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要約

この記事は、ex vivo キメラ器官を形成して結合することができますウズラと鶏の胚から純粋な萌芽期ティッシュを分離する方法を提供します。

要約

萌芽期ティッシュを分離する能力は、順番発表発生生物学における主要なプロセスへの明白な貢献を提供しているうずら鶏キメラ システムを確立するための重要なステップだった。

ここにはうずらとマイクロサージェリーとその生物学的特性を維持しながら酵素消化による鶏胚組織を分離するための最適化手法を説明しました。分離後、両種から組織は 48 h. ウズラの in vitro における切片アッセイ、関連付けられて、ニワトリ組織は明瞭な核機能と細胞間クロストークの検討できるように分子マーカーによって差別することができます。異種組織の協会。このアプローチは、したがって、前腸の形成と咽頭の形態形成時に発生するものなど、非常にダイナミックな空間変更と発達過程の複雑な組織の相互作用を研究するための便利なツール内胚葉由来の器官。この実験的アプローチは、胸腺形成の初期段階における上皮・間葉相互作用を最初に開発されました。これは、内胚葉由来の将来胸腺原基と中胚葉由来の間充織であったウズラと鶏の胚から分離。

鶏胚漿尿膜 (CAM) にそれらを移植で臓器を生成する関連組織の容量をさらにテストできます。カムは栄養素を提供し、explanted ティッシュにガス交換をできます。Ovo 開発の 10 日後は、キメラの臓器収穫植で従来の形態学的方法で分析できます。この手順も可能、初期開発 (体外) からの器官形成中に組織固有の貢献を勉強 (ovo 開発) における器官形成の最終段階です。

最後に、改善された分離メソッドも提供します立体的 (3 D) 保持萌芽期ティッシュのティッシュ特定の遺伝子発現パターンの高解像度地形解析も使用できます。

概要

1970 年代初頭のエレガントなウズラ鶏キメラ システムは開発1,2の間に細胞の遊走や細胞間相互作用の役割を理解する新たな道を開くル Douarin によって開発されました。2 種間のセル交換が大幅胚形成、神経系の形成、造血など数多くの発達過程を研究するために使用するとき後で確認を妨げないことを前提に考案されたモデルシステム1。後者の例として取って、造血前駆細胞胸腺上皮原基を植民地化の周期波最初うずら鶏キメラ システム3を使用してを観察されました。そのため胸腺、第三および第四咽頭ポーチ (3/4 pp) の内胚葉の未探査地域機械的および酵素によってから分離されたウズラ (q) 胚体節段階 15-30 [日 (E) 1.5-E2.5].これらの段階は、チキン ハンバーグとハミルトン4 (HH) - 12-17 の段階に対応します。分離のプロシージャは、トリプシン酵素によって添付充から内胚葉を分離するに使用を開始しました。孤立した内胚葉は、E3 E3.5 (HH-ステージ 20 21) でホスト鶏 (c) 胚の somatopleura 領域に移植されました。この異種間充織は器官形成3にも貢献して胸腺上皮の開発に「寛容な」と考えられていた。その後、鶏ホスト血液媒介性前駆細胞の連続波はウズラ ドナー胸腺の上皮の相手はホスト胚3で胸腺形成に貢献することを浸透させた。

最近では、このアプローチの修正版は、胸腺形成5初期における上皮間葉相互作用を研究するために重要であることもわかった。この点で、キメラ胚3では異所性胸腺形成に関与する組織が分離、両方のドナーとホストの胚から・前のヴィヴォ関連付けられています。改良されたプロトコルは、ウズラ 3/4 pp 内胚葉 (E2.5 E3) および鶏 somatopleura 中胚葉 (E2.5 E3) を分離する使用されました。簡単に言えば、萌芽期ティッシュはマイクロサージャリーであり、体外パンクレアチン消化を分離した.また、組織型と発達段階 (表 1) によると、酵素の消化力、温度、培養時間の条件が最適化されました。

次に、隔離されたティッシュ関連していた、切片、48 時間培養システムで以前に報告された5,6として。体外組織協会は、生体内での操作のいくつかの制限を克服するための胚のローカルの細胞間相互作用を模倣します。このシステムは咽頭の装置の開発などの複雑な形態形成イベントで細胞間相互作用の研究に特に有用です。

胸腺の組織構築の各組織の貢献だけでなく、胸腺を生成する異種の協会の能力さらに探検使用カム方法論、以前詳細5,7,8をすることができます。簡潔に、培養組織は cE8 胚のカムに接ぎ木され 10 日間の卵の開発を許可しました。その後、胸腺形成は収穫の外植体における形態素解析によって評価しました。3古典的なウズラ鶏研究のようにウズラの胸腺上皮臓器開発9,10 に貢献する後で示されていたニワトリ胚由来造血前駆細胞 (HPCs) によって植民地だった.HPCs は胚から高度に血管カム5,7,8を通じて異所性キメラ胸腺に移行。ウズラ派生胸腺上皮特異的抗体 (すなわち、QCPN-MAb ウズラ核)、組織特異的分子マーカーの必要性を克服する免疫組織化学によって識別できます。

この実験前文書8で報告される 2 段階のアプローチとして、体外および ovo 開発において薬理学的エージェントの規則的な管理によって信号経路の変調をできます。また、植はもちろん実験8の任意の時点で収穫できます。

ここで詳細な分離のプロトコルは最後に、自然のプロパティの保存と萌芽期ティッシュの萌芽期の地域の場での遺伝子発現パターンをそれ以外の場合詳細設定に特に役立つの 3 D アーキテクチャによってアクセスできません。従来の方法。さらに、RNA シーケンスなどのマイクロ アレイ、トランスクリプトーム解析のアプローチは、組織固有の高スループット オミクス解析を提供しながら遺伝マーカーを必要とせず隔離されたティッシュの適用もできます。

プロトコル

これらすべての実験動物の世話やセントロ Académico ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・倫理的なガイドラインに従うリスボア。

1. 受精ウズラと鶏の卵孵化

  1. 場所は、3 日間 38 ° C の加湿インキュベーターでウズラ (について) の卵を受精しました。空気室の上向き卵 (卵の鈍い端) を孵化させなさい。
    注: 加湿環境インキュベーターの下に水のコンテナーを配置することによって実現されます。
  2. 38 ° C の加湿インキュベーターで 2.5 日間鶏 (ギャラス) の受精卵を孵化させなさい。水平位置で卵を孵化し、胚の場所を識別するために木炭の部分を使用して上側をマークします。
    注: は、この実験を確立するとき、40 のウズラの卵と鶏の卵を 60 開始します。

2 胚葉胸腺原基の将来のドメインの分離

注: は、無菌状態で水平層流フードと滅菌器具と卵操作手順のための材料を使用します。

  1. 3rdと 4thを含む咽頭アーチ領域として記述されている7,8(3/4PAR) のアーチ、胸腺原基の推定領域を含む萌芽期の領域を削除します。
    1. 60 ml の冷たいリン酸緩衝食塩液 (PBS) の大規模なホウケイ酸ガラスのボウル (100 mm × 50 mm; 100 cm3) を入力します。
    2. 曲線はさみの助けを借りて、タップ、3 日間の培養されて卵ウズラの殻に穴をあけます。卵の反対側に穴を鈍的に作り、冷 PBS にボウルに (胚) と卵黄を転送します。
    3. 曲線はさみを使用して余分な胚の血管を外部から卵黄膜を切断することによって、卵黄から胚を削除します。
    4. 細い鉗子の助けを借りて、小さなボウル (60 mm × 30 mm; 15 cm3) 転送胚は 10 mL の冷 PBS でいっぱい。
    5. スキマー、100 mm ブラック ベースでシャーレに胚を移動 (材料の表を参照してください) 10 mL の冷 PBS を含むと顕微鏡の下に置きます。
    6. 前述8として 3/4PAR を切り裂きます。
    7. 3/4PAR とガラス皿 4 分の 3 への転送は満ち冷 PBS 2 mL 滅菌パスツール ピペットを使用して吸引。
  2. パンクレアチン酵素消化によって胸腺原基 (3/4 pp 内胚葉) の推定領域を含む内胚葉を分離します。
    1. ヘラと細い鉗子の助けを借りて、ガラス皿 4 分の 3 への転送 3/4PAR は冷たいパンクレアチン (8 mg/mL; 25 mg/mL 冷 PBS での 1:3 希釈) でいっぱい。
    2. 酵素の消化力のための氷の上で 1 時間インキュベートします。
      注: 酵素消化時間 (表 1) の開発の段階によって異なります。
    3. 3/4PAR から内胚葉を分離する (40 x-60 x 倍率) 顕微鏡の下でガラスの皿を配置します。
      注意: すべてのサーフェスおよびソリューション冷たいこのプロシージャの間に。組織を解剖する長い時間を取る場合、新しい冷たいパンクレアチン ソリューションに変更 (> 15 分)。照明源として限られた熱負荷を考慮した、顕微鏡や光ファイバーを組み込んだ LED ライトを使用します。
    4. 周囲の組織から内胚葉を分離、剣山で 2 つのステンレス鋼の microscalpels を使用します。
      注: 0 mm から 1 mm の顎の開口径を 0.1 mm と 0.2 mm ニッケル ピン ホルダーの直径 microscalpels を使用します。
      1. 最初に神経管と咽頭内胚葉の背側表面に付着した中胚葉を削除します。
      2. 背側を上には、慎重にデタッチし咽頭のアーチの間充を削除し、咽頭のポーチを公開します。3/4PAR の両側には、この手順を実行します。
      3. 心臓の管と前部ポーチを取り巻く間充織を取り外します。
      4. 腹側、2ndと 3rd咽頭アーチの外胚葉をカットし、袋に接続されている間充織を慎重に取り外します。3/4PAR の反対側にこの手順を繰り返します。この段階では甲状腺原基が見えるはずです。
      5. 2 つの microscalpels と咽頭内胚葉に接続されている任意の残りの間葉系細胞を削除します。
      6. 2ndと 3rd PP、解離の 3rdと甲状腺原基と 2nd内胚葉の前方の部分から 4thポーチを含む咽頭内胚葉の間横のカットをします。咽頭嚢。
      7. ヘラと細い鉗子の助けを借りて、ガラス皿 4 分の 3 へ移転分離 3/4 pp 内胚葉は 100% 冷牛胎児血清 (FBS) でいっぱい。
  3. In vitro アッセイの準備の間に氷の上の隔離されたティッシュのガラス皿を保ちます。または、隔離されたティッシュを立体的に保存でき、遺伝子発現をその場で分析します。

3. 鶏 somatopleura 中胚葉の分離

メモ: 実行卵水平層流フードと滅菌器具と材料を使用して無菌状態で操作手順。

  1. 体節 19-24 (ss19-24) のレベルで somatopleura 中胚葉を含む萌芽期の領域を削除します。
    1. 2.5 日間の培養後、インキュベーターから鶏の卵を削除します。
    2. 曲線はさみでシェルで小さな穴を開けます。針を挿入し、卵の中のアルブミン量を下げ、(シェルのマークの領域の下にある) 胚の損傷を防ぐための 10 mL の注射器とアルブミンの 2 mL を吸引します。吸気のアルブミンを破棄します。
    3. 円形のカット (最大 3 分の 2 の上面の面積) を曲線はさみを使用してシェルのマークされた領域に穴します。
    4. 細い鉗子で胚を押しながら胚の血管を外部から卵黄膜をカットします。
    5. 、顕微鏡下で 10 mL の冷 PBS を含むブラック ベースで 100 mm ペトリ皿に胚を配置します。
      注: は、マイクロサージュリーの進歩的な倍率のためこの時点から顕微鏡を使用します。
    6. プレートの底に胎児を保持するために 4 つの薄い昆虫ピンを使用します。正方形の形状を形成する胚地域にピンを配置します。
    7. 19 と胚軸に横 24 体節時空警察ヴェッカーシグナ目はさみを使用して、すべての胚領域と交差している間 2 つのカットを実行します。
    8. 限界胚端を切断胚セクション, ss19-24 をリリースします。
    9. 吸引 ss19 24 組織、ガラス皿 4 分の 3 に転送冷 PBS 2 mL 滅菌パスツール ピペットを使用して満ちています。
  2. パンクレアチン (8 mg/mL; 25 mg/mL 冷 PBS での 1:3 希釈) とタンパク質分解酵素で somatopleura 地域 (ss19-24) から横中胚葉を分離します。
    1. ヘラと細い鉗子、転送の助けを借りてガラス ss19 24 組織の冷たい pancreatin 液でいっぱい 4 分の 3 を皿します。
    2. 酵素の消化力のための氷の上で 30 分間インキュベートします。
    3. 、実体顕微鏡下でホルダーに 2 つの microscalpels を使用して周囲の組織から中胚葉を分離します。
      注意: すべてのサーフェスおよびソリューション冷たいこのプロシージャの間に。組織を解剖する長い時間を取る場合、新しい冷たいパンクレアチン ソリューションに変更 (> 10 分。)。照明源として限られた熱負荷を考慮した、顕微鏡や光ファイバーを組み込んだ LED ライトを使用します。
    4. 中胚葉分離中に腹側に位置する splancnopleura 組織の慎重な剥離が続く界面外胚葉をまず削除します。
    5. 神経管を平行移動でそれを切断することによって somatopleura の右側側中胚葉のリリースです。
    6. 中胚葉分離胚の左側にあるを繰り返します。
      注: この手順中に microscalpel の動きを遅くを作る。露出した細胞外マトリックス蛋白質組織と流れるような動きを防止する楽器に固執します。
    7. ヘラと細い鉗子の助けを借りてガラス皿 4 分の 3 へ移転分離中胚葉は冷たい FBS でいっぱい。
  3. In vitro アッセイの準備の間に氷の上の隔離されたティッシュのガラス皿を保ちます。

4。In vitro における切片の試金: 異種 3/4 pp 胚葉と中胚葉鶏 somatopleura 協会

  1. 10 %fbs と 1% ペン/連鎖球菌3,5培 RPMI 1640 培養培地を準備します。
  2. 35 mm 5 ml の培地のシャーレに金属グリッドを配置します。
    注: グリッドの上部で培地表面を水平にする液体の過剰を削除します。
  3. 細い鉗子の助けを借りて、培地に膜フィルターを浸し、空気との接触の 1 つの表面を持つ grid の上にそれを置きます。
    注: (13 の mm の直径) と膜面積の四分の一は組織協会に適しています。
  4. 、実体顕微鏡下でメンブラン フィルター上に隔離されたティッシュを関連付けます。まず移植スプーン (またはヘラ) の助けを借りて穏やかなスライド ガラス皿から 3/4 pp 内胚葉 (手順 2) を転送し、薄い鉗子。分離中胚葉 (ステップ 3) のためには、この手順を繰り返します。
    注: microscalpel の助けを借りて、その協会を最大化するために組織をミックスします。
  5. 慎重に漿膜 (CAM) に 48 h. 培養組織を組み入れることができるため、5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターで関連組織を配置します。
    注: カムにおける異所性の器官形成は、以前詳細8だった。

結果

プロトコルは、いくつかの細胞および進化の生物学の技術的なアプローチで使用される鳥の萌芽期ティッシュを分離する方法を詳しく説明します。このメソッドは、胸腺形成5の初期段階の間に上皮間葉相互作用を研究する以前採用されました。ここで、図 1と図 2、同様のアプローチを使用して新しい結?...

ディスカッション

以下萌芽期ティッシュの隔離プロシージャは、異なる生物学的文脈3,5,6うずら鶏キメラ胚を作り出すための前の技術から改善されました。

この方法は、遺伝子操作や決定、遺伝子組み換え動物モデルの使用を制限することが多い、組織特異マーカーの使用を必要とせず純粋な萌芽期ティッシュの分離?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は原稿の批判的読解のイザベル Alcobia に感謝していますビデオ ナレーションの Mário エンリケスとセルバンテス ・ デ ・ Histologia e Biologia の組織サービスからビトー プロアは Desenvolvimento、Faculdade ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・ リスボアテクニカル サポートのためのパラナ ・ デ ・ リスボア。Faculdade ・ デ ・ Unidade ・ デ ・ audiovisuais (視聴覚ユニット) からサンパウロ Caeiro とヒューゴ ・ シルバに特にお世話になっておりますメディチーナ ・ デ ・ リスボア、このビデオの生産への顕著なコミットメントのパラナ ・ デ ・ リスボア。我々 は親切提供するビデオ システムと Interaves を装備した堅実ライカマイクロシス テムズ株式会社を認める - Sociedade 農業 Pecuária、ウズラに貢献してくれて S.A 受精卵。この作品は、Faculdade ・ デ ・によって支えられたメディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ de Lisboa (FMUL)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)Pintobar, PortugalPoultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)Interaves, PortugalBird farm 
15 mL PP centrifuge tubesCorning430052
50 mL PP centrifuge tubesCorning430290
60 x 20 mm pyrex dishesDuran group21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishesDuran group21 755 48
Metal gridGoodfellowsfine meshed  stainless steel grid
Membrane filterMilliporeDTTP013000.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)from supermarket 
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)from supermarket 
Transfer pipettesSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipetteNormax5426015
Clear plastic tapefrom supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
Fetal Bovine SerumInvitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
PancreatinSigma-AldrichP-3292Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-StreptomycinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN antibodyDevelopmental Studies Hybridoma BankQCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg KitELKEM/SilmidRH141001KGTo prepare the back base for petri dish
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-30 Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curvedFine Science Tools14085-08Curved scissors
Insect pins Fine Science Tools26001-300.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula Fine Science Tools10087-12Transplantation spoon
Minutien PinsFine Science Tools26002-200.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien PinsFine Science Tools26002-100.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12Nickel plated pin holder
Moria Perforated SpoonFine Science Tools10370-17Skimmer
Wecker Eye ScissorFine Science Tools15010-11
CameraLeica Microsystems MC170 HD
MicroscopeLeica Microsystems DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner Hamamatsu PhotonicsC13220-01
StereoscopeLeica Microsystems Leica M80

参考文献

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