АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для изучения распределения митохондрий и эндоплазмической ретикулум в целых клетках после генетической модификации с использованием корреляционного света и объема электронной микроскопии, включая аскорбат омоксидазы 2 и преносида хрена окисления, серийное сечение клеток с геном-мишенью и без нее в том же разделе, а также серийное изображение с помощью электронной микроскопии.

Аннотация

Сотовые органеллы, такие как митохондрии и эндоплазмический ретикулум (ER), создают сеть для выполнения различных функций. Эти высоко изогнутые структуры складываются в различные формы, чтобы сформировать динамическую сеть в зависимости от клеточных условий. Визуализация этой сети между митохондриями и ER была предпринята с помощью сверхразрешения флуоресценции и световой микроскопии; однако, ограниченное разрешение недостаточно для того чтобы наблюдать мембраны между митохондриями и ER в деталях. Электронная микроскопия передачи обеспечивает хороший мембранный контраст и разрешение нанометрового масштаба для наблюдения клеточных органелл; однако при оценке трехмерной (3D) структуры высокоизосведой органелл занимает исключительно много времени. Поэтому мы наблюдали морфологию митохондрий и ER с помощью корреляционной светоэлектронной микроскопии (CLEM) и методов микроскопии объемной электронной микроскопии с использованием улучшенной аскорбатной перекоксидазы 2 и окисления перекисания хрена. Для наблюдения за трехмерной структурой применялись методок окрашивания, ультратонкий серийный сечение (массивная томография) и объемная электронная микроскопия. В этом протоколе мы предлагаем сочетание CLEM и 3D электронной микроскопии для проведения детальных структурных исследований митохондрий и ER.

Введение

Митохондрии и эндоплазмический ретикулум (ER) являются мембранными клеточными органеллами. Их связь необходима для их функции, и белки, связанные с их сетью, были описаны1. Расстояние между митохондриями и ER было сообщено как приблизительно 100 nm используя световую микроскопию2; однако, недавние супер-разрешение микроскопии3 и электронной микроскопии (EM)4 исследования показали, что он будет значительно меньше, примерно на 10-25 нм. Разрешение, достигнутое в микроскопии супер-разрешения ниже, чем EM, и требуется специальная маркировка. EM является подходящим методом для достижения достаточно высокого разрешения контраста для структурных исследований связей между митохондриями и ER. Однако недостатком является ограниченная информация z-оси, поскольку тонкие секции должны быть примерно на 60 нм или тоньше для обычной электронной микроскопии передачи (TEM). Для достаточного изображения EM z-оси можно использовать трехмерную электронную микроскопию (3DEM). Однако это предполагает подготовку сотен тонких серийных секций целых клеток, что очень сложно сделать, что освоили лишь немногие опытные технологи. Эти тонкие секции собраны на хрупких formvar пленки покрытием одноотверстие TEM сетки. Если пленка ломается на одном поясе, серийная визуализация и реконструкция громкости невозможны. Серийный блок-лицо сканирования электронной микроскопии (SBEM) является популярным методом для 3DEM, который использует разрушительные en блок секции внутри сканирующего электронного микроскопа (SEM) вакуумной камеры либо с алмазным ножом (Dik-SBEM) или целенаправленной ионный луч (FIB-SEM) 6. Однако, поскольку эти методы не доступны на всех объектах, мы предлагаем массив томографии7 с использованием последовательного секции и SEM. В массивной томографии серийные секции, вырезанные с помощью ультрамикротома, переносятся на стеклянный покрывало вместо сетки TEM и визуализируются с помощью световой микроскопии и SEM8. Для повышения сигнала для backscatter электрона (BSE) изображения, мы использовали ан блок EM окрашивания протокола с использованием осмия тетрокида (OsO4) фиксированные клетки с osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH)9, что позволяет нам получать изображения без после встраивания двойное окрашивание.

Кроме того, митохондриальный маркер SCO1 (цитохром c окислидаса сборки белка 1) - аскорбат переоксидазы 2 (APEX2)10 молекулярный тег был использован для визуализации митохондрий на уровне ЭМ. APEX2 составляет около 28 kDa и является производным от сои аскорбат перекиснидаза11. Он был разработан, чтобы показать подробное расположение конкретных белков на уровне EM таким же образом, что зеленый флуоресцентный белок помечены белка используется в световой микроскопии. APEX2 преобразует 3,3' -диаминобензидин (DAB) в нерастворимый осмиофильный полимер в месте тега в присутствии кофакторного перекиси водорода (H2O2). APEX2 может быть использован в качестве альтернативы традиционной маркировки антител в EM, с локализацией белка на всей глубине всей клетки. Другими словами, белок с маркировкой APEX2 может быть визуализирован специфическим осмицией11 без маркировки иммуногольдов и пермяки после ультракриосекции. Хрендиш пероксидаза (HRP) также чувствительный тег, который катализирует H2O 2-зависимых полимеризации DAB в локализованный осадок, обеспечивая EM контраст после лечения с OsO4. ER целевой пептид последовательности HRP-KDEL (лис-асп-глу-лей)12 был применен для визуализации ER в рамках всей клетки. Для оценки нашего протокола использования генетических тегов и окрашивания ан блока с уменьшенным осмием и TCH (метод ROTO), используя эффект осмии в то же время, мы сравнили мембранный контраст с и без использования каждой генетической метки в rOTO ан блок окрашивания. Хотя 3DEM с массивом томографии и DAB окрашивания с APEX и HRP, соответственно, были использованы для других целей, наш протокол уникален, потому что мы объединили массив томографии для 3DEM и DAB окрашивания для митохондрий и ER маркировки. В частности, мы показали пять клеток с и без APEX помечены генов в том же разделе, который помогал в исследовании влияния генетической модификации на клетки.

протокол

1. Клеточная культура с узорчатой сеткой культуры блюдо и клеточной трансфекции с SCO1-APEX2 и HRP-KDEL плазмидный вектор

  1. Семена 1 х 105 HEK293T клетки, поместив их в 35-мм стеклянной сетки дном культуры блюда в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2 при 37 КС в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнен 10% плода крупной сыворотки, 100 U/mL пенициллин и 100 U/mL стрептомицин.
  2. На следующий день после посева клеток, когда они выросли до 50%-60% confluency, ввести SCO1-APEX210 и HRP-KDEL12 плазмид в клетки с помощью трансфекционного реагента в соответствии с инструкциями производителя (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 мкг HrP-KDEL плазмид ДНК 0,5 мкг на 3 Л трансфекционного реагента).

2. Легкая микроскопия клеток, растущих на узорчатых культурных блюдах и DAB окрашивания для APEX2 и HRP

  1. При 16-24 ч после трансфекции удалите все культурно-носители и немедленно добавьте 250 кл теплого (30-37 градусов по Цельсию) раствор фиксации(Таблица 1) путем нежного пипетки. Немедленно снимите раствор фиксации и замените его 1,5 мл свежего раствора фиксации. Инкубировать на льду в течение 60 мин, а затем мыть три раза в течение 10 минут каждый в 1 мл ледяной 0,1 М буфер акодилат натрия(таблица 1).
    ВНИМАНИЕ: Пары альдегида чрезвычайно токсичны. Выполните все работы под вентилируемым дымом капот.
  2. Добавьте 1 мл холодного (0-4 градусов) 20 мм глицина раствор и инкубировать в течение 10 минут на льду, а затем три стирок по 5 мин каждый в 1 мл холодного 0,1 М буфера какокилата натрия.
  3. Приготовьте свежий раствор 1x DAB (3,33 мл из 0,3 м какокилатного раствора, 10 л 30% Н2O2 5,67 мл холодной воды, 1 мл 10x DAB раствор).
  4. Добавьте 500 зл и свежеприготовленный раствор 1x DAB (шаг 2.3) и инкубируют на льду в течение примерно 5-45 мин до тех пор, пока под перевернутым световым микроскопом не будет видно светло-коричневого пятна(рисунок 1А).
  5. Аккуратно удалите раствор DAB и промыть три раза с 1 мл холодного 0,1 М буфера какодилат натрия в течение 10 минут каждый.
  6. Используйте фазовый контрастный перевернутый микроскоп (или световой микроскоп яркого поля) для визуализации окрашивания DAB при увеличении в 100 раз или выше. Используйте маркерпер, чтобы отметить дно стекла, где находится область интереса (ROI)(рисунок 1B,C).

3. Подготовка образца для блока EM

  1. Выполните клеточную культуру и окрашивание DAB, как описано в шагах 2.1-2.6.
  2. Пост-фиксировать образцы с 1 мл 2% снижение OsO4 для 1 ч при 4 c.
    ВНИМАНИЕ: OsO4 паров являются высокотоксичными. Выполните все работы под вентилируемым дымом капот.
  3. Подготовьте новое решение TCH(таблица 1) во время шага 3.2 и пройдите через фильтр 0.22-мкм.
    ВНИМАНИЕ: Пары TCH являются высокотоксичными. Выполните все работы под вентилируемым дымом капот.
  4. Удалить фиксатор и промыть три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый при комнатной температуре (RT).
  5. Поместите клетки в 1 мл ранее подготовленного и отфильтрованного раствора TCH в течение 20 минут на RT.
  6. Промыть клетки три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT.
  7. Выставить клетки во второй раз до 1 мл 2% тетроксида осмия в дистиллированной воде в течение 30 минут на РТ.
  8. Удалить фиксатор и промыть три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT. Добавить 1 мл 1% уранил ацетат (aqueous), и оставить на ночь при 4 градусах По Цельсию в темноте.
  9. Вымойте клетки три раза в 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT.
  10. Предварительно разогреваемом уидяшном растворе Уолтона(Таблица 1) в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
  11. Пятно клеток с Уолтон свинца аспартат решение, добавив 1 мл предварительно подогретого свинца аспартат аспартат аспартат азатем, а затем поместить в духовку на 30 мин при 60 градусов по Цельсию.
  12. Промыть клетки три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT.
  13. Инкубировать в градуированных сериях 2-мл этанола aliquots (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) в течение 20 минут каждый на RT.
  14. Декант этанола и инкубировать в течение 30 мин в 1 мл 3:1 этанол: низкая вязкость встраивания смеси среды на RT.
  15. Удалить среду и добавить 1 мл 1:1 этанола: низкая вязкость встраивания смеси среды. Инкубировать в течение 30 минут на RT.
  16. Удалите среду и добавьте 1 мл 1:3 этанола: низковязкая встраивающая смесь среды. Инкубировать в течение 30 минут на RT.
  17. Удалите среду и добавьте 1 мл 100% низкой вязкости встраивания среды и инкубировать на ночь.
  18. Встраивайте образец в 100% низковязкую встраивающую смесь и инкубировать 24 ч при 60 градусах Цельсия.
  19. Подготовка 90-нм толщиной разделов с помощью ультрамикротома.
  20. Наблюдайте за сеткой под TEM на 200 кВ.

4. Серийное секционирование и монтаж на обшивки с покрытием с покрытием для SEM

  1. Субстратная подготовка
    1. Чистый индиум-оловен-оксид (ITO) покрытием крышки (22 мм х 22 мм) нежным возбуждением в изопропанола для 30-60 с.
    2. Удалите крышки, слейте лишний изопропанол и оставьте в безпылящей среде до высыхания.
    3. Лечить ITO покрытием стеклянные крышки свечение разряда с помощью плазмы пальто в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазма активации наделяет гидрофильных свойств о поверхности субстрата. Это создает очень тонкую пленку воды на субстрате, чтобы предотвратить образование морщин в разделах, когда секция прикреплена к субстрату.
    4. Вставьте стекло с покрытием ITO в держатель подсубстрата и поместите в лодку с ножом.
  2. Обрезка блока образца и последовательное секции
    1. Вставьте блок образца в держатель образца ультрамикротома и установите в блок обрезки.
    2. Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать все излишки мишени вокруг целевого положения (определено в шаге 2.6, Рисунок 1D-G). Форма блочной грань должна быть трапециевидной или прямоугольной. Передний край и задний край должны быть абсолютно параллельными(Рисунок 1H,I).
    3. Вставьте держатель образца на руку ультрамикротома и поместите алмазный нож в держатель ножа. Вставьте стекло ITO крышки в ленту перевозчика и зажим перевозчика с ручкой(Рисунок 1J). Установите ленту перевозчика в нож лодки и заполнить нож лодки с фильтрованной дистиллированной воды(рисунок 1K).
    4. Отрегулируйте положение носителя с слайдом ножа, осторожно нажав на ручку держателя, чтобы установить край стекла ITO близко к ноже(Рисунок 1L).
    5. После разреза секции остановите процесс секции и медленно откройте зажимный винт трубки и слейте водную лодку (скорость потока одной капли воды в секунду).
    6. После завершения процесса сбора ленты снимите субстрат с ручкой зажима устройства и высушите ленту(рисунок 1М).

