Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Resumen

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Resumen

Los orgánulos celulares, como las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER), crean una red para realizar una variedad de funciones. Estas estructuras altamente curvadas se pliegan en varias formas para formar una red dinámica dependiendo de las condiciones celulares. La visualización de esta red entre las mitocondrias y la sala de res ha intentado utilizar imágenes de fluorescencia de superresolución y microscopía de luz; sin embargo, la resolución limitada es insuficiente para observar las membranas entre las mitocondrias y urgencia en detalle. La microscopía electrónica de transmisión proporciona un buen contraste de membrana y resolución a escala de nanómetros para la observación de orgánulos celulares; sin embargo, es excepcionalmente lento al evaluar la estructura tridimensional (3D) de los orgánulos altamente curvados. Por lo tanto, observamos la morfología de las mitocondrias y la ER a través de la microscopía electrónica de luz correlativa (CLEM) y las técnicas de microscopía electrónica de volumen utilizando ascorbato peroxidasa 2 mejorado y tinción de peroxidasa de rábano picante. Se aplicó un método de tinción en bloque, seccionamiento en serie ultrafino (tomografía de matriz) y microscopía electrónica de volumen para observar la estructura 3D. En este protocolo, sugerimos una combinación de clem y microscopía electrónica 3D para realizar estudios estructurales detallados de las mitocondrias y la ER.

Introducción

Las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER) son orgánulos celulares ligados a la membrana. Su conexión es necesaria para su función, y las proteínas relacionadas con su red han sido descritas¹. La distancia entre las mitocondrias y la ER se ha notificado en aproximadamente 100 nm utilizando la microscopía de luz²; sin embargo, los recientes estudios de microscopía³ de superresolución y microscopía electrónica (EM)⁴ han revelado que es considerablemente más pequeño, de aproximadamente 10-25 nm. La resolución alcanzada en la microscopía de superresolución es inferior a EM, y el etiquetado específico es necesario. EM es una técnica adecuada para lograr un contraste de alta resolución suficiente para estudios estructurales de las conexiones entre las mitocondrias y la ER. Sin embargo, una desventaja es la información limitada del eje z porque las secciones delgadas deben ser aproximadamente 60 nm o más delgadas para la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM). Para obtener suficientes imágenes del eje z EM, se puede utilizar microscopía electrónica tridimensional (3DEM)⁵. Sin embargo, esto implica la preparación de cientos de secciones seriales delgadas de células enteras, que es un trabajo muy complicado que sólo unos pocos tecnólogos calificados han dominado. Estas secciones delgadas se recogen en rejillas TEM de un solo orificio recubiertas con película de formvar frágiles. Si la película se rompe en una faja, la toma de imágenes en serie y la reconstrucción del volumen no son posibles. La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es una técnica popular para 3DEM que utiliza seccionamiento destructivo en bloque dentro de la cámara de vacío del microscopio electrónico de barrido (SEM) con un cuchillo de diamante (Dik-SBEM) o un haz de iones enfocado (FIB-SEM) ⁶. Sin embargo, debido a que esas técnicas no están disponibles en todas las instalaciones, sugerimos la tomografía de matriz⁷ utilizando seccionamiento en serie y SEM. En la tomografía de matriz, las secciones en serie cortadas con un ultramicrotomo se transfieren aun cubreobjetos de vidrio en lugar de a una rejilla TEM y se visualizan mediante microscopía de luz y SEM 8. Para mejorar la señal para la toma de imágenes de electrones de retrodispersión (EEB), utilizamosun protocolo de tinción EM en bloque que emplea células fijas de tetróxido de osmio (OsO 4) con tiocarbohidrazida osmiofílica (TCH)^9,lo que nos permite obtener imágenes sin post-incorporación de doble tinción.

Además, se utilizó el marcador mitocondrial SCO1 (proteína de ensamblaje del citocromo c oxidasa 1)– ascorbato peroxidasa 2 (APEX2)¹⁰ etiqueta molecular para visualizar las mitocondrias a nivel EM. APEX2 es aproximadamente 28 kDa y se deriva de la soja ascorbato peroxidasa¹¹. Fue desarrollado para mostrar la ubicación detallada de proteínas específicas a nivel EM de la misma manera que la proteína etiquetada con proteína fluorescente verde se utiliza en la microscopía ligera. APEX2 convierte 3,3' -diaminobenzidina (DAB) en un polímero osmiofílico insoluble en el sitio de la etiqueta en presencia del peróxido de hidrógeno cofactor (H₂O₂). APEX2 se puede utilizar como una alternativa al etiquetado tradicional de anticuerpos en EM, con una localización de proteínas a lo largo de toda la célula. En otras palabras, la proteína etiquetada APEX2 se puede visualizar mediante la osmicación específica¹¹ sin etiquetado de inmunooro y permeabilización después de la ultracriosección. La peroxidasa de rábano picante (HRP) es también una etiqueta sensible que cataliza la polimerización dependiente H₂O₂de DAB en un precipitado localizado, proporcionando contraste EM después del tratamiento con OsO_4. La secuencia de péptidos objetivo de ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² se aplicó para visualizar ER dentro de una célula entera. Para evaluar nuestro protocolo de utilización de etiquetas genéticas y tinción en bloque con osmio reducido y TCH (método rOTO), utilizando el efecto de osmication al mismo tiempo, comparamos el contraste de membrana con y sin el uso de cada etiqueta genética en la tinción rOTO en bloc. Aunque 3DEM con tomografía de matriz y tinción DAB con APEX y HRP se han utilizado, respectivamente, para otros fines, nuestro protocolo es único porque hemos combinado la tomografía de matriz para tinción 3DEM y DAB para mitocondrias y etiquetado ER. Específicamente, mostramos cinco células con y sin genes etiquetados con APEX en la misma sección, lo que ayudó a investigar el efecto de la modificación genética en las células.

Protocolo

1. Cultivo celular con plato de cultivo de rejilla estampado y transfección celular con vector de plásmido SCO1-APEX2 y HRP-KDEL

1. Semilla 1 x 10⁵ HEK293T células colocándolas en platos de cultivo con fondo de rejilla de vidrio de 35 mm en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO₂ a 37 oC en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco complementado con suero bovino fetal 10%, 100 U/ml penicilina y 100 U/ml de estreptomicina.
2. Al día siguiente de la sembración de las células, cuando han crecido a 50%-60% de confluencia, introducir el Plásmido SCO1-APEX2¹⁰ y HRP-KDEL¹² a las células utilizando reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 g + ADN plásmido HRP-KDEL 0,5 g por reactivo de transfección de 3 l).

2. Microscopía ligera de células que crecen en platos de cultivo estampados y tinción DAB para APEX2 y HRP

1. A 16-24 h después de la transfección, retire todos los medios de cultivo y agregue inmediatamente 250 éL de solución de fijación caliente (30-37 oC) (Tabla1) mediante pipeteo suave. Retire inmediatamente la solución de fijación y reemplácela por 1,5 ml de solución de fijación fresca. Incubar sobre hielo durante 60 minutos, y luego lavar tres veces durante 10 minutos cada una en 1 ml de tampón de cacodilato sódico de 0,1 M de hielo (Tabla 1).
   ADVERTENCIA: Los humos de aldehuroson son extremadamente tóxicos. Realice todo el trabajo bajo una campana de humo ventilada.
2. Añadir 1 ml de solución de glicina fría (0-4 oC) 20 mM e incubar durante 10 min sobre hielo seguido de tres lavados de 5 min cada uno en 1 ml de tampón frío de cacolido sódico de 0,1 M.
3. Preparar una solución DAB fresca de 1x (3,33 ml de solución de cacodilato de 0,3 M + 10 ml de 30% H₂O₂ + 5,67 ml de agua fría + 1 ml 10x solución DAB).
4. Añadir 500 l de la solución DAB 1x recién preparada (paso 2.3) e incubar sobre hielo durante aproximadamente 5-45 min hasta que una mancha marrón claro sea visible bajo un microscopio de luz invertida (Figura1A).
5. Retire suavemente la solución DAB y enjuague tres veces con 1 ml de tampón de cacodilato sódico frío de 0,1 M durante 10 minutos cada uno.
6. Utilice un microscopio invertido de contraste de fase (o un microscopio de luz de campo brillante) para visualizar la tinción DAB con un aumento de 100x o superior. Utilice un rotulador para marcar la parte inferior del cristal donde se encuentra la región de interés (ROI) (Figura1B,C).

3. Preparación de muestras para el bloque EM

1. Realice el cultivo celular y la tinción DAB como se describe en los pasos 2.1-2.6.
2. Post-fijar las muestras con 1 mL de 2% de OsO reducido₄ durante 1 h a 4 oC.
   ADVERTENCIA: Los humos OsO₄ son altamente tóxicos. Realice todo el trabajo bajo una campana de humo ventilada.
3. Prepare una nueva solución de TCH (Tabla1) durante el paso 3.2 y pase a través de un filtro de 0,22 m.
   ADVERTENCIA: Los humos TCH son altamente tóxicos. Realice todo el trabajo bajo una campana de humo ventilada.
4. Retire el fijador y enjuague tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente (RT).
5. Coloque las celdas en 1 ml de solución TCH previamente preparada y filtrada durante 20 minutos a RT.
6. Enjuague las células tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada una a RT.
7. Exponer las células por segunda vez a 1 ml de tetróxido de osmio al 2% en agua destilada durante 30 minutos a RT.
8. Retirar el fijador y enjuagar tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada uno en RT. Añadir 1 ml de acetato de ursilo al 1% (acuoso), y dejar pasar la noche a 4 oC en la oscuridad.
9. Lavar las células tres veces en 1 ml de agua destilada durante 5 minutos cada una a RT.
10. Precalentar la solución de aspartato de plomo de Walton (Tabla1) en un horno a 60 oC durante 30 min.
11. Manchar las células con la solución de aspartato de plomo de Walton agregando 1 ml de la solución de aspartato de plomo precalentada, y luego colocar en un horno durante 30 minutos a 60 oC.
12. Enjuague las células tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada una a RT.
13. Incubar en una serie calificada de alícuotas de etanol de 2 ml (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) durante 20 minutos cada uno en RT.
14. Decantar el etanol e incubar durante 30 min en 1 ml de etanol 3:1:bajo caudal de viscosidad a RT.
15. Retire el medio y agregue 1 ml de etanol 1:1: medio de mezcla de incrustación de baja viscosidad. Incubar durante 30 min a RT.
16. Retire el medio y agregue 1 ml de etanol 1:3: medio de mezcla de incrustación de baja viscosidad. Incubar durante 30 min a RT.
17. Retire el medio y agregue 1 ml de medio de incrustación 100% de baja viscosidad e incubar durante la noche.
18. Incruste la muestra en una mezcla de incrustación 100% de baja viscosidad e incubar durante 24 h a 60 oC.
19. Prepare secciones gruesas de 90 nm con un ultramicrotome.
20. Observe la rejilla bajo TEM a 200 kV.

4. Seccionamiento y montaje en serie en cubiertas recubiertas de óxido de indio-tin para imágenes SEM

1. Preparación del sustrato
   1. Limpie los revestimientos de vidrio recubiertos de indio-tin-óxido (ITO) (22 mm x 22 mm) mediante agitación suave en isopropanol durante 30-60 s.
   2. Retire los labios de las cubiertas, drene el exceso de isopropanol y deje en un ambiente libre de polvo hasta que se seque.
   3. Trate los revestimientos de vidrio recubiertos con ITO por descarga de resplandor utilizando una recubridora de plasma durante 1 min.
      NOTA: La activación del plasma confiere una propiedad hidrófila a la superficie del sustrato. Crea una película de agua muy delgada en el sustrato para evitar la formación de arrugas en las secciones cuando la sección está unida al sustrato.
   4. Inserte las cubiertas de vidrio recubiertas de ITO en el soporte del sustrato y colóquelas en el bote de cuchillos.
2. Recorte del bloque de muestra y seccionamiento en serie
   1. Inserte el bloque de muestra en el soporte de muestra del ultramicrotoma y establézcalo en el bloque de recorte.
   2. Utilice una cuchilla de afeitar para recortar todo el exceso de resina alrededor de la posición objetivo (identificada en el paso 2.6, Figura 1D-G). La forma de la cara del bloque debe ser trapezoidal o rectangular. El borde delantero y el borde final deben ser absolutamente paralelos (Figura1H,I).
   3. Inserte el soporte de muestra en el brazo del ultramicrotoma y coloque el cuchillo de diamante en el portacuchillas. Inserte los cubreobjetos de vidrio ITO en el soporte de cinta y sujete el soporte con el mango (Figura 1J). Ponga el portacintas en el barco de la cuchilla y llene el barco con agua destilada filtrada (Figura1K).
   4. Ajuste la posición del soporte con la corredera del cuchillo empujando cuidadosamente el mango del soporte para ajustar el borde del cristal ITO cerca del cuchillo (Figura1L).
   5. Después de cortar la sección, detenga el proceso de corte y abra lentamente el tornillo de sujeción del tubo y drene el bote de agua (tasa de flujo de una gota de agua por segundo).
   6. Después de completar el proceso de recogida de cintas, retire el sustrato con el mango del dispositivo de sujeción y seque la cinta (Figura1M).

5. Imágenes en el SEM y alineación de la pila de imágenes SEM

1. Monte el cubreobjetos recubierto de ITO en talones de aluminio con cinta adhesiva de carbono. Sellar la superficie de vidrio y la superficie en el talón con cinta adhesiva de carbono, y luego cubrir con una capa de carbono de 10 nm de espesor (Figura1N).
2. Observe el cubreobjetos recubierto con ITO en una emisión de campo SEM a una baja tensión de aceleración de 5 kV y una distancia de trabajo adecuada para la recogida eficiente de BSe.
3. Importe las imágenes serie al software Image J (Fiji)¹³ utilizando la opción de pila virtual. Abra un nuevo TrakEM¹⁴e importe la pila de imágenes en TrakEM. Haga clic con el botón derecho del ratón y elija el menú de alineación.
4. A continuación, seleccione el rango de imágenes (desde la primera imagen hasta la última imagen). Finalice la alineación automática, guarde el dataset alineado y elija exportar para compilar una imagen plana desde el rango de imágenes seleccionado (desde la primera imagen hasta la última imagen). Por último, guarde los datos de imagen plana en formato AVI en el menú principal imagen J.
   NOTA: La película suplementaria 1 y la película suplementaria 2 muestran la pila de imágenes SEM y la pila de imágenes recortadas, respectivamente.

6. Segmentación de mitocondrias y urgencias a partir de imágenes en serie

1. Inicie el 3dmod en el software IMOD¹⁵ y abra los archivos de imagen.
2. En la ventana de ZaP, dibuje el contorno de las mitocondrias y ER usando el botón central del ratón.
3. Para visualizar el volumen segmentado, abra la ventana Vista modelo (Película suplementaria 3).

Resultados

La figura 1 describe la programación y el flujo de trabajo de este protocolo. El protocolo requiere 7 días; sin embargo, dependiendo del tiempo dedicado a la toma de imágenes SEM, esto puede aumentar. Para la transfección celular, la confluencia de las celdas debe controlarse para no cubrir la parte inferior de toda la placa de rejilla (Figura1A). Una alta densidad celular podría impedir la identificación de la célula de interés durante el microscopio de luz y la observación EM....

Discusión

Determinar la localización celular de proteínas específicas a una resolución de nanómetro utilizando EM es crucial para entender las funciones celulares de las proteínas. Generalmente, hay dos técnicas para estudiar la localización de una proteína diana a través de EM. Una es la técnica de inmunooro, que se ha utilizado en EM desde 1960, y la otra es una técnica que utiliza etiquetas genéticamente codificadas^{recientemente 16.} Las técnicas tradicionales de inmunooro han empleado part?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga