Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

Zelluläre Organellen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER), bilden ein Netzwerk, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Diese hochgekrümmten Strukturen werden in verschiedene Formen gefaltet, um je nach zellulären Bedingungen ein dynamisches Netzwerk zu bilden. Die Visualisierung dieses Netzwerks zwischen Mitochondrien und ER wurde mit superauflösungsklarer Fluoreszenz-Bildgebung und Lichtmikroskopie versucht; Die begrenzte Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Membranen zwischen den Mitochondrien und ER im Detail zu beobachten. Transmissionselektronenmikroskopie bietet einen guten Membrankontrast und eine Nanometer-Auflösung für die Beobachtung von Zellorganellen; Bei der Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Struktur hochgekrümmter Organellen ist es jedoch außerordentlich zeitaufwändig. Daher beobachteten wir die Morphologie von Mitochondrien und ER mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) und Volumenelektronenmikroskopie-Techniken mit verbesserter Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung. Zur Beobachtung der 3D-Struktur wurden eine en bloc-Färbemethode, ultradünne serielle Schnitte (Arraytomographie) und Volumenelektronenmikroskopie angewendet. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination von CLEM und 3D-Elektronenmikroskopie vor, um detaillierte Strukturstudien von Mitochondrien und ER durchzuführen.

Einleitung

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) sind membrangebundene Zellorganellen. Ihre Verbindung ist für ihre Funktion notwendig, und Proteine, die mit ihrem Netzwerk zusammenhängen, wurden beschrieben¹. Der Abstand zwischen den Mitochondrien und ER wurde mit Hilfe der Lichtmikroskopie²als etwa 100 nm gemeldet; Jüngste Studien der Superresolution-Mikroskopie³ und der Elektronenmikroskopie (EM)⁴ haben jedoch ergeben, dass sie mit etwa 10-25 nm erheblich kleiner ist. Die in der Hochauflösenden Mikroskopie erreichte Auflösung ist niedriger als EM, und eine spezifische Kennzeichnung ist erforderlich. EM ist eine geeignete Technik, um einen ausreichend hochauflösenden Kontrast für Strukturstudien der Verbindungen zwischen Mitochondrien und ER zu erreichen. Ein Nachteil sind jedoch die begrenzten Z-Achsen-Informationen, da die dünnen Abschnitte für die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) etwa 60 nm oder dünner sein müssen. Für eine ausreichende EM-Z-Achsen-Bildgebung kann die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3DEM)⁵verwendet werden. Dies beinhaltet jedoch die Vorbereitung von Hunderten von dünnen seriellen Abschnitten ganzer Zellen, was eine sehr schwierige Arbeit ist, die nur wenige erfahrene Technologen gemeistert haben. Diese dünnen Abschnitte werden auf zerbrechlichen Formwaren-Film-beschichteten Ein-Loch-TEM-Gittern gesammelt. Wenn der Film auf einem Gurt bricht, ist eine serielle Bildgebung und Volumenrekonstruktion nicht möglich. Die serielle Block-Face-Scanning-Elektronenmikroskopie (SBEM) ist eine beliebte Technik für 3DEM, bei der zerstörerische En-Block-Sektionen in der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit einem Diamantmesser (Dik-SBEM) oder einem fokussierten Ionenstrahl (FIB-SEM) ^{verwendet werden. 6}. Da diese Techniken jedoch nicht in allen Einrichtungen verfügbar sind, schlagen wir arraytomography⁷ mit seriellem Schnitt und SEM vor. In der Arraytomographie werden mit einem Ultramikrotom geschnittene serielle Abschnitte auf einen Glasdeckel anstelle eines TEM-Gitters übertragen und mittels Lichtmikroskopie und SEM⁸visualisiert. Um das Signal für die Rückstreuelektronen-Bildgebung (BSE) zu verbessern, haben wir ein en bloc EM-Färbeprotokoll verwendet, das Osmiumtetroxid (OsO₄)-feste Zellen mit osmiophilem Thiocarbohydrazid (TCH)⁹verwendet, so dass wir Bilder ohne Doppelfärbung nach der Einbettung.

Zusätzlich wurde der mitochondriale Marker SCO1 (Cytochrom c Oxidase Assembly Protein 1)– Ascorbatperoxidase 2 (APEX2)¹⁰ molekulare Tags verwendet, um Mitochondrien auf EM-Ebene zu visualisieren. APEX2 ist ca. 28 kDa und wird aus Sojabohnen-Ascorbatperoxidase¹¹abgeleitet. Es wurde entwickelt, um die detaillierte Position spezifischer Proteine auf EM-Ebene auf die gleiche Weise zu zeigen, wie grüne fluoreszierende Protein-markierte Proteine in der Lichtmikroskopie verwendet werden. APEX2 wandelt 3,3' -Diaminobenzidin (DAB) in ein unlösliches osmiophiles Polymer an der Stelle des Tagsin Gegenwart des Cofaktors Wasserstoffperoxid (H2 O2 ) um. APEX2 kann als Alternative zur herkömmlichen Antikörperkennzeichnung in EM mit einer Proteinlokalisierung in der gesamten Zelltiefe verwendet werden. Mit anderen Worten, das APEX2-markierte Protein kann durch spezifische Osmisierung¹¹ ohne Immunogold-Etikettierung und Permeabilisierung nach Ultra-Kryosektion visualisiert werden. Meerrettichperoxidase (HRP) ist auch ein empfindliches Tag,das die H2 O2-abhängige Polymerisation von DAB in einen lokalisierten Niederschlag katalysiert und em-Kontrast nach der Behandlung mit OsO₄liefert. Die ER-Zielpeptidsequenz HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² wurde angewendet, um ER innerhalb einer ganzen Zelle zu visualisieren. Um unser Protokoll der Verwendung von genetischen Tags und En-Block-Färbung mit reduziertem Osmium und TCH (rOTO-Methode) unter Verwendung des Osmisierungseffekts gleichzeitig zu bewerten, verglichen wir den Membrankontrast mit und ohne die Verwendung jedes genetischen Tags in rOTO en bloc Färbung. Obwohl 3DEM mit Arraytomographie und DAB-Färbung mit APEX bzw. HRP für andere Zwecke verwendet wurden, ist unser Protokoll einzigartig, da wir Arraytomographie für 3DEM- und DAB-Färbung für Mitochondrien und ER-Kennzeichnung kombiniert haben. Insbesondere zeigten wir fünf Zellen mit und ohne APEX-markierte Gene im selben Abschnitt, die bei der Untersuchung der Wirkung der genetischen Veränderung auf Zellen halfen.

Protokoll

1. Zellkultur mit gemusterter Gitterkulturschale und Zelltransfektion mit SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmidvektor

1. Samen 1 x 10⁵ HEK293T Zellen, indem sie sie in 35-mm-Glasgitter-Boden-Kulturschalen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin.
2. Am Tag nach der Aussaat der Zellen, wenn sie auf 50%-60% Konfluenz angewachsen sind, führen Sie die Plasmids SCO1-APEX2¹⁰ und HRP-KDEL¹² mit Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Zellen ein (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 HRP-KDEL-Plasmid-DNA 0,5 g pro 3-L-Transfektionsreagenz).

2. Lichtmikroskopie von Zellen, die auf gemusterten Kulturgerichten wachsen, und DAB-Färbung für APEX2 und HRP

1. Entfernen Sie bei 16-24 h nach der Transfektion alle Kulturmedien und fügen Sie sofort 250 l warme (30-37 °C) Fixierungslösung (Tabelle1) durch sanfte Pipettierung hinzu. Entfernen Sie die Fixierlösung sofort und ersetzen Sie sie durch 1,5 ml frische Fixierungslösung. Auf Eis für 60 min bebrüten und dann dreimal für 10 min in 1 ml eiskaltem 0,1 M Natrium-Cakodylat-Puffer waschen (Tabelle 1).
   VORSICHT: Aldehyddämpfe sind extrem giftig. Führen Sie alle Arbeiten unter einer belüfteten Dunstabzugshaube durch.
2. 1 ml kalte (0-4 °C) 20 mM Glycinlösung hinzufügen und 10 min auf Eis brüten, gefolgt von drei Waschungen von je 5 min in 1 ml kaltem 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer.
3. Bereiten Sie eine frische 1x DAB-Lösung (3,33 ml 0,3 m Cacodylate-Lösung + 10 l 30% H₂O₂ + 5,67 ml kaltwasser + 1 ml 10x DAB-Lösung) vor.
4. Fügen Sie 500 l der frisch zubereiteten 1x DAB-Lösung (Schritt 2.3) hinzu und tauchen Sie ca. 5-45 min auf Eis ein, bis unter einem invertierten Lichtmikroskop ein hellbrauner Fleck sichtbar ist (Abbildung 1A).
5. Entfernen Sie die DAB-Lösung vorsichtig und spülen Sie sie dreimal mit 1 ml kaltem 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer für jeweils 10 min ab.
6. Verwenden Sie ein phasenkontrastinvertiertes Mikroskop (oder ein Hellfeld-Lichtmikroskop), um die DAB-Färbung bei einer Vergrößerung von 100x oder höher zu visualisieren. Verwenden Sie einen Markerstift, um den Unteren Rand des Glases zu markieren, in dem sich der Interessenbereich (ROI) befindet (Abbildung 1B,C).

3. Probenvorbereitung für den EM-Block

1. Führen Sie Zellkultur und DAB-Färbung wie in den Schritten 2.1-2.6 beschrieben.
2. Nachfix der Proben mit 1 ml von 2% reduziert OsO₄ für 1 h bei 4 °C.
   VORSICHT: OsO₄ Dämpfe sind hochgiftig. Führen Sie alle Arbeiten unter einer belüfteten Dunstabzugshaube durch.
3. Bereiten Sie in Schritt 3.2 eine neue TCH-Lösung (Tabelle 1) vor und durchlaufen Sie einen 0,22-mm-Filter.
   VORSICHT: TCH-Dämpfe sind hochgiftig. Führen Sie alle Arbeiten unter einer belüfteten Dunstabzugshaube durch.
4. Entfernen Sie das Fixativ und spülen Sie dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei Raumtemperatur (RT).
5. Legen Sie die Zellen in 1 ml zuvor vorbereitete und gefilterte TCH-Lösung für 20 min bei RT.
6. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT.
7. Setzen Sie die Zellen ein zweites Mal auf 1 ml 2% Osmiumtetroxid in destilliertem Wasser für 30 min bei RT aus.
8. Das Fixiermittel entfernen und dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT abspülen. 1 ml 1% Uranylacetat (wässrig) hinzufügen und bei 4 °C im Dunkeln über Nacht lassen.
9. Waschen Sie die Zellen dreimal in 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT.
10. Vorwärmende Walton-Blei-Aspartatlösung (Tabelle 1) im Ofen bei 60 °C für 30 min.
11. Färben Sie die Zellen mit Waltons Blei-Aspartat-Lösung, indem Sie 1 ml der vorgewärmten Blei-Aspartat-Lösung hinzufügen, und legen Sie sie dann 30 min bei 60 °C in einen Ofen.
12. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT.
13. Inkubieren in einer abgestuften Reihe von 2-ml-Ethanol-Aliquots (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) für jeweils 20 min bei RT.
14. Das Ethanol dekantieren und 30 min in 1 ml 3:1 Ethanol:Low-Viskosität-Einbettungsmischmedium bei RT inkubieren.
15. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 1:1 Ethanol: Niedrigviskosität Einbettung smisch medium. 30 min bei RT inkubieren.
16. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 1:3 Ethanol: Niedrigviskosität Einbettung smisch medium. 30 min bei RT inkubieren.
17. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 100% niedrigviskose Einbettung Medium und inkubieren über Nacht.
18. Die Probe in eine 100% niedrigviskose Einbettungsmischung einbetten und 24 h bei 60 °C brüten.
19. Bereiten Sie 90-nm dicke Abschnitte mit einem Ultramikrotom vor.
20. Beobachten Sie das Netz unter TEM bei 200 kV.

4. SerielleS Teilen und Montieren auf indium-zinnoxidbeschichteten Abdeckungen für DIE SEM-Bildgebung

1. Substratvorbereitung
   1. Reinigen Sie Indium-Zinn-Oxid (ITO)-beschichtete Glasabdeckungen (22 mm x 22 mm) durch sanftes Rühren in Isopropanol für 30-60 s.
   2. Entfernen Sie die Deckellippen, abtropfen lassen Sie das überschüssige Isopropanol ab und lassen Sie es in einer staubfreien Umgebung bis zum Trocknen.
   3. Behandeln Sie die ITO-beschichteten Glasabdeckungen durch Glühenentladung mit einem Plasmalackfürst für 1 min.
      HINWEIS: Plasmaaktivierung verleiht der Substratoberfläche eine hydrophile Eigenschaft. Es erzeugt einen sehr dünnen Wasserfilm auf dem Substrat, um Faltenbildung in den Abschnitten zu verhindern, wenn der Abschnitt am Substrat befestigt ist.
   4. Setzen Sie die ITO-beschichteten Glasabdeckungen in den Substrathalter ein und legen Sie sie in das Messerboot.
2. Trimmen des Probenblocks und serielle Steilierung
   1. Legen Sie den Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotom ein und setzen Sie ihn in den Trimmblock.
   2. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das gesamte überschüssige Harz um die Zielposition herum zu schneiden (identifiziert in Schritt 2.6, Abbildung 1D-G). Die Form der Blockfläche sollte Trapez oder rechteckig sein. Die Vorder- und Hinterkante muss absolut parallel sein (Abbildung 1H,I).
   3. Legen Sie den Probenhalter auf den Arm des Ultramikrotom und legen Sie das Diamantmesser in den Messerhalter. Setzen Sie die ITO-Glasabdeckungen in den Bandträger ein und klemmen Sie den Träger mit dem Griff (Abbildung 1J). Stellen Sie den Bandträger in das Messerboot ein und füllen Sie das Messerboot mit gefiltertem destilliertem Wasser (Abbildung 1K).
   4. Stellen Sie die Trägerposition mit dem Schlitten des Messers ein, indem Sie den Griff des Halters vorsichtig drücken, um die Kante des ITO-Glases in der Nähe des Messers einzustellen (Abbildung 1L).
   5. Nach dem Schneiden des Abschnitts, stoppen Sie den Schnittprozess, und öffnen Sie langsam die Spannschraube des Rohres und entleeren Sie das Wasserboot (Durchflussrate von einem Tropfen Wasser pro Sekunde).
   6. Nach Abschluss des Band-Entnahmeprozesses das Substrat mit dem Griff der Spannvorrichtung entfernen und das Band trocknen (Abbildung 1M).

5. Bildgebung im SEM und Ausrichtung des SEM-Bildstapels

1. Montieren Sie den ITO-beschichteten Coverslip auf Aluminiumstummeln mit klebrigem Carbonband. Versiegeln Sie die Glasoberfläche und die Oberfläche im Stub mit klebrigem Carbonband, und beschichten Sie dann mit einer 10 nm dicken Kohlenstoffschicht (Abbildung 1N).
2. Beachten Sie den ITO-beschichteten Abdeckschlupf in einem Feldemissions-SEM bei einer niedrigen Beschleunigungsspannung von 5 kV und einem geeigneten Arbeitsabstand für die effiziente Sammlung von BSEs.
3. Importieren Sie die seriellen Bilder mit der Option "Virtueller Stack" in die Image J Software (Fiji)^13. Öffnen Sie eine neue TrakEM¹⁴, und importieren Sie den Bildstapel in TrakEM. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie das Ausrichten-Menü.
4. Wählen Sie dann den Bildbereich (vom ersten Bis zum letzten Bild) aus. Beenden Sie die automatische Ausrichtung, speichern Sie das ausgerichtete Dataset, und wählen Sie Export aus, um ein flaches Bild aus dem ausgewählten Bildbereich (vom ersten Bild bis zum letzten Bild) zu kompilieren. Speichern Sie schließlich die flachen Bilddaten im AVI-Format im Hauptmenü Bild J.
   HINWEIS: Ergänzender Film 1 und Ergänzungsfilm 2 zeigen den SEM-Bildstapel bzw. den zugeschnittenen Bildstapel an.

6. Segmentierung von Mitochondrien und ER aus seriellen Bildern

1. Starten Sie den 3dmod in DER IMOD¹⁵ Software und öffnen Sie Bilddateien.
2. Zeichnen Sie im ZaP-Fenster die Kontur der Mitochondrien und ER mit der Mittelmaustaste.
3. Um das segmentierte Volume zu visualisieren, öffnen Sie das Fenster Modellansicht (Ergänzender Film 3).

Ergebnisse

Abbildung 1 beschreibt den Zeitplan und den Workflow für dieses Protokoll. Das Protokoll benötigt 7 Tage; Abhängig von der Zeit, die für die SEM-Bildgebung aufgewendet wird, kann dies jedoch zunehmen. Bei der Zelltransfektion sollte die Konfluenz der Zellen so gesteuert werden, dass der Boden der gesamten Gitterplatte nicht abgedeckt wird (Abbildung 1A). Eine hohe Zelldichte könnte die Identifizierung der von Interesse sindden Zelle während der Lichtmikroskop- und EM-Beobachtung ve...

Diskussion

Die Bestimmung der zellulären Lokalisierung bestimmter Proteine bei einer Nanometerauflösung mit EM ist entscheidend, um die zellulären Funktionen von Proteinen zu verstehen. Im Allgemeinen gibt es zwei Techniken, um die Lokalisation eines Zielproteins über EM zu untersuchen. Das eine ist die Immunogold-Technik, die seit 1960 in EM verwendet wird, und die andere ist eine Technik mit neu entwickelten genetisch kodierten Tags¹⁶. Herkömmliche Immunogold-Techniken haben antikörperkonjugierte Gol...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga