Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Résumé

Nous présentons un protocole pour étudier la distribution des mitochondries et du réticulum endoplasmique dans les cellules entières après modification génétique utilisant la lumière corrélative et la microscopie électronique de volume comprenant la peroxidase d'ascorbate 2 et la coloration de peroxidase de raifort, sectionnement en série des cellules avec et sans le gène cible dans la même section, et imagerie en série par microscopie électronique.

Résumé

Les organites cellulaires, tels que les mitochondries et le réticulum endoplasmique (ER), créent un réseau pour effectuer une variété de fonctions. Ces structures très courbes sont repliées en différentes formes pour former un réseau dynamique en fonction des conditions cellulaires. La visualisation de ce réseau entre les mitochondries et les urgences a été tentée à l'aide de l'imagerie par fluorescence à super résolution et de la microscopie légère; cependant, la résolution limitée est insuffisante pour observer les membranes entre les mitochondries et les urgences en détail. La microscopie électronique de transmission fournit le bon contraste de membrane et la résolution nanométrique-échelle pour l'observation des organelles cellulaires ; cependant, il prend exceptionnellement de temps lors de l'évaluation de la structure tridimensionnelle (3D) des organites très incurvés. Par conséquent, nous avons observé la morphologie des mitochondries et des er par l'intermédiaire de la microscopie corrélative de lumière-électron (CLEM) et des techniques de microscopie électronique de volume utilisant le peroxidase d'ascorbate amélioré 2 et la coloration de peroxidase de raifort. Une méthode de coloration en bloc, la section série ultramince (tomographie de tableau), et la microscopie électronique de volume ont été appliquées pour observer la structure 3D. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de CLEM et de microscopie électronique 3D pour effectuer des études structurelles détaillées des mitochondries et des urgences.

Introduction

Les mitochondries et les réticulums endoplasmiques (ER) sont des organites cellulaires liés à la membrane. Leur connexion est nécessaire pour leur fonction, et les protéines liées à leur réseau ont été décrites¹. La distance entre les mitochondries et les urgences aété rapportée comme étant d'environ 100 nm à l'aide de la microscopie légère 2; cependant, des études récentes de microscopie de super résolution³ et de microscopie électronique (EM)⁴ ont révélé qu'elle était considérablement plus petite, à environ 10-25 nm. La résolution obtenue dans la microscopie de super-résolution est inférieure à EM, et l'étiquetage spécifique est nécessaire. L'EM est une technique appropriée pour atteindre un contraste à résolution suffisamment élevée pour les études structurelles des connexions entre les mitochondries et les urgences. Cependant, un inconvénient est l'information limitée de z-axe parce que les sections minces doivent être approximativement 60 nm ou plus minces pour la microscopie électronique conventionnelle de transmission (TEM). Pour une imagerie suffisamment em z-axe, la microscopie électronique tridimensionnelle (3DEM) peut être utilisée⁵. Cependant, cela implique la préparation de centaines de sections minces série de cellules entières, ce qui est un travail très délicat que seuls quelques technologues qualifiés ont maîtrisé. Ces fines sections sont collectées sur des grilles TEM d'un trou enduites de forme fragiles. Si le film se brise sur une ceinture, l'imagerie en série et la reconstruction de volume n'est pas possible. La microscopie électronique à balayage par blocs en série (SBEM) est une technique populaire pour 3DEM qui utilise la section destructrice en bloc à l'intérieur de la chambre à vide du microscope électronique à balayage (SEM) avec un couteau diamant (Dik-SBEM) ou un faisceau d'ions focalisés (FIB-SEM) ⁶. Cependant, parce que ces techniques ne sont pas disponibles à toutes les installations, nous suggérons la tomographie de tableau⁷ utilisant la sectionde série et SEM. Dans la tomographie de tableau, les sections série coupées à l'aide d'un ultramicrotome sont transférées sur un bordereau de verre au lieu d'une grille TEM et visualisées par microscopie légère et SEM⁸. Pour améliorer le signal pour l'imagerie par électron de rétrodiffusion (ESB), nous avons utilisé un protocole de coloration EM en bloc utilisant des cellules fixes d'osmium (OsO₄) avec thiocarbohydrazide osmiophilique (TCH)⁹, nous permettant d'obtenir des images sans post-embedding double coloration.

En outre, le marqueur mitochondrial SCO1 (cytochrome c oxidase protéine d'assemblage 1)MD ascorbate peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ étiquette moléculaire a été utilisé pour visualiser les mitochondries au niveau EM. APEX2 est d'environ 28 kDa et est dérivé de soja ascorbate peroxidase¹¹. Il a été développé pour montrer l'emplacement détaillé de protéines spécifiques au niveau EM de la même manière que la protéine fluorescente verte marquée par la protéine est utilisée dans la microscopie légère. APEX2 convertit 3,3' -diaminobenzidine (DAB) en polymère osmiophilique insoluble sur le site de l'étiquette en présence du cofactor peroxyde d'hydrogène (H₂O₂). APEX2 peut être utilisé comme une alternative à l'étiquetage des anticorps traditionnels dans EM, avec une localisation des protéines dans toute la profondeur de la cellule entière. En d'autres termes, la protéine APEX2-étiquetée peut être visualisée par osmication spécifique¹¹ sans étiquetage et perméabilisation d'immunogold après ultra-cryosectioning. Le peroxidase de raifort (HRP) est également une étiquette sensible qui catalyse la polymérisation H₂O₂-dépendante du DAB en un précipité localisé, offrant un contraste EM après le traitement avec OsO₄. La séquence peptide cible ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² a été appliquée pour visualiser les urgences dans une cellule entière. Pour évaluer notre protocole d'utilisation des étiquettes génétiques et de la coloration en bloc avec l'osmium réduit et TCH (méthode rOTO), en utilisant l'effet d'osmication en même temps, nous avons comparé le contraste de membrane avec et sans l'utilisation de chaque étiquette génétique dans la coloration rOTO en bloc. Bien que 3DEM avec la tomographie de tableau et la coloration de DAB avec APEX et HRP aient, respectivement, été employées pour d'autres buts, notre protocole est unique parce que nous avons combiné la tomographie de réseau pour la coloration 3DEM et DAB pour des mitochondries et l'étiquetage d'ER. Plus précisément, nous avons montré cinq cellules avec et sans gènes APEX-marqués dans la même section, qui a aidé à étudier l'effet de la modification génétique sur les cellules.

Protocole

1. Culture cellulaire avec plat de culture de grille à motifs et transfection cellulaire avec sCO1-APEX2 et vector plasmide HRP-KDEL

1. Graines 1 x 10⁵ cellules HEK293T en les plaçant dans des plats de culture à fond de grille de verre de 35 mm dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ à 37 oC dans le milieu modifié de l'Aigle (DMEM) modifié de Dulbecco, complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL pénicilline, et 100 U/mL de streptomycine.
2. Le lendemain de l'ensemencement des cellules, lorsqu'elles ont atteint 50 % à 60 % de confluence, introduisez le SCO1-APEX2¹⁰ et le plasmide HRP-KDEL¹² dans les cellules utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 g HRP-KDEL plasmide ADN 0,5 g par réactif de transfection de 3 L).

2. Microscopie légère des cellules se développant sur les plats de culture modelés et coloration de DAB pour APEX2 et HRP

1. À 16-24 h après la transfection, retirez tous les supports de culture et ajoutez immédiatement 250 l de solution de fixation chaude (30-37 oC) (tableau 1) par pipetting douce. Retirez immédiatement la solution de fixation et remplacez-la par une solution de fixation fraîche de 1,5 ml. Incuber sur la glace pendant 60 min, puis laver trois fois pendant 10 min chacun dans 1 ml de tampon cacodylate de sodium glacé de 0,1 M (tableau 1).
   CAUTION : Les fumées d'aldéhyde sont extrêmement toxiques. Effectuez tous les travaux sous une hotte à fumée ventilée.
2. Ajouter 1 ml de solution froide (0-4 oC) de glycine à 20 mM et incuber 10 min sur glace, puis trois lavages de 5 min chacun dans 1 ml de tampon de cacodylate de sodium froid de 0,1 m.
3. Préparer une nouvelle solution 1x DAB (3,33 ml de solution cacodylate de 0,3 M , 10 oL de 30 % H₂O₂ , 5,67 ml d'eau froide et 1 mL 10x solution DAB).
4. Ajouter 500 oL de la solution 1x DAB fraîchement préparée (étape 2.3) et incuber sur la glace pendant environ 5-45 min jusqu'à ce qu'une tache brun clair soit visible sous un microscope léger inversé (figure 1A).
5. Retirer délicatement la solution DAB et rincer trois fois avec 1 ml de tampon de cacodylate de sodium froid de 0,1 M pendant 10 min chacun.
6. Utilisez un microscope inversé à contraste de phase (ou un microscope à lumière à champ lumineux) pour visualiser la coloration DAB à un grossissement de 100x ou plus. Utilisez un stylo marqueur pour marquer le fond du verre où se trouve la région d'intérêt (ROI) (figure 1B,C).

3. Préparation de l'échantillon pour le bloc EM

1. Effectuer la culture cellulaire et la coloration DAB comme décrit dans les étapes 2.1-2.6.
2. Après fixer les échantillons avec 1 ml de 2% réduit OsO₄ pour 1 h à 4 oC.
   CAUTION: Les vapeurs osO₄ sont très toxiques. Effectuez tous les travaux sous une hotte à fumée ventilée.
3. Préparer une nouvelle solution TCH (tableau 1) au cours de l'étape 3.2 et passer à travers un filtre de 0,22 m.
   CAUTION: Les fumées de TCH sont très toxiques. Effectuez tous les travaux sous une hotte à fumée ventilée.
4. Retirer le fixatif et rincer trois fois avec 1 ml d'eau distillée pendant 5 min chacun à température ambiante (RT).
5. Placez les cellules dans 1 ml de solution TCH préalablement préparée et filtrée pendant 20 min à RT.
6. Rincer les cellules trois fois avec 1 ml d'eau distillée pendant 5 min chacune à RT.
7. Exposer les cellules une deuxième fois à 1 ml de tétroxide d'osmium de 2 % dans de l'eau distillée pendant 30 min à RT.
8. Retirer le fixatif et rincer trois fois avec 1 ml d'eau distillée pendant 5 min chacun à RT. Ajouter 1 ml d'acétate uranyl de 1 % (aqueous), et laisser la nuit à 4 oC dans l'obscurité.
9. Laver les cellules trois fois dans 1 ml d'eau distillée pendant 5 min chacune à RT.
10. Pré-chauffer la solution d'aspartate de plomb de Walton (tableau 1) dans un four à 60 oC pendant 30 min.
11. Tainer les cellules avec la solution d'aspartate de plomb de Walton en ajoutant 1 ml de la solution d'aspartate de plomb préréchauffée, puis placer dans un four pendant 30 min à 60 oC.
12. Rincer les cellules trois fois avec 1 ml d'eau distillée pendant 5 min chacune à RT.
13. Incuber dans une série graduée d'aliquots d'éthanol de 2 ml (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %) pendant 20 min chacun à RT.
14. Décant l'éthanol et incuber pendant 30 min dans 1 ml d'éthanol 3:1: faible viscosité encastrer le milieu du mélange à RT.
15. Retirer le milieu et ajouter 1 ml d'éthanol 1:1 : faible viscosité encastrer le mélange moyen. Incuber pendant 30 min à RT.
16. Retirer le milieu et ajouter 1 ml d'éthanol 1:3 : faible viscosité encastrer le mélange moyen. Incuber pendant 30 min à RT.
17. Retirer le milieu et ajouter 1 ml de 100% de faible viscosité en castrer le milieu et incuber pendant la nuit.
18. Intégrer l'échantillon dans un mélange d'intégration 100% faible viscosité et incuber pendant 24 h à 60 oC.
19. Préparer des sections de 90 nm d'épaisseur à l'aide d'un ultramicrotome.
20. Observez la grille sous TEM à 200 kV.

