma-AldrichP-3292Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-StreptomycinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN antibodyDevelopmental Studies Hybridoma BankQCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg KitELKEM/SilmidRH141001KGTo prepare the back base for petri dish
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-30 Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curvedFine Science Tools14085-08Curved scissors
Insect pins Fine Science Tools26001-300.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula Fine Science Tools10087-12Transplantation spoon
Minutien PinsFine Science Tools26002-200.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien PinsFine Science Tools26002-100.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12Nickel plated pin holder
Moria Perforated SpoonFine Science Tools10370-17Skimmer
Wecker Eye ScissorFine Science Tools15010-11
CameraLeica Microsystems MC170 HD
MicroscopeLeica Microsystems DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner Hamamatsu PhotonicsC13220-01
StereoscopeLeica Microsystems Leica M80

Ссылки

  1. Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
  3. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
  4. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  5. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
  6. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
  7. Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
  8. Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
  9. Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
  10. Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
  11. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  12. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
  13. Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
  14. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
  15. Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  16. Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
  17. Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1443Dorganotypic assay

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены