Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Resumo

Organelas celulares, como mitocôndrias e retículo endoplasmático (er), criam uma rede para realizar uma variedade de funções. Estas estruturas altamente curvas são dobradas em várias formas para formar uma rede dinâmica, dependendo das condições celulares. A visualização desta rede entre mitocôndria e ER foi tentada usando a imagem latente e a microscopia de luz super-resolution da fluorescência; no entanto, a resolução limitada é insuficiente para observar as membranas entre as mitocôndrias e ER em detalhes. A microscopia eletrônica de transmissão proporciona um bom contraste de membrana e uma resolução de escala nanométrica para a observação de organelas celulares; no entanto, é excepcionalmente demorado ao avaliar a estrutura tridimensional (3D) de organelas altamente curvadas. Conseqüentemente, nós observamos a morfologia das mitocôndrias e do ER através da microscopia correlativa da luz-elétron (CLEM) e das técnicas da microscopia de elétron do volume usando a peroxidase realçada 2 do ascorbato e a mancha da peroxidase do rábano. Um método de coloração em bloco, o corte de série ultrafinos (tomografia de matriz) e a microscopia eletrônica de volume foram aplicados para observar a estrutura 3D. Neste protocolo, nós sugerimos uma combinação de CLEM e de microscopia de elétron 3D para executar estudos estruturais detalhados das mitocôndria e do ER.

Introdução

As mitocôndria e o retículo endoplasmático (er) são organelles celulares membrana-limitados. Sua conexão é necessária para sua função, e as proteínas relacionadas à sua rede foram descritas¹. A distância entre a mitocôndria e o ER foi relatada como aproximadamente 100 nanômetro usando a microscopia de luz²; Entretanto, a microscopia recente da super-definição³ e a microscopia de elétron (em)⁴ estudos revelaram-na consideravelmente menor, em aproximadamente 10-25 nanômetro. A resolução obtida na microscopia de superresolução é menor que EM, e é necessária a rotulagem específica. EM é uma técnica apropriada para alcançar um contraste suficientemente de alta resolução para estudos estruturais das conexões entre mitocôndria e ER. Entretanto, uma desvantagem é a informação limitada do eixo z porque as seções finas devem ser aproximadamente 60 nanômetro ou mais finas para a microscopia de elétron convencional da transmissão (TEM). Para uma imagem EM z-axis suficiente, a microscopia eletrônica tridimensional (3DEM) pode ser usada⁵. No entanto, isso envolve a preparação de centenas de seções seriais finas de células inteiras, o que é um trabalho muito complicado que apenas alguns tecnólogos qualificados têm dominado. Estas seções finas são coletadas em grades de um furo de um buraco com revestimento de película de formvar frágil. Se a película quebra em um Gird, a imagem latente de série e a reconstrução do volume não são possíveis. A microscopia eletrônica de varredura do bloco-cara de série (SBEM) é uma técnica popular para 3DEM que use o corte destrutivo do bloco do en dentro da câmara de vácuo do microscópio de elétron da varredura (SEM) com uma faca do diamante (Dik-SBEM) ou um feixe focalizado do íon (FIB-SEM) ⁶. no entanto, porque essas técnicas não estão disponíveis em todas as instalações, sugerimos tomografia de matriz⁷ usando corte Serial e sem. No tomography da disposição, as seções de série cortadas usando um ultramicrotome são transferidas a um lamela de vidro em vez de uma grade de tem e visualizadas através da microscopia de luz e do sem⁸. Para aumentar o sinal para a imagem latente do elétron do backscatter (BSE), nós utilizamos um en Bloc em que mancha o protocolo que emprega o tetróxido do ósmio (Oso₄)-pilhas fixas com thiocarbohydrazide osmiophilic (tch)⁹, permitindo que nós obtenhamos imagens sem coloração dupla pós-incorporação.

Adicionalmente, o marcador mitocondrial SCO1 (citocromo c oxidase assembly protein 1) – ascorbato peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ molecular tag foi usado para visualizar mitocôndria no nível de em. APEX2 é de aproximadamente 28 kDa e é derivado de ascorbato de soja peroxidase¹¹. Foi desenvolvida para mostrar a posição detalhada de proteínas específicas no nível do em da mesma maneira que a proteína proteína-etiquetada fluorescente verde é usada na microscopia de luz. APEX2 converte 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB) em um polímero osmiofílico insolúvel no local da tag na presença do peróxido de hidrogênio cofator (H₂o₂). APEX2 pode ser usado como uma alternativa à rotulagem tradicional do anticorpo no em, com uma localização da proteína durante todo a profundidade da pilha inteira. Em outras palavras, a proteína APEX2-etiquetada pode ser visualizada pelo osmication específico¹¹ sem rotulagem immunogold e permeabilização após ultra-cryosectioning. A peroxidase de rábano (HRP) também é uma marca sensível que catalisa a polimerização de H₂o₂dependente de DAB em um precipitado localizado, proporcionando contraste em em após o tratamento com Oso₄. A sequência do peptídeo alvo de ER HRP-KDEL (Lys-Asp-Glu-leu)¹² foi aplicada para visualizar er dentro de uma célula inteira. Para avaliar nosso protocolo de utilização de Tags genéticas e de coloração em bloco com ósmio reduzido e TCH (método rOTO), utilizando o efeito de osmicação ao mesmo tempo, comparamos o contraste da membrana com e sem o uso de cada tag genético na mancha de rOTO en Bloc. Embora 3DEM com tomografia de matriz e coloração DAB com APEX e HRP tenham, respectivamente, sido utilizados para outros fins, nosso protocolo é único porque temos combinado tomografia de matriz para 3DEM e DAB coloração para mitocôndria e ER rotulagem. Especificamente, nós mostramos cinco pilhas com e sem os genes APEX-etiquetados na mesma seção, que ajudada em investigar o efeito da modificação genética em pilhas.

Protocolo

1. cultura de pilha com o transfection modelado do prato e da pilha da cultura da grade com SCO1-APEX2 e vetor do plasmídeo de HRP-KDEL

1. Semente 1 x 10⁵ HEK293T células, colocando-os em 35-mm de vidro grade-fundo pratos de cultura em uma atmosfera humidificada contendo 5% co₂ a 37 ° c em Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino, 100 U/ml penicilina e 100 U/mL de estreptomicina.
2. O dia após a semeadura das células, quando eles cresceram para 50%-60% confluência, introduzir o SCO1-APEX2¹⁰ e HRP-KDEL¹² plasmídeo para as células usando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + DNA de plasmídeo HRP-KDEL 0,5 μg por 3 μL de reagente de transfecção).

2. fotomicroscopia de células que crescem em pratos de cultura estampados e coloração DAB para APEX2 e HRP

1. A 16-24 h após a transfecção, retire todos os meios de cultura e adicione imediatamente 250 μL de solução de fixação morna (30-37 ° c) (tabela 1) por pipetagem suave. Retire imediatamente a solução de fixação e substitua-a por 1,5 mL de solução de fixação fresca. Incubar no gelo por 60 min, e depois lave três vezes por 10 min cada em 1 ml de tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M de gelo-frio (tabela 1).
   Cuidado: os vapores de aldeído são extremamente tóxicos. Realize todo o trabalho uma capa ventilada das emanações.
2. Adicionar 1 ml de solução de glicina fria (0-4 ° c) 20 mm e incubar durante 10 min no gelo seguido de três lavas de 5 min cada em 1 ml de tampão de cacodilato de sódio a frio 0,1 M.
3. Prepare uma solução nova de 1x DAB (3,33 ml de solução de cacodilato de 0,3 M + 10 μL de 30% H₂O₂ + 5,67 ml de água fria + 1 ml de solução de 10x DAB).
4. Adicionar 500 μL da solução de 1x DAB recém-preparada (passo 2,3) e incubar no gelo por aproximadamente 5-45 min até que uma mancha marrom clara seja visível um microscópio de luz invertido (Figura 1a).
5. Retire suavemente a solução DAB e enxague três vezes com 1 ml de tampão de cacodilato de sódio a frio de 0,1 M durante 10 min cada.
6. Use um microscópio invertido de contraste de fase (ou um microscópio de luz de campo brilhante) para visualizar a coloração DAB em uma ampliação de 100x ou superior. Use uma caneta marcador para marcar a parte inferior do vidro onde a região de interesse (ROI) está localizada (Figura 1b, C).

3. preparação da amostra para o bloco EM

1. Realize a cultura de células e a coloração DAB conforme descrito nas etapas 2.1-2.6.
2. Post-Fix as amostras com 1 mL de 2% reduziu OsO₄ para 1 h a 4 ° c.
   PRECAUÇÃO: os fumos OsO₄ são altamente tóxicos. Realize todo o trabalho uma capa ventilada das emanações.
3. Prepare uma nova solução TCH (tabela 1) durante a etapa 3,2 e passe por um filtro de 0,22 μm.
   Cuidado: as emanações de TCH são altamente tóxicas. Realize todo o trabalho uma capa ventilada das emanações.
4. Retire o fixador e enxague três vezes com 1 mL de água destilada durante 5 min a cada temperatura ambiente (RT).
5. Coloque as células em 1 mL de solução de TCH previamente preparada e filtrada por 20 min em RT.
6. Enxague as células três vezes com 1 mL de água destilada durante 5 min cada na RT.
7. Expor as células uma segunda vez a 1 mL de 2% de tetroxida de ósmio em água destilada por 30 min em RT.
8. Retire o fixador e enxague três vezes com 1 ml de água destilada durante 5 min cada na RT. Adicione 1 ml de acetato de uranilo a 1% (aquoso) e deixe durante a noite a 4 ° c no escuro.
9. Lave as células três vezes em 1 mL de água destilada durante 5 min cada na RT.
10. Solução de aspartato de chumbo de Walton pré-quente (tabela 1) em forno a 60 ° c por 30 min.
11. Manchar as células com a solução de aspartato de chumbo de Walton adicionando 1 mL da solução de aspartato de chumbo pré-aquecido e, em seguida, coloque em um forno por 30 min a 60 ° c.
12. Enxague as células três vezes com 1 mL de água destilada durante 5 min cada na RT.
13. Incubar em uma série graduada de alíquotas de 2 mL de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) por 20 min cada em RT.
14. Decantar o etanol e incubar por 30 min em 1 mL de 3:1 etanol: meio de mistura de baixa viscosidade incorporação em RT.
15. Retire o meio e adicione 1 mL de 1:1 etanol: meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade. Incubar por 30 min em RT.
16. Retire o meio e adicione 1 mL de 1:3 etanol: meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade. Incubar por 30 min em RT.
17. Retire o meio e adicione 1 mL de 100% de baixa viscosidade de incorporação de médio e incubar durante a noite.
18. Incorporar a amostra em 100% baixa-viscosidade incorporação de mistura e incubar para 24 h em 60 ° c.
19. Prepare 90-nm seções grossas usando um ultramicrotome.
20. Observe a grelha em TEM a 200 kV.

4. serial seccionamento e montagem em indium-Tin-óxido revestido COVERSLIP para SEM imagem

1. Preparação do substrato
   1. Limpe o indium-estanho-óxido (ITO)-COVERSLIP de vidro revestido (22 milímetros x 22 milímetros) pela agitação delicada no isopropanol para 30-60 s.
   2. Retire as coberturas, drenar o excesso de isopropanol, e deixar em um ambiente livre de poeira até secar.
   3. Trate as coberturas de vidro revestidas com ITO por descarga de brilho usando um coater de plasma por 1 min.
      Nota: a activação plasmática confere uma propriedade hidrófila na superfície do substrato. Cria uma película muito fina da água na carcaça para impedir a formação do enrugamento nas seções quando a seção é unida ao substrato.
   4. Insira as coberturas de vidro revestidas com ITO no suporte do substrato e coloque-a no barco da faca.
2. Aparar o bloco de amostra e o corte Serial
   1. Insira o bloco de amostra no suporte da amostra do ultramicrotome e coloque-o no bloco de corte.
   2. Use uma lâmina de barbear para aparar todo o excesso de resina em torno da posição alvo (identificado na etapa 2,6, Figura 1D-G). A forma da face do bloco deve ser trapezoide ou retangular. A aresta principal e a borda à direita devem ser absolutamente paralelas (Figura 1h, I).
   3. Insira o suporte da amostra no braço do ultramicrotome e coloque a faca de diamante no porta-navalha. Insira as coberturas de vidro ITO no suporte da fita e prenda o transportador com a pega (Figura 1J). Coloque o suporte da fita no barco da faca e encha o barco da faca com água destilada filtrada (Figura 1K).
   4. Ajuste a posição da transportadora com o slide da faca, empurrando cuidadosamente a alça do suporte para definir a borda do vidro ITO perto da faca (Figura 1L).
   5. Depois de cortar a seção, parar o processo de corte, e lentamente abrir o parafuso de aperto do tubo e drenar o barco de água (taxa de fluxo de uma gota de água por segundo).
   6. Depois de completar o processo de coleta de fita, retire o substrato com a alça do dispositivo de aperto e seque a fita (Figura 1m).

5. imagem no SEM e alinhamento da pilha de imagens SEM

1. Monte o lamela Ito-revestido em esboços de alumínio com fita adesiva do carbono. Selar a superfície de vidro e a superfície no topo com fita adesiva de carbono, e depois casaco com uma camada de carbono de 10 nm de espessura (Figura 1N).
2. Observe a cobertura com cobertura de ITO em uma emissão de campo SEM com uma baixa tensão de aceleração de 5 kV e uma distância de trabalho adequada para a eficiente coleta de BSEs.
3. Importe as imagens seriais para o software Image J (Fiji)¹³ usando a opção de pilha virtual. Abra um novo TrakEM¹⁴e importe a pilha de imagens para o trakem. Clique no botão direito do mouse e escolha o menu alinhar .
4. Em seguida, selecione o intervalo de imagem (da primeira imagem para a última imagem). Conclua o alinhamento automático, salve o conjunto de dados alinhado e escolha Exportar para compilar uma imagem plana do intervalo de imagens selecionado (da primeira imagem para a última imagem). Por fim, salve os dados de imagem simples no formato AVI no menu principal do Image J.
   Nota: suplementar filme 1 e suplementar filme 2 mostram a pilha de imagens sem e cortada pilha de imagens, respectivamente.

6. segmentação de mitocôndrias e ER de imagens seriais

1. Inicie o 3dmod no software IMOD¹⁵ e abra arquivos de imagem.
2. Na janela ZaP, desenhe o contorno das mitocôndrias e ER usando o botão do meio do mouse.
3. Para visualizar o volume segmentado, abra a janela de visualização do modelo (filme suplementar 3).

Resultados

A Figura 1 descreve a agenda e o fluxo de trabalho para este protocolo. O protocolo requer 7 dias; no entanto, dependendo do tempo gasto na imagem SEM, isso pode aumentar. Para o transfection da pilha, a confluência das pilhas deve ser controlada de modo a para não cobrir a parte inferior da placa de grade inteira (Figura 1a). Uma densidade elevada da pilha poderia impedir a identificação da pilha do interesse durante o microscópio claro e a observação de EM. Nós usamos plasmíde...

Discussão

Determinar a localização celular de proteínas específicas em uma resolução de nanômetro usando EM é crucial para compreender as funções celulares das proteínas. Geralmente, existem duas técnicas para estudar a localização de uma proteína alvo via EM. Uma delas é a técnica imunogantiga, que tem sido usada em em desde 1960, e a outra é uma técnica utilizando Tags geneticamente codificadas recentemente desenvolvidas¹⁶. As técnicas immunogold tradicionais empregaram partículas de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga