배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

요약

이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.

초록

배아 조직 분리 용량 차례로 발달 생물학에서 공개 키 프로세스에 확실 한 공헌을 제공 했다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 설정 하기 위한 필수적인 단계를 했다.

여기는 메 추 라 기를 미세 및 그것의 생물 학적 속성을 유지 하면서 효소 소화에 의해 닭 배아 조직 분리 하는 최적화 된 방법 설명. 절연, 후 48 헤 메 추 라 기에 대 한 생체 외에서 organotypic 분석 결과에서 두 종에서 조직 관련 및 닭고기 조직 고유 핵 기능 및 분자 마커 사이 세포 잡담 연구를 수 있도록 하 여 차별 수 있습니다. heterospecific 협회 조직입니다. 이 접근은, 그러므로, 공부는 foregut의 형성과 pharyngeal morphogenesis 동안 발생 등 매우 역동적인 공간 수정, 개발 프로세스에 복잡 한 조직 상호 작용을 위한 유용한 도구 endoderm 파생 된 기관입니다. 이 실험적인 접근 thymus 형성의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용 연구를 처음 개발 되었다. 이, 미래의 thymic rudiment endoderm 파생 및 mesoderm 파생 mesenchyme는 각각 메 추 라 기 및 닭 배아에서 분리 했다.

용량의 관련된 조직 기관 생성 하는 더 닭 배아의 chorioallantoic 막 (CAM)에 접목 하 여 테스트할 수 있습니다. 캠은 영양분을 제공 하 고 explanted 조직에 가스 교류를 허용 한다. 비켜 개발에서의 10 일 후 공상 장기 기존의 형태학 방법으로 수확된 explants에 분석 수 있습니다. 이 절차 또한 수 있습니다 초기 개발 (생체 외에서 개발)에서 기관 형성 동안 조직 관련 기여를 공부 (비켜 개발)에서 organogenesis의 최종 단계에.

마지막으로, 향상 된 격리 방법 또한 제공 한다 3 차원으로 (3D) 보존 배아 조직, 조직 관련 유전자 발현 패턴의 고해상도 지형 분석에도 사용할 수 있습니다.

서문

1970 년대 초반에 우아한 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 르 Douarin, 새로운 수익원 개발^1,2중 세포 이동과 세포 상호 작용의 역할을 이해 하 여에 의해 개발 되었다. 모델 두 종 사이의 셀 교환 것 크게 embryogenesis, 나중에 긴장의 형성 하 고는 조 혈을 포함 하 여 수많은 발달 과정을 연구 하는 데 사용 하는 경우 확인을 방해 하지 않는 전제에서 고안 되었다 시스템¹. 예를 들어 후자 복용, 조 혈 창시자 thymic 상피 rudiment 식민지의 주기적 파도 처음 관찰 되었다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템³를 사용 하 여. Thymus, 세 번째 및 네 번째 pharyngeal 주머니 (3/4PP) endoderm의 미래의 영토 15-30 somite 단계 [배아 일 (전자) 1.5-E2.5]에서 기계적 및 효소 메 추 라 기 (q) 배아에서 분리 했다. 이러한 단계는 닭고기 햄버거와 해밀턴⁴ (HH)-단계 12 월 17 일에 해당합니다. 격리 절차 트립 신 효소 연결 된 mesenchyme에서 endoderm 해리를 사용 하 여 시작 했다. 격리 된 endoderm E3-E3.5 (HH-단계 20-21)에서 호스트 치킨 (c) 태아의 somatopleura 지역에 투입 했다. 이 분리 mesenchyme thymic 상피 개발 기관 형성³에 기여를 "허용"으로 간주 되었다. 그 후, 닭고기 호스트 혈액을 매개로 조상 세포의 물결이 침투 메 추 라 기 기증자 thymic 상피 대응 호스트 태아³thymus 형성에 기여.

최근에,이 접근의 수정된 된 버전의 초기 단계-thymus 형성⁵엽 상피 상호 작용을 공부에 대 한 중요 한 것 또한 입증 되었다. 이 점에서 공상 배아³ 에서 소성 thymus의 형성에 관련 된 조직 모두 기증자와 호스트 배아에서 분리 되었고 비보 전 관련. 메 추 라 기 3/4PP endoderm (E2.5-E3)와 치킨 somatopleura mesoderm (E2.5-E3)를 분리 하는 향상 된 프로토콜 사용 되었다. 간단히, 배아 조직 했다 생체 외에서 pancreatin 소화 및 미세 하 여 격리 된. 또한, 효소 소화 조건, 온도 시간 외피의 조직 유형 및 발달 단계 (표 1)에 따라 최적화 했다.

다음, 고립 된 조직 했다 관련 한 organotypic에서 48 h에 대 한 시험관 시스템에서 이전에 보고 된^5,6. 조직의 생체 외 협회 vivo에서 조작의 몇 가지 제한 사항이 극복 배아에서 지방 세포 상호 작용을 모방 합니다. 이 시스템은 특히 유용 인 두 장치 개발 등 복잡 한 morphogenic 이벤트에서 세포 상호 작용을 공부.

Thymus histogenesis 각 조직의 기여 뿐만 아니라 한 thymus를 생성 하는 heterospecific 협회의 능력 더 탐험을 사용 하 여 캠 방법론, 이전 자세한^5,,78일 수 있다. 간결, 교양된 조직 cE8 배아의 캠에 융합 되었고 10 일 비켜 개발 수 있습니다. 다음, thymus 형성 수확된 explants에서 형태소 분석에 의해 평가 되었다. 클래식 메 추 라 기-치킨 연구³, 메 추 라 기 thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (HPCs) 나중 장기 개발^{9,10 보여 줬던 닭 배아에서 파생 된에 의해 식민지 화 되었다} . HPCs 매우 vascularized 캠^5,,78소성 공상 thymus 태아에서 마이그레이션. 메 추 라 기 파생된 thymic 상피 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, QCPN-MAb 메 PeriNuclear), 조직 관련 분자 마커를 위한 필요를 극복을 사용 하 여 확인할 수 있습니다

이 실험 방법은 이전 간행물⁸, 보고 2 단계 접근 체 외 중 고 비켜 개발에 약리학 대리인의 일반 관리 여 신호 통로의 변조를 허용 합니다. 또한, explants 실험⁸과정의 어떤 시간 시점에서 수확 될 수 있습니다.

마지막으로, 여기 상세한 격리 프로토콜 수 자연 속성의 보존 및 배아 조직, 그렇지 않으면 배아 영토의 현장에서 유전자 발현 패턴을 자세하게 설명 하는 데 특히 유용의 3D 아키텍처에 의해 액세스할 수 전통적인 방법입니다. 또한, transcriptome 분석 접근, RNA-seq 또는 microarrays를 포함 하 여 적용할 수 있습니다 또한 고립 된 조직에서 조직 관련 높은 처리량 "omics" 분석을 제공 하면서 유전자 마커를 필요로 하지 않고.

프로토콜

이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.

1. 수정 된 메 추 라 기 그리고 닭 계란 외피

1. 장소는 3 일 동안 38 ° C 습도 인큐베이터에서 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)의 알을 수정 된. 공기 챔버에 향하도록 계란 (계란 무뚝뚝한 끝)를 품 어.
   참고: 습도 환경 인큐베이터의 밑에 물 컨테이너를 배치 하 여 이루어집니다.
2. 38 ° C 습도 인큐베이터에 2.5 일 동안 치킨 (갈 루스 갈 루스)의 수정 된 알을 품 어. 수평 위치에 알 품 어 고 상부 태아 위치를 식별할 수 숯불의 한 조각을 사용 하 여 표시 합니다.
   참고:이 실험을 설정할 때 40 메 추 라 기 계란과 60 닭고기 달걀으로 시작.

2. 격리의 메 추 라 기 endoderm thymic rudiment의 예비 도메인을 포함 하

참고: 메 마른 조건에서 수평 층 류 두건 및 멸 균된 악기와 계란 조작 절차에 대 한 자료를 사용 합니다.

1. Thymic rudiment의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역 제거, 3^층 및 4^회 를 포함 하는 인 두 아치 지역 설명된^7,8로 (3/4PAR), 아치.
   1. 큰 붕 규 산 유리 그릇 (100 x 50 mm, 100 cm³) 차가운 인산 염 버퍼 염 (PBS) 60 mL을 채우십시오.
   2. 곡선된가 위의 도움으로 누르고 잘라 원형 구멍을 메 추 라 기의 껍질에 계란을 3 일 동안 incubated 되었습니다. 무딘 계란의 반대 측에 있는 구멍을 확인 하 고 차가운 PBS와 그릇에 노 른 자 (태아)와 전송.
   3. 여분의 배아 선박 곡선된가 위를 사용 하 여 외부 vitelline 멤브레인을 절단 하 여 노 른 자에서 태아를 제거 합니다.
   4. 얇은 겸의 도움으로, 작은 사 발 (60 m m x 30 m m, 15 cm³) 배아 전송 차가운 PBS의 10 mL으로 가득합니다.
   5. 스키 머, 100 mm 페 트리 접시 블랙 기지와 태아 이동 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하 고 있는 stereomicroscope에서.
   6. 앞에서 설명한⁸3/4PAR를 해 부.
   7. Aspirate 3/4PAR 및 유리 접시 4 분의 3에 가득 찬 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.
2. Thymic rudiment (3/4PP endoderm)의 추정 영토를 포함 하는 pancreatin와 효소 소화에 의해 endoderm를 격리 합니다.
   1. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 3/4 3/4PAR 이동 찬 pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)으로 가득합니다.
   2. 효소 소화에 대 한 얼음에 1 시간에 품 어.
      참고: 소화 효소의 시간 개발 (표 1)의 무대의 따라 달라 집니다.
   3. 3/4PAR에서 endoderm을 stereomicroscope (40 x-60 배 확대)에서 유리 접시를 놓습니다.
      참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 15 분). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다.
   4. 주변 조직에서 endoderm를 격리 하려면 핀 홀더 2 개의 스테인레스 스틸 microscalpels 사용 하 여.
      참고: microscalpels를 사용 하 여 턱 오프닝 직경 1 m m 0 m m의 직경이 0.1 m m와 0.2 m m 니켈 핀 홀더 사이.
      1. 먼저 신경 튜브 및 mesoderm pharyngeal endoderm의 등 쪽 표면에 연결을 제거 합니다.
      2. 최대 지 면, 신중 하 게 분리 및 제거 인 두 아치 사이 mesenchyme 고 노출 인 두 파우치. 3/4PAR의 양쪽에서이 절차를 수행 합니다.
      3. 심장 관 및 mesenchyme 둘러싼 앞쪽 주머니를 제거 합니다.
      4. 복 부 쪽으로 2^차 및 3^rd 인 두 아치 ectoderm 잘라내어 mesenchyme는 파우치에 연결 된를 조심 스럽게 제거. 3/4PAR의 다른 측면에서이 절차를 반복 합니다. 이 단계에서 갑 상선 rudiment 표시 되어야 합니다.
      5. 두 개의 microscalpels와 인 두 endoderm에 연결 된 모든 나머지 중간 엽 세포를 제거 합니다.
      6. 2^차 및 3^rd 3^rd 및 갑 상선 rudiment 및 2^nd endoderm의 앞쪽 부분에서 4^번째 파우치 포함 하 인 두 endoderm 해리 PP 사이 횡단 컷 만들기 인 두 주머니입니다.
      7. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 전송 격리 3/4PP endoderm 유리 접시 4 분의 3에 100% 찬 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)으로 가득합니다.
3. 생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지. 또는 격리 된 조직을 3 차원으로 보존 될 수 하 고 현장에서 유전자 발현에 대 한 분석.

3입니다. 치킨 somatopleura mesoderm의 격리

참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.

1. Somites 19-24 (ss19-24)의 수준에서 somatopleura mesoderm 포함 된 배아 영토를 제거 합니다.
   1. 외피의 2.5 일 후 인큐베이터에서 닭 계란을 제거 합니다.
   2. 곡선가 위, 껍질에 작은 구멍을 엽니다. 바늘을 삽입 하 고 낮은 알 부 민 달걀 내부 볼륨 (포탄의 표시 영역 아래에 있는) 태아의 손상을 방지 하는 10 mL 주사기와 알 부의 2 개 mL를 발음. 발음된 알 부 민을 삭제 합니다.
   3. 컷 원형 곡선된가 위를 사용 하 여 셸 표시 된 지역에 (최대-3 분의 2는 상단 표면 영역)를 구멍.
   4. 잘라 vitelline 막 외부 extraembryonic 배 얇은 집게로 태아를 잡고 있는 동안.
   5. Stereomicroscope에서 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 태아 100 mm 페 트리 접시에에서 놓습니다.
      참고:이 시점에서 stereomicroscope를 사용 하 여 미세 절차의 점진적 확대에 대 한.
   6. 접시의 바닥에는 배아를 4 개의 얇은 곤충 핀을 사용 합니다. 사각형 모양을 형성 하는 extraembryonic 지역에 핀을 배치 합니다.
   7. 19와 24 transversely 배아 축 somites wecker 눈이 위를 사용 하 여 모든 배아 영토를 건너 사이 두 컷을 수행 합니다.
   8. 한계 배아 가장자리 절단 ss19-24, 배아 섹션을 놓습니다.
   9. Aspirate ss19 24 조직 및 유리 접시 4 분의 3에 차가운 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 채워집니다.
2. Pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)와 효소 소화에 의해 somatopleura 지역 (ss19-24)에서 측면 mesoderm를 격리 합니다.
   1. 주걱과 얇은 집게, 전송의 도움으로 유리 ss19 24 조직 접시 가득 찬 pancreatin 솔루션으로 3/4.
   2. 효소 소화에 대 한 얼음에 30 분 동안 품 어.
   3. Stereomicroscope, 아래에 홀더 2 개의 microscalpels를 사용 하 여 주변 조직에서 mesoderm을 격리 합니다.
      참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 10 분.). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다.
   4. Mesoderm 격리 하는 동안 먼저 ectoderm ventrally 위치 splancnopleura 조직의 주의 초연 뒤 표면에서 제거 합니다.
   5. 릴리즈 신경 튜브를 병렬 동작에서 절단 하 여 somatopleura의 오른쪽 측면 mesoderm.
   6. 태아의 왼쪽의 mesoderm 분리를 반복 합니다.
      참고:이 절차 동안 microscalpel의 움직임을 느리게 합니다. 노출 된 엑스트라 세포 매트릭스 단백질 조직 및 유체 움직임을 방지 하는 악기에 충실.
   7. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 4 분의 3에 전송 격리 mesoderm 차가운 FBS 가득합니다.
3. 생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지.

4입니다. 생체 외에서 organotypic 분석 결과: 메 추 라 기 3/4PP endoderm와 치킨 somatopleura mesoderm heterospecific 협회

1. 10 %FBS 1% 펜/Strep^3,5보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.
2. 35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL에에서 금속 그리드를 배치 합니다.
   참고: 격자의 상단 중간 표면을 액체의 과잉을 제거 합니다.
3. 얇은 포 셉의 도움으로 멤브레인 필터 문화 매체에와 공기와 접촉 한 표면에 그리드 위에 배치.
   참고: 1/4의 막 (13 m m 직경) 조직 협회에 대 한 적절 한입니다.
4. Stereomicroscope에서 멤브레인 필터 위에 고립 된 조직에 연결. 먼저 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩 유리 접시에서 3/4PP endoderm (2 단계)을 전송 하 고 얇은 집게. 격리 된 mesoderm (3 단계)에 대 한이 절차를 반복 합니다.
   참고:는 microscalpel의 도움으로의 그것의 협회를 극대화 하기 위해 조직 믹스.
5. 48 h. 교양된 조직 chorioallantoic 막 (CAM)에 투입 될 수에 대 한 신중 하 게 5% CO₂ 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 관련된 조직 배치 합니다.
   참고: 카메라에 소성 기관 형성 이전 자세한⁸이었다.

결과

프로토콜에는 여러 세포 및 개발 생물학 기술 접근에 사용 되는 조류 배아 조직 분리 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 이 방법은 이전 thymus 형성⁵의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용을 공부 고용 되었다. 여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2, 비슷한 방법을 사용 하 여 표시 됩니다.

토론

여기 상세한 배아 조직 격리 절차는 다른 생물학 문맥^3,,56에 메 추 라 기-닭고기 공상 배아를 생산 하는 이전 기술에서 개선 되었다.

이 방식은 유전자 조작 이나 결정, 유전자 변형된 동물 모델의 사용을 제한 하지는 조직의 특정 마커를 사용 하 여 필요 없이 순수 배아 조직 분리에 적합 합니다. 그것은 능?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		Poultry farm
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP centrifuge tubes	Corning	430052
50 mL PP centrifuge tubes	Corning	430290
60 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 48
Metal grid	Goodfellows		fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)			from supermarket
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)			from supermarket
Transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette	Normax	5426015
Clear plastic tape			from supermarket
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit	ELKEM/Silmid	RH141001KG	To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08	Curved scissors
Insect pins	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula	Fine Science Tools	10087-12	Transplantation spoon
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
Camera	Leica Microsystems	MC170 HD
Microscope	Leica Microsystems	DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner	Hamamatsu Photonics	C13220-01
Stereoscope	Leica Microsystems	Leica M80