4. Sectionnement en série et montage sur des couvertures enduites d'indium-étain-oxyde pour l'imagerie SEM

1. Préparation du substrat
   1. Nettoyez les couvercles en verre enduits d'indium-étain(Ei) (22 mm x 22 mm) par une légère agitation dans l'isopropanol de 30 à 60 s.
   2. Retirer les couvercles, égoutter l'isopropanol excédentaire et laisser sécher dans un environnement exempt de poussière.
   3. Traitez les couvercles en verre recouverts d'ITO par une décharge lumineuse à l'aide d'un enduit de plasma pendant 1 min.
      REMARQUE : L'activation du plasma confère une propriété hydrophile à la surface du substrat. Il crée un film très mince d'eau sur le substrat pour empêcher la formation de rides dans les sections lorsque la section est attachée au substrat.
   4. Insérez les couvercles en verre recouverts d'ITO dans le support du substrat et placez-les dans le bateau-couteau.
2. Découpage du bloc d'échantillon et de sectionnement en série
   1. Insérer le bloc d'échantillon dans le support de l'échantillon de l'ultramicrotome et le mettre dans le bloc de coupe.
   2. Utilisez une lame de rasoir pour couper toute la résine excédentaire autour de la position cible (identifiée à l'étape 2.6, Figure 1D-G). La forme de la face de bloc doit être trapézoïde ou rectangulaire. Le bord d'avant et le bord de fuite doivent être absolument parallèles (Figure 1H,I).
   3. Insérez le support de l'échantillon sur le bras de l'ultramicrotome et placez le couteau en diamant dans le porte-couteau. Insérez les couvercles en verre ITO dans le porte-ruban et serrez le transporteur avec la poignée (Figure 1J). Mettre le porte-ruban dans le bateau couteau et remplir le bateau couteau avec de l'eau distillée filtrée (Figure 1K).
   4. Ajuster la position du porteur avec la glissière du couteau en poussant soigneusement la poignée du support pour régler le bord du verre ITO près du couteau (Figure 1L).
   5. Après avoir coupé la section, arrêter le processus de sectionnement, et ouvrir lentement la vis de serrage du tube et drainer le bateau à eau (taux d'écoulement d'une goutte d'eau par seconde).
   6. Après avoir terminé le processus de collecte du ruban, retirez le substrat avec la poignée du dispositif de serrage et séchez le ruban (Figure 1M).

5. Imagerie dans le SEM et alignement de la pile d'images SEM

1. Montez la feuille de couverture recouverte d'ITO sur des talons d'aluminium avec du ruban adhésif en carbone. Scellez la surface de verre et la surface du talon avec du ruban adhésif en carbone, puis enrobez-vous d'une couche de carbone de 10 nm d'épaisseur (Figure 1N).
2. Observez la couverture recouverte d'ITO dans un SEM d'émission de champ à une basse tension d'accélération de 5 kV et une distance de travail appropriée pour la collecte efficace des ESB.
3. Importer les images en série dans le logiciel Image J (Fidji)¹³ en utilisant l'option de pile virtuelle. Ouvrez un nouveau TrakEM¹⁴, et importer la pile d'image dans TrakEM. Cliquez sur le bouton de la souris droite et choisissez le menu align.
4. Sélectionnez ensuite la plage d'images (de la première image à la dernière image). Terminer l'auto-alignement, enregistrer le jeu de données aligné et choisir l'exportation pour compiler une image plate à partir de la plage d'images sélectionnée (de la première image à la dernière image). Enfin, enregistrez les données d'image à plat dans le format AVI dans le menu principal image J.
   REMARQUE : Le film supplémentaire 1 et le film supplémentaire 2 montrent la pile d'images SEM et la pile d'images recadrées, respectivement.

6. Segmentation des mitochondries et des urgences à partir d'images en série

1. Démarrer le 3dmod dans le logiciel IMOD¹⁵ et les fichiers d'images ouvertes.
2. Dans la fenêtre ZaP, dessiner le contour des mitochondries et DES ER à l'aide du bouton de la souris centrale.
3. Pour visualiser le volume segmenté, ouvrez la fenêtre Model View (Film supplémentaire 3).

Résultats

La figure 1 décrit l'horaire et le flux de travail de ce protocole. Le protocole nécessite 7 jours; cependant, selon le temps passé sur l'imagerie SEM, cela peut augmenter. Pour la transfection cellulaire, la confluence des cellules doit être contrôlée afin de ne pas couvrir le fond de la plaque de grille entière (Figure 1A). Une densité cellulaire élevée pourrait empêcher l'identification de la cellule d'intérêt pendant le microscope léger et l'observation EM. Nous avons u...

Discussion

Déterminer la localisation cellulaire de protéines spécifiques à une résolution nanométrique à l'aide de l'EM est crucial pour comprendre les fonctions cellulaires des protéines. En général, il existe deux techniques pour étudier la localisation d'une protéine cible via EM. L'une est la technique immunogold, qui a été utilisée en EM depuis 1960, et l'autre est une technique utilisant récemment développé des étiquettes génétiquement codées¹⁶. Les techniques traditionnelles d'i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga