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要約

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。

要約

ミトコンドリアや小プスミック網膜(ER)などの細胞小器官は、様々な機能を実行するネットワークを作成します。これらの高度に湾曲した構造は、細胞の状態に応じて動的ネットワークを形成するために様々な形状に折り畳まれています。ミトコンドリアとERの間のこのネットワークの可視化は、超解像蛍光イメージングと光顕微鏡を用いて試みられた。しかし、限られた分解能は、ミトコンドリアとERの間の膜を詳細に観察するには不十分である。透過電子顕微鏡は、細胞小器官の観察のための良好な膜コントラストとナノメートルスケールの分解能を提供します。しかし、高度に湾曲した小器官の3次元(3D)構造を評価する場合、非常に時間がかかります。そこで、強化されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ2とワサビペルオキシダーゼ染色を用いて、相対光電子顕微鏡(CLEM)と体積電子顕微鏡技術を用いてミトコンドリアとERの形態を観察した。enブロック染色法、超薄型連続断面(アレイ断層撮影)、体積電子顕微鏡を用いて3D構造を観察した。このプロトコルでは、ミトコンドリアとERの詳細な構造研究を行うためにCLEMと3D電子顕微鏡の組み合わせを提案する。

概要

ミトコンドリアおよび小プラズム網膜(ER)は、膜結合細胞小器官である。その接続は、その機能のために必要であり、彼らのネットワークに関連するタンパク質は1について説明されています。ミトコンドリアとERの間の距離は、光顕微鏡2を用いて約100nmと報告されている。しかし、最近の超解像顕微鏡3および電子顕微鏡(EM)4の研究は、約10〜25nmでかなり小さいことを明らかにした。超解像顕微鏡で達成される分解能はEMより低く、特異的な標識が必要である。EMは、ミトコンドリアとERとの間の接続の構造研究に十分に高分解能コントラストを達成するのに適した技術である。しかし、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)では薄い切片が約60nmまたは薄くなければならないため、Z軸情報が限られているのが不利です。十分なEM Z軸イメージングのために、3次元電子顕微鏡(3DEM)を使用することができる5.しかし、これは、少数の熟練した技術者だけが習得した非常にトリッキーな作業である、細胞全体の薄いシリアルセクションの数百の準備を含みます。これらの薄いセクションは壊れやすいフォルバーフィルムコーティングされた1穴TEMグリッドに集められている。フィルムが1つのガードで壊れた場合、シリアルイメージングとボリュームの再構築は不可能です。シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBEM)は、ダイヤモンドナイフ(Dik-SBEM)または集集型イオンビーム(FIB-SEM)のいずれかで走査型電子顕微鏡(SEM)真空チャンバ内の破壊的なブロック断面を使用する3DEMの一般的な技術です。6.しかし、これらの技術はすべての施設で利用できないため、シリアル断面とSEMを使用して配列断層撮影7を提案します。アレイ断層撮影では、超マイクロトームを使用して切断されたシリアルセクションは、TEMグリッドの代わりにガラスカバースリップに転送され、光顕微鏡とSEM8を介して視覚化されます。バックスキャッタ電子(BSE)イメージングのシグナルを増強するために、四酸化オスミウム(OsO4)固定細胞を用いたen blocEM染色プロトコルを利用し、オスミオフィリックチオカルボヒドラジエード(TCH)9を用いて画像を得ることを可能にした。ポスト埋め込み二重染色。

さらに、ミトコンドリアマーカーSCO1(シトクロムcオキシダーゼ集合タンパク質1)-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2(APEX2)10分子タグを用いて、EMレベルでミトコンドリアを可視化した。APEX2は約28kDaであり、大豆アスコルビン酸ペルオキシダーゼ11に由来する。これは、光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質タグ付きタンパク質が使用されるのと同じ方法で、EMレベルでの特定のタンパク質の詳細な位置を示すために開発されました。APEX2は、3,3' -ジアミノベンジジン(DAB)を、過酸化水素(H2O2)の存在下でタグの部位で不溶性オスミオフィリックポリマーに変換する。APEX2は、細胞全体の深さを通してタンパク質局在化を伴うEMにおける従来の抗体標識の代替として使用することができる。言い換えれば、APEX2タグ付きタンパク質は、超凍結切除後の免疫金標識および透過化なしに、特定の浸透11によって可視化することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)はまた、H2O-依存性重合DABを局所沈殿物に触媒する敏感なタグであり、OsO4による処理後のEMコントラストを提供する。ER標的ペプチド配列HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)12を用い、細胞全体でERを可視化した。減少したオスミウムおよびTCH(rOTO法)を用いた遺伝的タグおよびenブロック染色を利用する我々のプロトコルを評価するために、同時にオスミケーション効果を用いて、rOTO enブロック染色における各遺伝的タグの使用の有無にかかわらず膜コントラストを比較した。 アレイ断層撮影とAPEXおよびHRPによるDAB染色を用いた3DEMは、それぞれ他の目的のために利用されていますが、ミトコンドリアおよびERラベリング用の3DEMとDAB染色用の配列断層撮影を組み合わせたため、当社のプロトコルはユニークです。具体的には、APEXタグ付き遺伝子の有無にかかわらず5つの細胞を同じセクションで示し、細胞に対する遺伝子改変の効果を調べに役立った。

プロトコル

1. SCO1-APEX2およびHRP-KDELプラスミドベクターを用いたパターングリッド培養皿および細胞トランスフェクションを用いた細胞培養

  1. 種子1 x 105 HEK293T細胞を35mmガラス格子底培養食に置き、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で37°Cで5%CO2を含む加湿雰囲気中に置き、10%の胎児ウシ血清、100U/mLを補充した。ペニシリン、および100 U/mL連鎖虫菌。
  2. 細胞を播種した翌日、50%-60%の合流性に成長した場合、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用して細胞にSCO1-APEX210およびHRP-KDEL12プラスミドを導入する(SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg+HRP-KDELプラスミドDNA 0.5 μg/3 μLトランスフェクション試薬)。

2. パターン培養食に成長する細胞の光顕微鏡検査とAPEX2およびHRP用DAB染色

  1. トランスフェクション後16〜24時間で、すべての培養培地を取り除き、穏やかなピペッティングにより250μLの温かい(30~37°C)固定液(表1)を直ちに加えます。直ちに固定液を取り外し、1.5 mLの新しい固定液に交換してください。氷上で60分間インキュベートし、1mLの氷冷0.1Mカコダイレートバッファー(表1)でそれぞれ10分間3回洗浄する。
    注意:アルデヒドの煙は非常に有毒です。換気ヒュームフードの下ですべての作業を実行します。
  2. 冷たい(0-4 °C)20 mMグリシン溶液を1mL加え、氷の上で10分間インキュベートし、その後、冷たい0.1Mのカコジリン酸ナトリウムバッファーの1mLでそれぞれ5分の3回の洗浄を行います。
  3. 新鮮な1x DAB溶液(0.3Mカコジレート溶液の3.33 mL+ 30%H2 O2 + 5.67 mLの冷水+1mL 10x DAB溶液)を調出します。
  4. 新たに調製した1x DAB溶液(ステップ2.3)の500μLを加え、反転光顕微鏡で明るい茶色の汚れが見えるまで約5~45分間氷の上でインキュベートします(図1A)。
  5. DAB溶液を静かに取り出し、1mLの冷たい0.1Mカコダイレートバッファーをそれぞれ10分間洗い出します。
  6. 位相コントラスト反転顕微鏡(または明視野光顕微鏡)を使用して、100倍以上の倍率でDAB染色を可視化します。マーカー ペンを使用して、対象領域 (ROI) が配置されているガラスの下部にマークを付けます (図 1B,C)。

3. EMブロックのサンプル調製

  1. ステップ2.1-2.6に記載されているように細胞培養およびDAB染色を行う。
  2. 2%の1 mLでサンプルを修正した後、4°Cで1時間のOsO4を減少させます。
    注意:OsO4の煙は非常に有毒です。換気ヒュームフードの下ですべての作業を実行します。
  3. ステップ 3.2 の間に新しい TCH ソリューション (表1) を準備し、0.22 μm フィルターを通過します。
    注意:TCHの煙は非常に有毒です。換気ヒュームフードの下ですべての作業を実行します。
  4. 固定剤を取り出し、室温(RT)でそれぞれ5分間蒸留水の1 mLで3回すすいでください。
  5. RTで20分間、予め調製および濾過されたTCH溶液の1mLに細胞を置きます。
  6. RTでそれぞれ5分間、蒸留水1mLで細胞を3回すすいでください。
  7. RTで30分間蒸留水中の2%の一三酸化オスミウムの1mLに細胞を2回露出させる。
  8. 固定液を取り除き、RTでそれぞれ5分間蒸留水の1 mLで3回すすいで、1%のウラニル酢酸(水性)の1mLを加え、暗闇の中で4°Cで一晩放置する。
  9. RTでそれぞれ5分間蒸留水の1mLで細胞を3回洗います。
  10. 予め暖かいウォルトンの鉛アスパラギン酸溶液(表1)を60°Cのオーブンで30分間使用します。
  11. 予め温めた鉛アスパラギント溶液の1 mLを加えてウォルトンの鉛アスパラギント溶液で細胞を染色し、60°Cで30分間オーブンに入れます。
  12. RTでそれぞれ5分間、蒸留水1mLで細胞を3回すすいでください。
  13. 2-mLエタノールアリコート(50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%)の等級シリーズでインキュベートRTでそれぞれ20分間。
  14. エタノールをデカントし、3:1エタノールの1mLで30分間インキュベートする:低粘度埋め込み混合培地をRTに入れ込む。
  15. 培地を取り出し、1:1エタノール:低粘度埋め込み混合培地の1 mLを加える。RTで30分間インキュベートします。
  16. 培地を取り出し、1:3エタノール:低粘度埋め込み混合培地の1 mLを加えます。RTで30分間インキュベートします。
  17. 培地を取り出し、100%低粘度の1mLを加えて、一晩インキュベートします。
  18. サンプルを100%低粘度埋め込み混合物に埋め込み、60°Cで24時間インキュベートします。
  19. 超マイクロトームを使用して90nmの厚さのセクションを準備します。
  20. 200 kV で TEM の下のグリッドを観察します。

4. SEMイメージング用インジウムスズ酸化物コーティングカバースリップのシリアル断面と取り付け

  1. 基板の調製
    1. イソプロパノールで30~60sの優しい撹拌により、インジウムスズオキシド(ITO)コーティングガラスカバースリップ(22mm x 22mm)を洗浄します。
    2. カバースリップを取り除き、余分なイソプロパノールを排出し、乾燥するまでほこりのない環境に残します。
    3. プラズマコーターを使用して、ITOコーティングされたガラスカバーリップを1分間光放電で処理します。
      注:プラズマ活性化は、基板表面に親水性特性を付与します。これは、セクションが基板に取り付けられているときにセクションのしわの形成を防ぐために、基板上の水の非常に薄いフィルムを作成します。
    4. ITOコーティングされたガラスカバーを基板ホルダーに差し込み、ナイフボートに入れます。
  2. サンプルブロックのトリミングとシリアル断面
    1. サンプルブロックを超マイクロトームのサンプルホルダーに挿入し、トリミングブロックにセットします。
    2. カミソリブレードを使用して、ターゲット位置の周囲にあるすべての余分な樹脂を取り除きます(ステップ2.6、図1D-Gで識別)。ブロック面の形状は台形または長方形にする必要があります。先頭エッジと末尾エッジは絶対に平行でなければなりません(図 1H,I)。
    3. サンプルホルダーをウルトラマイクロトームのアームに挿入し、ダイヤモンドナイフをナイフホルダーに入します。ITOガラスカバーをリボンキャリアに差し込み、ハンドルでキャリアをクランプします(図1J)。リボンキャリアをナイフボートにセットし、濾過された蒸留水でナイフボートを満たします(図1K)。
    4. ホルダーのハンドルを慎重に押して、ITOガラスの端をナイフに近づけることで、ナイフのスライドでキャリア位置を調整します(図1L)。
    5. 断面を切断した後、断面プロセスを停止し、チューブのクランプスクリューをゆっくりと開き、水のボート(毎秒1滴の水の流量)を排出します。
    6. リボン回収プロセスを完了した後、クランプ装置のハンドルで基板を取り外し、リボンを乾かします(図1M)。

5. SEMでのイメージングとSEMイメージスタックの位置合わせ

  1. ITOコーティングされたカバースリップを粘着カーボンテープでアルミスタブに取り付けます。粘着カーボンテープでガラス表面と表面を密封し、10nmの厚い炭素層(図1N)でコーティングします。
  2. 5 kVの低加速度電圧でのフィールド放出SEMのITOコーティングされたカバースリップと、BSEの効率的な収集に適した作業距離を観察します。
  3. 仮想スタックオプションを使用して、シリアルイメージをイメージ J ソフトウェア (Fiji)13に読み込みます。新しい TrakEM14を開き、イメージ スタックを TrakEM にインポートします。マウスの右ボタンをクリックし、整列メニューを選択します。
  4. 次に、イメージ範囲 (最初のイメージから最後のイメージまで) を選択します。自動位置合わせを終了し、整列したデータセットを保存し、エクスポートを選択して、選択したイメージ範囲 (最初のイメージから最後のイメージまで) からフラット イメージをコンパイルします。最後に、画像 J メイン メニューにフラット イメージ データを AVI 形式で保存します。
    注:補足ムービー 1と補足ムービー 2は、それぞれ SEM イメージ スタックとトリミングされたイメージ スタックを示します。

6. 連続画像からのミトコンドリアとERのセグメンテーション

  1. IMOD15ソフトウェアで3dmodを起動し、画像ファイルを開きます。
  2. ZaP ウィンドウで、マウスの中央ボタンを使用してミトコンドリアと ER の輪郭を描画します。
  3. セグメント化されたボリュームを視覚化するには、[モデルビュー] ウィンドウ (補足ムービー3) を開きます。

結果

図 1は、このプロトコルのスケジュールとワークフローについて説明します。プロトコルは7日間必要です。ただし、SEM イメージングに費やされる時間によっては、この値が増加する可能性があります。細胞透過のために、細胞の合流は、グリッドプレート全体の底部を覆わないように制御されるべきである(図1A)。高い細胞密度は、光顕微鏡およびEM観察の間に目的?...

ディスカッション

EMを用いたナノメートル分解能で特定のタンパク質の細胞局在を決定することは、タンパク質の細胞機能を理解するために重要です。一般に、EMを介した標的タンパク質の局在化を研究する2つの技術がある。一つは、1960年からEMで使用されている免疫金技術であり、もう一つは最近開発された遺伝子組み換えタグ16を用いた技術である。従来の免疫ゴールド技術は、標識タン...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

本研究は、科学・ICT省(19-BR-01-08)の助成を受けた韓国脳研究所(19-BR-01-08)と、韓国政府(MSIT)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けたKBRI基礎研究プログラム(No)の支援を受けています。2019R1A2C1010634) SCO1-APEX2とHRP-KDELプラスミドは、ヒョンウ・リー(ソウル大学)によって親切に提供されました。TEMデータは、KBRIの脳研究コア施設で取得されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
GlutaraldehydeEMS16200Use only in fume hood
ParaformaldehydeEMS19210Use only in fume hood
Sodium cacodylateEMS12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solutionEMS16320Use only in fume hood
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Uranyl acetateEMS22400Hazardous chemical
Lead citrateEMS17900
35mm Gridded coverslip dishMattekP35G-1.5-14-CGRD
Glow dischargerPelcoeasiGlow
Formvar carbon coated Copper GridTed Pella01805-F
Hydrochloric acidSIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
GlycineSIGMAG8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)SIGMAD8001Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solutionMerck107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrateSIGMAP3289
0.22 um syringe filterSartorius16534
ThiocarbonyldihydrazideSIGMA223220Use only in fume hood
Potassium hydroxideFluka10193426
L-aspartic acidSIGMAA9256
EthanolMerck100983
Transmission electron microscopyFEITecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslipsSPI06489-ABfragil glass
IsopropanolFisher BioreagentsBP2618-1
Diamond knifeLeicaAT-4
Inveted light microscopyNikonECLipse TS100
Scanning electron microscopyZeissAuriga

参考文献

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