5. Изображение в SEM и выравнивание стека изображений SEM

  1. Установите крышку с покрытием ITO на алюминиевые заглушки с липкой углеродной лентой. Печать стеклянной поверхности и поверхности в заглушку с липкой углеродной лентой, а затем пальто с 10-нм толщиной углеродного слоя(рисунок 1N).
  2. Обратите внимание на покрытие ITO покрытием в полевых выбросов SEM при низком ускоренном напряжении 5 кВ и подходящее рабочее расстояние для эффективного сбора BSEs.
  3. Импортируйте серийные изображения в программное обеспечение Image J (Фиджи)13 с помощью опции виртуального стека. Откройте новый TrakEM14и импортируйте стек изображения в TrakEM. Нажмите кнопку «Правая мышь» и выберите меню выравнивания.
  4. Затем выберите диапазон изображений (от первого изображения до последнего изображения). Завершите автоматическое выравнивание, сохраните выровненный набор данных и выберите экспорт для компиляции плоского изображения из выбранного диапазона изображений (от первого изображения до последнего изображения). Наконец, сохраните плоские данные изображения в формате AVI в главном меню Image J.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный фильм 1 и дополнительный фильм 2 показать SEM стек изображения и обрезанные изображения стек, соответственно.

6. Сегментация митохондрий и ER от серийных изображений

  1. Запустите 3dmod в iMOD15 программного обеспечения и открытых файлов изображений.
  2. В окне ЗаП нарисуйте контур митохондрий и ER с помощью кнопки «средняя мышь».
  3. Чтобы визуализировать сегментированный объем, откройте окно Model View (Дополнительныйфильм 3).

Результаты

Рисунок 1 описывает расписание и рабочий процесс для этого протокола. Протокол требует 7 дней; однако, в зависимости от времени, затраченного на sem изображения, это может увеличиться. Для трансфекции клеток, выпуклость клеток должна контролироваться, чтобы не покрывать нижнюю ч?...

Обсуждение

Определение клеточной локализации конкретных белков в разрешении нанометра с помощью EM имеет решающее значение для понимания клеточных функций белков. Как правило, Существует два метода для изучения локализации целевого белка через EM. Одним из них является метод иммуногольд, который ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано основной исследовательской программой KBRI через Корейский институт исследований мозга, финансируемый Министерством науки и ИКТ (19-BR-01-08), и ГрантОм Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым корейским правительством (MSIT)(Нет. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 и плазмиды HRP-KDEL любезно были предоставлены Хён У Ри (Суульский национальный университет). Данные TEM были получены на основных объектах исследования мозга в КБРИ.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
GlutaraldehydeEMS16200Use only in fume hood
ParaformaldehydeEMS19210Use only in fume hood
Sodium cacodylateEMS12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solutionEMS16320Use only in fume hood
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Uranyl acetateEMS22400Hazardous chemical
Lead citrateEMS17900
35mm Gridded coverslip dishMattekP35G-1.5-14-CGRD
Glow dischargerPelcoeasiGlow
Formvar carbon coated Copper GridTed Pella01805-F
Hydrochloric acidSIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
GlycineSIGMAG8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)SIGMAD8001Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solutionMerck107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrateSIGMAP3289
0.22 um syringe filterSartorius16534
ThiocarbonyldihydrazideSIGMA223220Use only in fume hood
Potassium hydroxideFluka10193426
L-aspartic acidSIGMAA9256
EthanolMerck100983
Transmission electron microscopyFEITecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslipsSPI06489-ABfragil glass
IsopropanolFisher BioreagentsBP2618-1
Diamond knifeLeicaAT-4
Inveted light microscopyNikonECLipse TS100
Scanning electron microscopyZeissAuriga

Ссылки

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149ERAPEXHRP3DEM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены