Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

Resumen

El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Resumen

El repertorio de anticuerpos humanos representa una fuente en gran medida sin explotar de posibles anticuerpos terapéuticos y biomarcadores útiles. Si bien los métodos computacionales actuales, como la secuenciación de próxima generación (NGS), producen enormes conjuntos de datos sobre el repertorio de anticuerpos a nivel de secuencia, se requieren datos funcionales para identificar qué secuencias son relevantes para un antígeno o conjunto de Antígenos. Aquí, describimos un método para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica (PPBM) de un donante de sangre humano. Este método utiliza un enriquecimiento inicial de células B maduras y requiere una combinación de marcadores de células fenotípicas y proteína saqueada fluorescentemente para aislar las células de memoria B de IgG a través de la citometría de flujo. Las regiones variables de cadena pesada y ligera se clonan y se vuelven a examinar. Aunque se limita al compartimiento de celdas B de memoria, este método aprovecha la citometría de flujo para interrogar millones de celdas B y devuelve secuencias de cadena pesadas y ligeras emparejadas desde una sola celda en un formato listo para la expresión y confirmación de especificidad. Los anticuerpos recuperados con este método pueden ser considerados para el potencial terapéutico, pero también pueden vincular la especificidad y la función con enfoques bioinformáticos para evaluar el repertorio de células B dentro de los individuos.

Introducción

Los anticuerpos son una clase creciente de moléculas terapéuticas, y el repertorio de células B existente en cualquier ser humano es una fuente potencial de tales anticuerpos. Cuando se recuperan de un donante humano, no requieren adaptación o "humanización", pasos necesarios para los anticuerpos generados en otros sistemas animales. Existen varios métodos para la identificación y aislamiento de anticuerpos humanos, incluyendo la activación y proliferación de células B¹, inmortalización a través de la transformación del EBV^2,3, y la generación de líneas celulares de hibrioma^{4 ,5}. Sin embargo, todos estos métodos requieren un cultivo celular extenso para detectar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos. La información sobre el repertorio de anticuerpos humanos se ha ampliado enormemente con el desarrollo de la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS), lo que permite la identificación de cantidades masivas de secuencias individuales presentes en las muestras de los donantes. Sin embargo, debido a que NGS produce una visión agnóstica de todas las secuencias presentes, no permite la identificación y aislamiento de anticuerpos específicos de antígenos, especialmente en el caso de anticuerpos raros o de baja frecuencia.

El propósito del método "BSelex" es identificar anticuerpos específicos de antígenos de células mononucleares de sangre periférica circulante en donantes humanos, y aislar y recuperar las secuencias de estos anticuerpos para su posterior análisis. Este método utiliza citometría de flujo y clasificación celular para aprovechar el receptor de células B (BCR) expresado en la superficie de las células B de memoria. Millones de células B se pueden analizar para la especificidad del antígeno a través de la citometría de flujo antes de que se inicien los métodos de biología molecular de bajo rendimiento. La identificación de cadenas pesadas y ligeras emparejadas no es posible en la mayoría de los métodos NGS, que analizan las secuencias celulares a granel. En el método que describimos aquí, las células se aíslan individualmente, y la recuperación emparejada de secuencias de cadena pesadas y ligeras es posible, lo que permite la clonación directa y la expresión del IgG completo.

Protocolo

El uso de muestras de voluntarios humanos siguió protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Instituto de Investigación Scripps. Se obtuvo el consentimiento informado de los donantes antes de la donación de sangre.

1. Preparación de reactivos

1. Células mononucleares de sangre periférica (PPB)
   1. Recuperar células mononucleares de sangre periférica de donantes humanos normales mediante el aislamiento Decoll-Plaque Plus. Crioconserva a 50 millones de células/ml en suero bovino fetal al 90% (FBS) y 10% sulfóxido de dimetil (DMSO). Congele las células a -80 oC y transfiera a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
2. Etiquetado de péptidos de antígeno objetivo para la clasificación
   1. Generar u obtener péptidos específicos de la proteína diana (hasta 70 residuos de largo) con una biotina terminal.
   2. Etiqueta 4 nmol de cada péptido biotinylado individual con streptavidina unida covalentemente a PE (R-phycoerythrin) o APC (alophycocyanin) en tubos separados. Prepárese utilizando una relación molar de 9:1 péptido a estreptavidina (SA), con una concentración final de aproximadamente 3,2 m para SA-PE y 5,7 m SA-APC. Preparar los tetrámeros de biotina como un control negativo.
   3. Incubar cada mezcla de péptidos durante la noche, en la oscuridad, a 4oC con mezcla lenta.
   4. Elimine el fluoróforo sin ataduras pasando péptidos etiquetados a través de microcolumnas que contengan cuentas de poliacrilamida.
   5. Conservar los tetrameros de péptidos hasta 2 meses a 4oC.

2. Clasificación de celdas

1. Al menos 1 h hasta 16 h antes del aislamiento CD22+, descongelar los PPC del donante y dejar reposar a 37 oC.
   1. Retire los viales de PMI congelados del congelador y transfiera inmediatamente a un baño de agua de 37 oC. Cuando los viales estén casi desconsados, transfiera al área de trabajo.
   2. Transfiera el contenido de cada vial a un tubo de 50 ml que contenga un medio precalentado (manteniendo separados a los donantes). Añadir medio a un volumen final de 50 mL. Mezcle suavemente el contenido.
   3. Centrífuga a 370 x g durante 6 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en 15 ml de RPMI completa n.o de fuego medio y realice un recuento de células.
   4. Ajuste la concentración celular a 2,0 x 10⁷ celdas/ml con un medio completo rpmI, y transfiera las células a un matraz T75 o más grande e incuba a 37 oC durante al menos 1 h y hasta 16 h para permitir el tiempo de recuperación de las células desconadas.
   5. Recoger las células (agrupación si se desea) y centrifugar a 370 x g durante 6 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 5 mL de tampón MACS helado (PBS, pH 7.6 que contiene 0.5% BSA y 2 mM EDTA), lleve a 50 mL con el buffer MACS y realice un recuento de células.
   6. Centrifugar las células a 400 x g durante 7 min a 4 oC.
   7. Aísle las células CD22⁺ B mediante una selección positiva a través de la captura en microperlas CD22. Utilice el buffer MACS para todos los lavados. Recuento y centrífuga 400 x g durante 7 min a 4oC. La recuperación esperada es del 5-10% de la población total de PBMC.
   8. Resuspenda las células a 40 millones por mL FACS buffer (Tris buffer, pH 8.0 que contiene 0.5% BSA y 2 mM EDTA) y proceda con la tinción celular de los donantes individualmente o como un pool.
2. Células de mancha para la clasificación de células B de memoria
   1. Retire una alícuota de células para la configuración del citómetro y la compensación para cada uno de los fluoróforos de etiquetado utilizados. Incluya celdas no retenidas como control.
   2. Calcular el volumen de tinción final para el número de CD22⁺ células obtenidas (manchando 2 millones por 100 l).
   3. Agregue marcadores extracelulares para las células B (CD19-PerCP-Cy5.5), IgG (IgG-FITC) y el compartimento de memoria (CD27-PECy7) según las recomendaciones de dilución de los fabricantes, y mezcle suavemente. Aliquot 10⁷ células en un tubo de 1,5 ml para el control negativo y transferir las células restantes a un tubo de 15 ml.
   4. Añadir los tetrámeros biotina-SA de doble etiqueta al tubo de control negativo a una concentración final de 36 nM cada uno para PE y APC multiplicado por el número de péptidos en el tubo de clasificación y llevar el volumen a 0,5 ml final con tampón FACS (por ejemplo, 10 péptidos x 36 nM -360 nM).
   5. Agregue los tetrámeros de péptidos al tubo de clasificación a 36 nM cada uno para PE y APC y lleve las células a 2x10⁶ por 100 l con tampón TBS. Incubar a 4oC en la oscuridad y con rotación suave durante 30-60 min.
   6. Lavar 2x a 4oC, 400 x g, 7 min, retirando una alícuota para contar antes del último lavado. Filtre las celdas con tubos de tapa de filtro de 5 ml. Añadir la mancha DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) a una concentración final de 0,3 m justo antes de clasificarla como marcador de la integridad de la membrana celular.
3. Clasificación de células únicas mediante citometría de flujo
   1. Prepare 48 pozos de placas PCR de 96 pocillos para la clasificación.
      1. Preparar una mezcla maestra: (2 l de tampón RT de 10x, 0,5 ml de inhibidor de la RNase, 7,5 ml de agua estéril de grado PCR) por muestra. Aliquot 10 l por pocto, cubrir y almacenar a 4 oC hasta que esté listo para la clasificación.
   2. Ejecute el control negativo en el clasificador de celdas, analizando toda la muestra.
      1. Establezca puertas de citometría de flujo para aislar las poblaciones de celda adecuadas para la clasificación de una sola celda.
         1. Trazar el área FSC vs el área SSC y establecer la puerta R1 para aislar los linfocitos.
         2. Trazar la altura FSC contra la anchura FSC y establecer la puerta R3 para excluir los dobletes FSC.
         3. Trazar la altura de SSC frente a la anchura de SSC y establecer la puerta R4 para excluir los dobletes SSC.
         4. Trazar altura SSC vs DAPI y establecer Puerta R5 para aislar celdas vivas (DAPI^-).
         5. Trazar IgG vs CD19 y establecer la puerta R6 para aislar las células IgG⁺ B (CD19⁺ IgG⁺).
         6. Trazar IgG vs CD27 y establecer la puerta R7para seleccionar las celdas de memoria B (CD27 alto).
         7. Trazar Antígeno-PE (Ag-PE) vs antígeno-APC (Ag-APC) y establecer la puerta R8 como un cuadrante Ag-PE⁺/Ag-APC⁺ con un número bajo de eventos en la puerta doble positiva.
   3. Recoja un número igual de células de memoria de la muestra de antígeno positivo (Ag⁺) para la determinación de la señal al ruido.
   4. Ordene las células individuales que tengan el fenotipo CD19⁺ CD27⁺ Ag-PE⁺ Ag-APC⁺ (Puerta R8) en placas PCR preparadas de 96 pocillos.
   5. Cubra las placas con almohadillas de cinta de aluminio, centrífuga durante 1 min a 400 x g, y guárdelas a -80 oC para clonación futura.

3. Clonación de células únicas

1. Reacciones de transcripción inversas
   1. Retire la placa de clasificación de celda B única de 80 oC. Descongelar sobre hielo durante 2 min. Gire la placa durante 2 min a 3.300 x g al contenido de la piscina en la parte inferior de los pozos antes de abrir.
   2. Prepare una mezcla maestra dNTP/buffer con un 10% de detergente no iónico y oligo(dT) como imprimación inversa. Agregue la mezcla enzimática a cada pocal que contenga la célula única y NO MEZCLAR.
   3. Incubar 5 min a 65oC. Añadir la mezcla maestra de enzimas que contenga 100 mM de TDT, inhibidor de la RNase y enzima transcriptasa inversa para llevar el volumen total a 20 l. Incubar 10 min a 50 oC, luego 10 min a 80 oC.
   4. Transferencia al hielo antes de iniciar los pasos de PCR
2. Reacciones de PCR anidadas de varios pasos
   1. Las reacciones PCR anidadas separadas se utilizan para la amplificación de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC).
   2. Para la primera ronda de amplificación de PCR (paso I), utilice un conjunto de imprimaciones delanteras y una sola imprimación inversa para amplificar las regiones variables HC y LC en reacciones pcR separadas (Figura2). Por diseño, el grupo de imprimaciones delanteras amplificará un gran porcentaje de secuencias de directriz germinal (L) y la imprimación inversa es específica de las regiones constantes aguas abajo de cada cadena, incluyendo tanto el kappa (o) como el lambda (o) para las cadenas ligeras¹⁶.
      1. Utilice 2,5 l de producto cDNA como plantilla para cada reacción de PCR (paso I). Añadir imprimaciones a la concentración de reacción final de 1 M para cada uno. El doble del tampón de 10x de la polimerasa a una concentración de 2x, lleve el volumen final a 25 s por reacción. Ejecuta las reacciones de LOS PCR de HC utilizando [94 oC/4 min; 94 oC/15 s, 55 oC /20 s, 68 oC/60 s; 68 oC/3 min] durante 50 ciclos. Ejecuta las reacciones de LA PCR LC utilizando [98 oC/4 min; 98 oC /15 s, 72 oC /20 s, 72 oC/60 s; 72 oC/3 min] para 50 ciclos.
   3. Utilice 2,5 l del producto Paso I como plantilla para cada reacción de PCR (Paso II). Agregue el grupo de imprimaciones de avance específicas para la región del marco 1 de HC y LC (o y ) y un grupo de imprimaciones inversas específicas para la región de unión de cada cadena de anticuerpos. Doble el búfer de polimerasa 10x a 2x concentración, y ejecute reacciones PCR 50 ciclos cada uno utilizando los mismos parámetros que el paso I.
   4. Ejecuta las reacciones de PCR completadas en un gel de agarosa al 1% para visualizar golpes de amplificación positivos. Recuperar amplicones emparejados (tanto de cadena pesada como ligera de la misma célula) y aislar a través de la extracción de gel. Determine la concentración de fragmentos de ADN a través de OD₂₆₀ para cálculos precisos de la mezcla de ligación.
   5. Combine fragmentos recuperados de cadenas pesadas y ligeras con un fragmento de vinculador y la columna vertebral del vector de expresión utilizando una reacción de ligadura de 4 fragmentos utilizando un kit comercial.
   6. Transforme las reacciones de ligadura en bacterias químicamente competentes utilizando un kit comercial. Una vez chapado en placas antibióticas, añadir 4 ml de medios de crecimiento (con antibiótico) al cultivo de transformación restante, e incubar 37 oC durante la noche a 250 rpm. Esta es la "cultura de la mezcla de ligación".
   7. Preparar el ADN miniprep de los cultivos de mezcla de ligación durante la noche utilizando un kit comercial, y determinar la concentración de ADN plásmido resultante.

4. Pantalla ELISA para confirmación de la especificidad del antígeno

1. Transfectar 10 g de ADN mini-prep con reactivo catiónico a base de lípidos en 10 ml de suspensión 293 células, e incubar durante 3-4 días a 37 oC (8% CO₂) mientras se rota a 125 rpm. Para la cosecha, el cultivo de centrífugas 10 min a 1.000 x g y recuperar medios clarificados.
   1. Mida la concentración de IgG en los sobrenatantes a través de la afinidad con la proteína A.
   2. Pruebe cada IgG (en supernadante) a 20 g/ml mediante un ensayo adsorbente ligado a enzimas (ELISA) contra los péptidos individuales utilizados para la clasificación, capturados en una placa de estreptavidina o actina como un control negativo. Utilice un anticuerpo secundario anti-humano peroxidasa de cabra contra IgG Fab humano para detectar clones recombinantes. Después de la resta del fondo, OD > 0.5 se define como pantalla positiva.
   3. Confirme los golpes positivos de la pantalla realizando un ELISA adicional, utilizando diluciones de sobrenadante IgG para generar una curva de concentración a partir de 20 g por ml, y trazando contra OD para cada antígeno que muestre reactividad en la pantalla inicial ELISA.

Resultados

Este método cubre un proceso de varios pasos para aislar anticuerpos específicos de antígenos de donantes humanos. En los datos representativos que se muestran aquí, las células fueron incubadas con un conjunto de péptidos etiquetados fluorescentemente que representan varios dominios diferentes de la proteína tau, incluyendo péptidos fosforilados para imitar sitios de fosforilación putativa. Estos péptidos se utilizaron como "cebo" para identificar las células que son reactivas con epítopos de tau de interés. En preparación para la clasificación, se utilizó un panel de marcadores fenotípicos con etiqueta fluorescente para identificar diferentes poblaciones celulares dentro de la población de células B enriquecida. Se ideó una serie de puertas de citometría para aislar las celdas B de memoria de destino (Figura 1). Los linfocitos se aislaron en función de su tamaño celular y granularidad utilizando gráficas de dispersión hacia adelante (FSC) y dispersión lateral (SSC) en la citometría de flujo^6,7. Después de la exclusión de múltiples células ("dobletes") y células muertas, los marcadores fenotípicos permitieron la segregación de las células IgG⁺ memoria B vía IgG, CD19 (célula B) y CD27 (memoria). En este enfoque, el marcador CD27 no se distribuye en dos poblaciones discretas, por lo que el 45% superior de las celdas de expresión CD27^se incluyen para la puerta final. Finalmente, las células doblepositivas para los fluoróforos APC y PE se distribuyen en el cuadrante superior derecho del gráfico de medición, lo que indica reactividad a ambas versiones etiquetadas de péptidos. Las células que cayeron dentro de la puerta dibujada fueron aisladas y clasificadas en pozos individuales de una placa de 96 pocillos. El uso de antígeno con dos etiquetas diferentes aumenta la relación señal-ruido y reduce el número de falsos positivos en el proceso de biología molecular posterior. Las celdas ordenadas representaban aproximadamente el 0,1% de las celdas B de memoria en la puerta final y el 0,001% de la muestra de celda inicial.

La primera lectura de la clonación de una sola célula es la confirmación de la amplificación de las respectivas cadenas variables pesadas y ligeras (Figura2). Dado que se desea una recuperación emparejada de ambos amplicones, las reacciones PCR se evalúan una al lado de la otra en gel de agarosa, y los pares emparejados se extircan del gel y los fragmentos de ADN extraídos. La eficiencia típica de amplificación es 30-50% de cadena pesada y 50-70% de cadena ligera (kappa). La recuperación de amplicons emparejados suele estar entre un 25-40% de eficiencia. Estas eficiencias varían entre las agrupaciones de donantes, y los datos representativos (Figura3) son un ejemplo de amplificación muy eficiente de 24 células individuales (42% de recuperación emparejada). Después de la clonación de IgG, el vector de expresión IgG se transinfecta en células de suspensión de riñón embrionario humano (HEK-293), que se utilizan para maximizar la expresión. El uso de un medio libre de suero reduce las proteínas contaminantes de la preparación de anticuerpos recombinantes y ayuda a minimizar el ruido en ensayos de unión posteriores. Los anticuerpos recuperados se examinan contra el panel original de péptidos tau y son puntuados para su reactividad por ELISA (Figura4). Se utiliza un umbral inicial de D.O. 0,5 por encima del fondo para indicar la reactividad positiva del antígeno, y la proteína de la actina se utiliza como un control para la unión no específica. Si los pasos de citometría de flujo y clasificación utilizan un grupo mixto de péptidos, el ELISA de cribado es el primer paso para desconvolucionar las reactividades específicas de los IgG recuperados. Tres de los 10 IgG analizados demostraron reactividad contra el péptido CBTAU22.1 fosforilado, y uno fue reactivo a CBTAU27.1 no fosforizado (Figura4A). Se completó una confirmación adicional utilizando una curva de concentración de las mismas muestras de anticuerpos recombinantes contra los péptidos identificados en la pantalla inicial, y un péptido adicional como control negativo (Figura4B). Por cada golpe positivo, un clon de plásmido individual fue aislado del grupo transformado y reconfirmado por el mismo método ELISA. Sólo se muestra el clon 34 los datos presentados, y aunque se confirmó la reactividad a CBTAU27.1 no fosforilado, también se observó una unión de afinidad más baja con el péptido 27,1 fosforilado (Figura4C).

Figura 1 : Aislamiento de células únicas reactivas de antígeno a través de citometría de flujo. (A) Se muestra una gráfica representativa donde la población de linfocitos estaba contenida dentro de la puerta dibujada. (B) Puertas basadas en dispersión hacia delante y hacia los lados (FSC-height v FSC-width (R3); SSC- altura v SSC- ancho (R4)) se utilizaron para excluir dobletes. Solo las celdas dentro de las puertas dibujadas se evaluaron en parcelas posteriores. Las células DAPI⁺ se consideraron muertas y excluidas (R5). En este experimento, se interrogaron 3.7 x 10⁷ células "vivas". La mayoría de las células vivas eran células B (CD19⁺), e IgG⁺ células (4,66%) fueron aislados de esta población (R6). El 43,2% superior de las celdas de memoria CD27⁺-expressing se incluyeron en la puerta de selección (R7). (C) El cuadrante 2 (Q2) contenía células reactivas a ambos antígenos etiquetados (péptido-APC v péptido-PE), y estas células se clasificaron y recuperaron individualmente en una placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : La amplificación de PCR recupera la secuencia variable pesada y ligera de IgG para la clonación. (A) Las regiones variables de cadena pesadas (VH) y ligeras (Vk o Vl) se recuperan mediante reacciones PCR anidadas. Las imprimaciones de paso I amplifican hacia delante desde la secuencia de directriz nativa y se invierten desde dentro de la región constante. Múltiples flechas representan un grupo de entre 7-12 imprimaciones, que se utilizan para asegurar una amplia cobertura de posibles líneas germinales. Las imprimaciones del paso II están anidadas, específicas de los extremos extremos del marco de lectura abierto variable, y agregan secuencia a los extremos de los amplicons que son homólogos a la secuencia adyacente en el vector de expresión. (B) El vinculador consiste en la cadena de luz constante (Ck o Cl), seguida por el promotor de la cadena pesada y una secuencia de péptidos de señal no nativos. Los amplicons, el vinculador y la columna vertebral del plásmido se ligan simultáneamente a través de una secuencia homóloga superpuesta generada durante la amplificación de PCR Paso II y se aíslan como un plásmido intacto. Las cadenas pesadas y ligeras recombinantes en el vector de expresión final son impulsadas por promotores de CMV independientes (e idénticos), y se traducen como proteínas separadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Los amplicones de cadena variable pesada y ligera de IgG se recuperan de células individuales. Las reacciones de PCR anidadas (Paso II) se cargaron directamente en un gel de agarosa del 1% y se visualizaron. Las reacciones de PCR de cadena pesada (H) y cadena ligera kappa (L) de la misma célula se cargaron en pozos adyacentes, por lo que se observaron fácilmente los amplicones emparejados. Los productos exitosos de cadena pesada y ligera son aproximadamente 400 bp y 350 bp respectivamente. La recuperación exitosa de los amplicons emparejados se denotan con un (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : La especificidad del antígeno se confirma a partir de IgGs recombinantes. Los plásmidos que contienen las secuencias de cadena pesadas y ligeras recuperadas se transinfectan en células HEK para su expresión. Después de cuatro días, ELISA evalúa los anticuerpos recombinantes para su reactividad. (A) La concentración de IgG en los medios clarificados se midió y se diluyó a 20 g/ml. El grupo de péptidos utilizados para la clasificación se evaluó individualmente utilizando 40 pmol por pozo en placas de estreptavidina. Todos los IgG fueron probados en pozos duplicados. (B) Los clones que mostraban la medición OD450 >0.5 fueron reevaluados (Clones #32, #34, #35) utilizando pasos de dilución 1:5 contra los péptidos identificados en la pantalla. (C) Una vez confirmado como un éxito, un solo clon plásmido fue aislado del clon #34 transformadas ligaduras, transfectó y reconfirmado por ELISA. Lo mismo se hizo para los clones #32 y #35 (datos no mostrados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El método presentado aquí combina citometría de flujo y clonación de una sola célula, y los métodos que describimos aquí se basan en métodos previamente desarrollados por Tiller y colegas^11. Su trabajo describe la recuperación y clonación de anticuerpos monoclonales con el fin de estudiar el repertorio de células B en humanos a nivel de células individuales. Hemos adaptado los principales componentes de su proceso para permitir la recuperación de anticuerpos monoclonales específicos de antígenos de una población de células B de memoria, incluida la estrategia de imprimación de amplificación de varios pasos. La principal modificación es la adición de antígeno etiquetado "cebo". Se han realizado adaptaciones adicionales al protocolo publicado, incluyendo (pero no limitado a) modificar la columna vertebral del vector de clonación en un plásmido de expresión único, cobertura de imprimación adicional del repertorio germinal (tanto secuencia de líder como marco 1), transfección de células HEK293 de suspensión para mayor expresión, y el uso de polimerasas de alta fidelidad durante la amplificación de PCR.

Para los métodos descritos aquí, los pasos más críticos están cerca de la transición entre la citometría de flujo y la clonación de una sola célula. En primer lugar, la colocación adecuada de las células individuales ordenadas en la placa es esencial. Establecer el retardo de colocación correctamente en el clasificador es un paso clave. También deben tenerse en cuenta los factores ambientales, como la baja humedad, ya que hemos encontrado que nuestras eficiencias de recuperación disminuyen significativamente a menos que se utilice una pistola estática en las placas de clasificación objetivo. Después de la colocación de la célula, las placas se centrifugan para asegurar que las células han contactado con los 10 l de tampón en la parte inferior de los pozos. Todas estas medidas son fundamentales para que la porción de biología molecular tenga éxito. Si las condiciones son subóptimas para la reacción de transcripción inversa de una sola célula, la amplificación pcR de la acción incluso puede ser difícil. La fuerza del método presentado es la capacidad de interrogar millones de células y ordenar sólo las que coinciden con los criterios de reactividad del antígeno contra el antígeno de elección. Esto requiere que la relación señal-ruido sea lo más alta posible, lo que se hace optimizando las concentraciones de cebo antes de la clasificación. El cebo de doble etiqueta se utiliza para reducir la recuperación de células falsas positivas, que pueden ocurrir si uno de los fluoróforos tiene un fondo alto. El uso de más de un antígeno puede hacer que la señal: optimización del ruido más difícil, pero la capacidad de interrogar múltiples péptidos simultáneamente es otro beneficio de este método.

Cuando las eficiencias de recuperación son bajas, se utiliza un conjunto de imprimaciones de actina anidadas para confirmar que la plantilla cDNA está presente. El inconveniente de este enfoque es que es difícil determinar si no hubo ninguna célula presente en el pozo o la reacción de transcripción inversa falló, dificultando la resolución de problemas. Ocasionalmente ocurrirá lo contrario y las eficiencias son más altas de lo esperado. La recuperación típica para la cadena pesada es entre 30-45% y las cadenas ligeras son más altas, entre 40-60%. Cada reacción PCR (Paso I y II) utiliza 50 ciclos para amplificar desde una sola célula. El alto número de ciclos totales también hace que este método sea susceptible a la contaminación. El análisis de secuencia de los amplicons se puede utilizar para determinar si se ha introducido un contaminante o si se ha logrado legítimamente una tasa de recuperación inusualmente alta.

La utilidad de este método para recuperar anticuerpos humanos nativos contra un antígeno de elección tiene varias limitaciones significativas. En primer lugar, sólo las proteínas solubles que se pueden etiquetar pueden utilizarse como "cebo" para la citometría de flujo. Para los tipos presentados en los resultados representativos, utilizamos una serie de péptidos superpuestos sintetizados a partir de proteína tau, ya que el uso de toda la proteína resultó difícil. El uso de péptidos lineales probablemente no es óptimo, ya que puede limitar la identificación de anticuerpos contra epítopos no lineales o estructurales. Sin embargo, pudimos identificar varios anticuerpos únicos contra el tau y actualmente están siendo sometidos a una evaluación adicional^8,9. Otra limitación es el bajo rendimiento de la recuperación de la biología molecular y la clonación de IgGs. La estrategia de clasificación inicial permite el cribado de millones de células, pero el procesamiento de biología molecular posterior consiste en múltiples etapas. Los esfuerzos de optimización en curso para incorporar tecnologías más recientes, como Gibson Assembly^10, han simplificado varios pasos, pero el cuello de botella sigue siendo la clonación de pares individuales de cadenas pesadas y ligeras.

El método "BSelex" utiliza el BCR expresado en la superficie de las células B de memoria para identificar las células que muestran la reactividad del antígeno, y luego recuperar estas células individuales a través de la citometría de flujo^11,12. Debido a esta dependencia del BCR, el método está restringido al compartimento de la célula B de memoria, y no captura las células secretoras de anticuerpos (ASC) como plasmablasts. Sin embargo, este enfoque puede ser ventajoso para recuperar un repertorio más amplio de inmunoglobinas específicas de antígenos en comparación con los ASC. Los estudios de vacunación contra la gripe demuestran que, si bien los ASC reactivos pueden estar dominados por un pequeño número de clones de células B expandidos, la población de células B específicas del antígeno rara vez es clonal^12. El receptor de células T (TCR) en la superficie de las células T posee similitudes con el receptor de células B en la disposición genética y la recombinación para maximizar la diversidad. Se han desarrollado enfoques de una sola célula similares a los descritos en el método presentado aquí para evaluar el repertorio de células T, incluida la recuperación y clonación de una sola célula de cadenas alfa y beta¹³. Sin embargo, el reconocimiento de TCR requiere que los péptidos sean presentados por moléculas MHC, agregando una complejidad significativa al enfoque de cebo etiquetado para identificar células T específicas de péptidos. A diferencia de las células B, las células T no experimentan maduración de afinidad de toda la región variable, por lo que la identificación de la región CDR3 corta y alguna secuencia de flanqueo es todo lo que se requiere para la identificación y reconstitución. Finalmente, este método describe la identificación de moléculas de IgG utilizando citometría de flujo, pero también es posible utilizar marcadores fenotípicos alternativos para identificar células B de diferentes isotipos.

Actualmente, se están desarrollando métodos para conectar la enorme cantidad de datos recopilados de la secuenciación de próxima generación con el análisis funcional de la especificidad del antígeno, pero estos métodos todavía se están perfeccionando. A pesar de sus limitaciones, el método descrito aquí se ha utilizado para identificar anticuerpos con valor terapéutico potencial para enfermedades infecciosas y no infecciosas^8,14,15, y representa un para recuperar IgGs relevantes específicos de antígenos de los seres humanos, sin una manipulación extensiva de las células B o un cultivo celular extenso.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter	MoFlo		cell sorting
Biotinylated peptides	New England Peptide		Cell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel column	BioRad	#7326223
Streptavidin (R-PE)	Thermo Scientific	SA10041
Streptavidin (APC)	Thermo Scientific	S32362
CD22 MicroBeads, human	Miltenyi	#130-046-401
LS columns	Miltenyi	#130-042-401
Pre separation filters	Miltenyi	#130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19	BD Biosciences	BD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27	BD Biosciences	#560609
FITC mouse anti-human IgG	BD Biosciences	#560952
DAPI	Life Technologies	#D21490
RNaseOUT	Life Technologies	#10777-019
Bovine serum albumin, Fraction V	Sigma	#A4503
RPMI media	Hyclone	#SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum)	Invitrogen	#10082147
Mastercycler Gradient	Eppendorf	Model #6325	PCR machine
PCR 96-well plates	Phenix	MPS-500
PCR Plate mats	Phenix	SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix	Clontech	#639125
Superscript IV First-strand synthesis system	Invitrogen	#18091050
Phusion High Fidelity Polymerase	Thermo Scientific	F-531-L
Platinum polymerase	Invitrogen	#10966108
Nuclease-free water	QIAGEN	#129114
Oligonucleotide primers	IDT	assorted	Primers for all PCR steps
Gel Extraction Kit	QIAGEN	#28706
PCR Purification kit	QIAGEN	#28106
Miniprep Kit	QIAGEN	#27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Gibson assembly
Expi293 Expression Media	Invitrogen	#A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection Kit	Invitrogen	#A14525
Opti-MEM Media	Invitrogen	#31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 System	Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates	Thermo Scientific	#15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area	Corning	#3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody	Jackson Labs	#109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody	Jackson Labs	#115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)	KPL	#52-00-03
TMB Stop Solution	KPL	#50-85-06