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Résumé

La méthode BSelex pour identifier et récupérer les anticorps individuels spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques humaines combine la cytométrie du flux avec pcR à cellule unique et le clonage.

Résumé

Le répertoire des anticorps humains représente une source largement inexploitée d'anticorps thérapeutiques potentiels et de biomarqueurs utiles. Alors que les méthodes de calcul actuelles, telles que le séquençage de prochaine génération (NGS), produisent d'énormes ensembles de données sur le répertoire des anticorps au niveau de la séquence, des données fonctionnelles sont nécessaires pour identifier les séquences pertinentes pour un antigène ou un ensemble particulier de Antigènes. Ici, nous décrivons une méthode pour identifier et récupérer les anticorps antigènes-spécifiques individuels des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs) d'un donneur de sang humain. Cette méthode utilise un enrichissement initial des cellules B matures et nécessite une combinaison de marqueurs de cellules phénotypiques et de protéines fluorescentes pour isoler les cellules de la mémoire B igG par cytométrie de flux. Les régions variables de chaîne lourde et légère sont ensuite clonées et re-examinées. Bien que limitée au compartiment cellulaire de la mémoire B, cette méthode tire parti de la cytométrie du débit pour interroger des millions de cellules B et renvoie des séquences de chaînes lourdes et légères appariées d'une seule cellule dans un format prêt pour l'expression et la confirmation de la spécificité. Les anticorps récupérés avec cette méthode peuvent être considérés pour le potentiel thérapeutique, mais peuvent également lier la spécificité et la fonction avec des approches bioinformatiques pour évaluer le répertoire de cellules B dans les individus.

Introduction

Les anticorps sont une classe croissante de molécules thérapeutiques, et le répertoire existant de cellules B dans n'importe quel humain est une source potentielle de tels anticorps. Lorsqu'ils sont récupérés chez un donneur humain, ils ne nécessitent aucune adaptation ou « humanisation », mesures qui sont nécessaires pour les anticorps générés dans d'autres systèmes animaux. Plusieurs méthodes existent pour l'identification et l'isolement des anticorps humains, y compris l'activation et la prolifération des cellules B1, l'immortalisation via la transformation EBV2,3, et la génération de lignées cellulaires hybridotomes4 ,5. Cependant, toutes ces méthodes exigent la culture cellulaire étendue pour dépister et récupérer des anticorps antigène-spécifiques. L'information sur le répertoire des anticorps humains a été considérablement élargie avec le développement de la technologie de séquençage de prochaine génération (NGS), permettant d'identifier des quantités massives de séquences individuelles présentes dans les échantillons de donneurs. Cependant, parce que NGS donne une vue agnostique de toutes les séquences présentes, il ne permet pas l'identification et l'isolement des anticorps spécifiques à l'antigène, en particulier dans le cas d'anticorps rares ou à basse fréquence.

Le but de la méthode "BSelex" est d'identifier les anticorps spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques circulantes dans les donneurs humains, et d'isoler et de récupérer les séquences de ces anticorps pour une analyse plus approfondie. Cette méthode utilise la cytométrie du débit et le tri cellulaire pour tirer parti du récepteur des cellules B (BCR) exprimé à la surface des cellules de la mémoire B. Des millions de cellules B peuvent être examinées pour la spécificité de l'antigène par cytométrie de flux avant que les méthodes de biologie moléculaire à faible débit ne soient lancées. L'identification à chaîne lourde et légère n'est pas possible dans la plupart des méthodes NGS, qui analysent les séquences cellulaires en vrac. Dans la méthode que nous décrivons ici, les cellules sont isolées individuellement, et la récupération appariée des séquences de chaîne lourde et légère est possible, ce qui permet le clonage direct et l'expression de l'IgG complet.

Protocole

L'utilisation d'échantillons provenant de volontaires humains a suivi des protocoles approuvés par le Scripps Research Institute Institutional Review Board. Le consentement éclairé a été obtenu des donneurs avant le don de sang.

1. Préparation de réactif

  1. Cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC)
    1. Récupérer les cellules mononucléaires périphériques de sang des donneurs humains normaux par l'isolement de Ficoll-Plaque Plus. Cryopreserve à 50 millions de cellules/mL dans 90% de sérum bovin fœtal (FBS) et 10% de sulfoxide de diméthyle (DMSO). Congeler les cellules à -80 oC et les transférer dans l'azote liquide pour le stockage à long terme.
  2. Étiquetage des peptides d'antigène cibles pour le tri
    1. Générer ou obtenir des peptides spécifiques à la protéine cible (jusqu'à 70 résidus de long) avec une biotine terminale.
    2. Étiqueter 4 nmol de chaque peptide biotinylated individuel avec streptavidin covalently attaché à PE (R-phycoerythrin) ou APC (allophycocyanin) dans des tubes séparés. Préparer à l'aide d'un rapport molaire de 9:1 peptide à streptavidin (SA), avec une concentration finale d'environ 3,2 M pour SA-PE et de 5,7 M SA-APC. Préparer les tetramers Biotin comme un contrôle négatif.
    3. Incuber chaque peptide pendant la nuit, dans l'obscurité, à 4 oC avec un mélange lent.
    4. Enlever le fluorophore non lié en passant les peptides étiquetés à travers des microcolonnes contenant des perles de polyacrylamide.
    5. Conserver les tétratiers peptidiques jusqu'à 2 mois à 4 oC.

2. Tri cellulaire

  1. Au moins 1 h jusqu'à 16 h avant l'isolement CD22, décongeler les PBMC des donneurs et laisser reposer à 37 oC.
    1. Retirer les flacons de PBMC congelés du congélateur et les transférer immédiatement dans un bain d'eau de 37 oC. Lorsque les flacons sont presque décongelés, transférer à la zone de travail.
    2. Transférer le contenu de chaque flacon dans un tube de 50 ml contenant un milieu préchauffé (en gardant les donneurs séparés). Ajouter le moyen à un volume final de 50 ml. Mélanger délicatement le contenu.
    3. Centrifugeuse à 370 x g pendant 6 min à température ambiante. Jeter le supernatant, resuspendre les cellules dans 15 ml de milieu complet RPMI et effectuer un compte cellulaire.
    4. Ajuster la concentration cellulaire à 2,0 x 107 cellules/mL avec le milieu complet de RPMI, et transférer les cellules à un flacon T75 ou plus grand et incuber à 37 oC pendant au moins 1 h et jusqu'à 16 h pour permettre le temps de récupération pour les cellules décongelées.
    5. Recueillir les cellules (mise en commun si désiré) et la centrifugeuse à 370 x g pendant 6 min à 4 oC. Jeter supernatant et resuspendre les cellules dans 5 ml de tampon MACS froid par glace (PBS, pH 7,6 contenant 0,5% BSA et 2 mM EDTA), porter à 50 ml avec tampon MACS et effectuer un compte cellulaire.
    6. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 7 min à 4 oC.
    7. Isolez les cellules CD22et B par sélection positive par capture sur les microbilles CD22. Utilisez le tampon MACS pour tous les lavages. Compter et centrifuger 400 x g pendant 7 min à 4 oC. Le rétablissement prévu est de 5 à 10 % de la population totale de PBMC.
    8. Resuspendre les cellules à 40 millions par mL FACS tampon (Tampon Tris, pH 8,0 contenant 0,5% BSA et 2 mM EDTA) et procéder à la coloration cellulaire des donneurs individuellement ou comme un pool.
  2. Cellules de tache pour le tri de cellules de mémoire B
    1. Enlever un aliquot de cellules pour la mise en place du cytomètre et la compensation pour chacun des fluorophores d'étiquetage utilisés. Inclure les cellules non tachées comme un contrôle.
    2. Calculer le volume final de coloration pour le nombre decellules CD22 obtenues (staining 2 millions par 100 L).
    3. Ajoutez des marqueurs extracellulaires pour les cellules B (CD19-PerCP-Cy5.5), IgG (IgG-FITC) et compartiment mémoire (CD27-PECy7) selon les recommandations de dilution des fabricants, et mélangez doucement. Aliquot 107 cellules dans un tube de 1,5 ml pour le contrôle négatif et transférer les cellules restantes à un tube de 15 ml.
    4. Ajouter les tétratiers à double étiquette biotin-SA au tube de commande négatif à une concentration finale de 36 nM chacun pour PE et APC multiplié par le nombre de peptides dans le tube de tri et porter le volume à 0,5 mL final avec tampon FACS (par exemple, 10 peptides x 36 nM-360 nM).
    5. Ajouter les tétratiers peptidiques au tube de tri à 36 nM chacun pour PE et APC et porter les cellules à 2x106 par 100 L avec le tampon de SCT. Incuber à 4 oC dans l'obscurité et avec une rotation douce pendant 30-60 min.
    6. Laver 2x à 4 oC, 400 x g, 7 min, en enlevant un aliquot pour compter avant le dernier lavage. Filtrer les cellules à l'aide de tubes de bouchon de filtre de 5 ml. Ajouter la tache DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) à la concentration finale de 0,3 M juste avant le tri comme marqueur de l'intégrité de la membrane cellulaire.
  3. Tri d'une seule cellule par cytométrie de flux
    1. Préparer 48 puits de plaques PCR de 96 puits pour le tri.
      1. Préparer un mélange maître : (2 l de 10x TAMPON RT, 0,5 l d'inhibiteur de la RNase, 7,5 l d'eau stérile de qualité PCR) par échantillon. Aliquot 10 l par puits, couvrir et conserver à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à trier.
    2. Exécutez le contrôle négatif sur le trieur cellulaire, en analysant l'échantillon entier.
      1. Définir les barrières de cytométrie d'écoulement pour isoler les populations cellulaires appropriées pour le tri d'une seule cellule.
        1. Terrain FSC zone vs SSC zone et définir la porte R1 pour isoler les lymphocytes.
        2. Terrain FSC hauteur vs largeur FSC et définir Gate R3 pour exclure les doublets FSC.
        3. Terrain sSC hauteur vs sSC largeur et définir Gate R4 pour exclure les doublets SSC.
        4. Terrain SSC hauteur vs DAPI et définir Gate R5 pour isoler les cellules vivantes (DAPI-).
        5. Terrain IgG vs CD19 et définir La Porte R6 pour isoler les cellules IgGet B (CD19et IgG).
        6. Terrain IgG vs CD27 et définir Gate R7 pour sélectionner la mémoire B cellules (CD27élevé).
        7. Terrain Antigen-PE (Ag-PE) vs antigène-APC (Ag-APC) et définir laporte R8 comme un Ag-PE /Ag-APC- quadrant avec un faible nombre d'événements dans la porte double positive.
    3. Recueillir un nombre égal de cellules de mémoireà partir de l'échantillon d'antigène positif (Ag) pour la détermination du signal au bruit.
    4. Trier les cellules individuelles ayant le phénotype CD19- CD27- Ag-PE- Ag-APC(Porte R8) dans des plaques PCR de 96 puits préparées.
    5. Couvrir les plaques de plaquettes en aluminium, la centrifugeuse pendant 1 min à 400 x g, et les conserver à -80 oC pour le clonage futur.

3. Clonage à cellule unique

  1. Réactions de transcription inversées
    1. Retirez la plaque de tri de cellules B à partir de 80 oC. Décongeler sur la glace pendant 2 min. Faire tourner la plaque pendant 2 min à 3 300 x g pour mettre en commun le contenu au fond des puits avant de l'ouvrir.
    2. Préparer un mélange maître dNTP/tampon avec 10 % de détergent non ionique et d'oligo (dT) comme amorce inverse. Ajouter le mélange d'enzymes à chaque puits contenant la cellule unique et NE PAS MIX.
    3. Incuber 5 min à 65 oC. Ajouter le mélange de maître d'enzyme contenant 100 mM DeTC, l'inhibiteur de la NAse et l'enzyme de transcriptase inverse pour porter le volume total à 20 l. Incubate 10 min à 50 oC, puis 10 min à 80 oC.
    4. Transfert sur glace avant de commencer les étapes du PCR
  2. Réactions PCR non-étapes
    1. Utilisez des réactions PCR non nichelées séparées sont utilisées pour l'amplification à chaîne lourde (HC) et à chaîne légère (LC).
    2. Pour le premier cycle d'amplification du PCR (étape I), utilisez un pool d'amorces avant et une seule amorce inversée pour amplifier les régions variables HC et LC dans des réactions PCR distinctes (Figure 2). De par sa conception, le pool d'amorces avant amplifiera un grand pourcentage de séquences de leaders germinaux (L) et l'amorce inverse est spécifique aux régions constantes en aval de chaque chaîne, y compris la kappa () et lambda pour les chaînes lumineuses16.
      1. Utilisez 2,5 L de produit d'ADNc comme modèle pour chaque réaction PCR (Étape I). Ajouter des amorces à la concentration de réaction finale de 1 M pour chacun. Doubler le tampon de polymérase 10x à 2x de concentration, porter le volume final à 25 L par réaction. Exécuter les réactions HC PCR en utilisant [94 'C/4 min; 94 'C /15 s, 55 'C /20 s, 68 'C/60 s; 68 'C/3 min] pendant 50 cycles. Exécuter les réactions LC PCR en utilisant [98 c/4 min; 98 'C /15 s, 72 'C /20 s, 72 'C/60 s; 72 'C/3 min] pendant 50 cycles.
    3. Utilisez 2,5 L du produit Step I comme modèle pour chaque réaction PCR (étape II). Ajoutez le pool d'amorces avant spécifiques à la région du cadre 1 de HC et LC et un pool d'amorces inversées spécifiques à la région de jonction de chaque chaîne d'anticorps. Doublez le tampon de polymérase 10x à 2x de concentration, et exécutez des réactions PCR 50 cycles chacun en utilisant les mêmes paramètres que l'étape I.
    4. Exécuter les réactions PCR terminées sur 1% gel agarose pour visualiser les coups d'amplification positive. Récupérer les amplicônes appariés (chaîne lourde et légère de la même cellule) et isoler par extraction de gel. Déterminer la concentration de fragments d'ADN via OD260 pour des calculs précis du mélange de ligature.
    5. Combinez des fragments de chaîne lourds et légers récupérés avec un fragment de maillon et l'épine dorsale du vecteur d'expression à l'aide d'une réaction de ligature à 4 fragments à l'aide d'un kit commercial.
    6. Transformez les réactions de ligature en bactéries chimiquement compétentes à l'aide d'un kit commercial. Une fois plaqué sur des plaques antibiotiques, ajouter 4 ml de support de croissance (avec antibiotique) à la culture de transformation restante, et incuber 37 oC pendant la nuit à 250 tr/min. C'est la « culture du mélange de ligation ».
    7. Préparer l'ADN miniprep des cultures de mélange de ligature de nuit à l'aide d'un kit commercial, et de déterminer la concentration d'ADN plasmide résultante.

4. ELISA Écran pour la confirmation de la spécificité de l'antigène

  1. Transfect 10 g d'ADN miniprep avec réactif à base de lipides cationiques en 10 ml de suspension 293 cellules, et incuber pendant 3-4 jours à 37 oC (8 % CO2) tout en tournant à 125 tr/min. Pour la récolte, la culture centrifugeuse 10 min à 1 000 x g et récupérer les médias clarifiés.
    1. Mesurer la concentration d'IgG chez les supernatants par affinité avec la protéine A.
    2. Testez chaque IgG (en supernatant) à 20 g/mL par essai adsorbent lié aux enzymes (ELISA) contre les peptides individuels utilisés pour le type, capturés sur une plaque de streptavidine ou d'actine comme un contrôle négatif. Utilisez un anticorps secondaire peroxidase anti-humain de chèvre contre l'igG Fab humain pour détecter les clones recombinants. Après la soustraction de l'arrière-plan, OD 'gt; 0.5 est défini comme l'écran positif.
    3. Confirmer les coups positifs à l'écran en effectuant un ELISA supplémentaire, en utilisant des dilutions de Supernatant IgG pour générer une courbe de concentration à partir de 20 g par mL, et en traçant contre l'OD pour chaque antigène montrant la réactivité dans l'écran initial ELISA.

Résultats

Cette méthode couvre un processus en plusieurs étapes pour isoler les anticorps spécifiques aux antigènes des donneurs humains. Dans les données représentatives présentées ici, les cellules ont été incubées avec un pool de peptides fluorescents représentant plusieurs domaines différents de la protéine tau, y compris les peptides phosphorylés pour imiter les sites de phosphorylation putative. Ces peptides ont été utilisés comme « appâts » pour identifier les cellules réactives avec des épitopes tau(s) d'intérêt. En préparation du tri, un panneau de marqueurs phénotypiques étiquetés fluorescents a été utilisé pour identifier différentes populations cellulaires au sein de la population de cellules B enrichie. Une série de barrières cytométries ont été conçues pour isoler les cellules de la mémoire Cible B (Figure 1). Les lymphocytes ont été isolés en fonction de leur taille cellulaire et de leur granularité à l'aide de parcelles de diffusion vers l'avant (FSC) et de dispersion latérale (SSC) dans la cytométrie d'écoulement6,7. Après l'exclusion de cellules multiples («doublets») et de cellules mortes, les marqueurs phénotypiques ont permis la ségrégation des cellules IgGet mémoire B via IgG, CD19 (cellule B) et CD27 (mémoire). Dans cette approche, le marqueur CD27 ne se distribue pas en deux populations distinctes, de sorte que les 45 % supérieurs des cellulesexprimantes CD27 sont inclus pour la porte finale. Enfin, les cellules double-positives pour les fluorophores D'APC et de PE se répartissent dans le quadrant supérieur droit du graphique de gating, indiquant la réactivité aux deux versions étiquetées des peptides. Les cellules qui tombaient à l'intérieur de la porte dessinée ont été isolées et triées en puits individuels d'une plaque de 96 puits. L'utilisation d'antigène avec deux étiquettes différentes augmente le rapport signal-bruit et réduit le nombre de faux positifs dans le processus de biologie moléculaire subséquent. Les cellules triées représentaient environ 0,1 % des cellules de mémoire B dans la porte finale, et 0,001 % de l'échantillon de cellules de départ.

La première lecture du clonage unicellulaire est la confirmation de l'amplification des chaînes variables lourdes et légères respectives (Figure 2). Puisque la récupération appariée des deux amplicons est désirée, les réactions de PCR sont évaluées côte à côte sur le gel d'agarose, et les paires assorties sont excisées du gel et des fragments d'ADN extraits. L'efficacité typique de l'amplification est 30-50% chaîne lourde et 50-70% lumière (kappa) chaîne. La récupération des amplicons appariés est généralement entre 25-40% d'efficacité. Ces gains d'efficacité varient d'un bassin de donneurs à l'autre, et les données représentatives (figure 3) sont un exemple d'amplification très efficace à partir de 24 cellules individuelles (récupération appariée à 42 %). Après le clonage IgG, le vecteur d'expression IgG est transfecté dans les cellules de suspension du rein embryonnaire humain (HEK-293), qui sont utilisés pour maximiser l'expression. L'utilisation du milieu sans sérum réduit les protéines contaminantes de la préparation des anticorps recombinants, et aide à minimiser le bruit dans les essais de liaison ultérieures. Les anticorps récupérés sont examinés par rapport au panneau original de peptides tau et notés pour la réactivité par ELISA (Figure 4). Un seuil initial d'OD - 0,5 au-dessus du fond est utilisé pour indiquer la réactivité positive de l'antigène, et la protéine d'actine est utilisée comme un contrôle pour la liaison non spécifique. Si la cytométrie du débit et les étapes de tri utilisent un bassin mixte de peptides, le criblage ELISA est la première étape de la décongestionnement des réactivités spécifiques des IGG récupérés. Trois des 10 IgGs ont démontré une réactivité contre le peptide CBTAU22.1 phosphorylé, et un a été réactif au CBTAU27.1 non phosphorylé (figure4A). Une confirmation supplémentaire a été complétée à l'aide d'une courbe de concentration des mêmes échantillons d'anticorps recombinants contre les peptides identifiés dans l'écran initial, et d'un peptide supplémentaire comme contrôle négatif (figure 4B). Pour chaque coup positif, un clone plasmide individuel a été isolé de la piscine transformée et reconfirmé par la même méthode ELISA. Seul le clone 34 est présenté, et bien que la réactivité à cBTAU27.1 non phosphorylé ait été confirmée, une liaison d'affinité plus faible a également été observée avec le peptide phosphorylé 27,1 (figure 4C).

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Figure 1 : Isolement des cellules uniques antigènes réactives par cytométrie de flux. (A) Il s'agit d'une parcelle représentative où la population de lymphocytes était contenue dans la porte dessinée. (B) Portes basées sur la diffusion vers l'avant et latérale (FSC-hauteur v FSC-largeur (R3); SSC- hauteur v SSC- largeur(R4)) ont été utilisés pour exclure les doublets. Seules les cellules à l'intérieur des portes dessinées ont été évaluées dans les parcelles suivantes. Les cellules DAPIont été considérées mortes et exclues (R5). Dans cette expérience, 3,7 x 107 cellules « vivantes » ont été interrogées. La majorité des cellules vivantes étaient des cellules B (CD19)et des cellules IgG (4,66 %) ont été isolés de cette population (R6). Les 43,2 % de cellulesde mémoire exprimant cD27 ont été incluses dans la porte de sélection (R7). (C) Quadrant 2 (Q2) contenait des cellules réactives aux deux antigènes étiquetés (peptide-APC v peptide-PE), et ces cellules ont été triées et récupérées individuellement dans une plaque de 96 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : L'amplification PCR récupère la séquence variable igG lourde et légère pour le clonage. (A) Les régions variables de chaîne lourdes (VH) et légères (Vk ou Vl) sont récupérées à l'aide de réactions PCR imisées. Les amorces de l'étape I amplifient vers l'avant à partir de la séquence de leader natif et inversent de l'intérieur de la région constante. Les flèches multiples représentent un pool de 7-12 amorces, qui sont utilisées pour assurer une large couverture des lignées germinales possibles. Les amorces de l'étape II sont nichées, spécifiques aux extrémités du cadre de lecture variable ouverte, et ajoutent une séquence aux extrémités des amplicons qui sont homologues à la séquence adjacente dans le vecteur d'expression. (B) Le maillon se compose de la chaîne lumineuse constante (Ck ou Cl), suivie par le promoteur de la chaîne lourde et une séquence de peptide de signal non indigène. Les amplicons, le linker et l'épine dorsale plasmide sont simultanément ligatés par séquence homologue qui se chevauche ntre générée lors de l'amplification PCR de l'étape II, et isolés comme un plasmide intact. Les chaînes lourdes et légères recombinantes dans le vecteur d'expression finale sont entraînées par des promoteurs indépendants (et identiques) de CMV, et sont traduites en protéines séparées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Les amplicônes à chaîne variable lourde et légère igG sont récupérées à partir de cellules individuelles. Les réactions PCR inogérées (Étape II) ont été directement chargées sur 1% gel agarose et visualisées. Les réactions de LA même cellule ont été chargées dans des puits adjacents dans des puits adjacents, de sorte que les amplicons appariés ont été facilement observés. Les produits à chaîne lourde et légère réussis sont environ 400 bp et 350 bp respectivement. La récupération réussie des amplicons appariés est dénotée par un () Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4 : La spécificité antigène est confirmée à partir d'IGG recombinants. Les plasmides contenant les séquences de chaîne lourde et légère récupérées sont transfectés dans les cellules HEK pour l'expression. Après quatre jours, les anticorps recombinants sont évalués pour la réactivité par ELISA. (A) La concentration d'IgG dans les médias clarifiés a été mesurée et diluée à 20 g/mL. Le bassin de peptides utilisés pour le tri ont été évalués individuellement à l'aide de 40 pmol par puits dans des plaques de streptavidin. Tous les IgG ont été testés dans des puits en double. (B) Les clones qui affichaient la mesure OD450 'gt;0.5 ont été réévalués (Clones #32, #34, #35) à l'aide de 1:5 étapes de dilution contre les peptides identifiés à l'écran. (C) Une fois confirmé comme un succès, un seul clone plasmide a été isolé du clone #34 transformé des ligations, transfected, et reconfirmé par ELISA. La même chose a été faite pour les clones #32 et #35 (données non affichées). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La méthode présentée ici combine la cytométrie du flux et le clonage à cellule unique, et les méthodes que nous décrivons ici, nous avons basé sur des méthodes précédemment développées par Tiller et ses collègues11. Leurs travaux décrivent la récupération et le clonage d'anticorps monoclonaux afin d'étudier le répertoire des cellules B chez l'homme au niveau des cellules individuelles. Nous avons adapté les principales composantes de leur processus pour permettre la récupération d'anticorps monoclonaux spécifiques à l'antigène à partir d'une population de cellules de mémoire B, y compris la stratégie d'amorce d'amplification en plusieurs étapes. La modification majeure est l'ajout de l'antigène étiqueté "appât". D'autres adaptations ont été apportées au protocole publié, y compris (mais sans s'y limiter) la modification de l'épine dorsale du vecteur de clonage en un plasmide d'expression unique, une couverture d'amorce supplémentaire du répertoire germinal (séquence de leader et cadre 1), transfection des cellules DE suspension HEK293 pour une expression plus élevée, et l'utilisation de polymères haute fidélité pendant l'amplification DE PCR.

Pour les méthodes décrites ici, les étapes les plus critiques sont proches de la transition entre la cytométrie du débit et le clonage à cellule unique. Tout d'abord, le placement approprié des cellules simples triées dans la plaque est essentiel. Le réglage du délai de drop correctement sur le trieur est une étape clé. Les facteurs environnementaux, tels que le faible taux d'humidité, doivent également être pris en compte, car nous avons constaté que notre efficacité de récupération diminue considérablement à moins qu'un canon statique ne soit utilisé sur les plaques de tri de la cible. Après le placement cellulaire, les plaques sont centrifuges pour s'assurer que les cellules ont contacté les 10 l de tampon au fond des puits. Toutes ces mesures sont essentielles pour que la partie de biologie moléculaire soit réussie. Si les conditions sont sous-optimales pour la réaction de transcription inverse d'une seule cellule, l'amplification de PCR de même l'actine peut être difficile. La force de la méthode présentée est la capacité d'interroger des millions de cellules et de ne trier que ceux qui correspondent aux critères de réactivité antigène par rapport à l'antigène de choix. Cela exige que le rapport signal/bruit soit aussi élevé que possible, ce qui se fait en optimisant les concentrations d'appâts avant le tri. L'appât à double étiquette est utilisé pour réduire la récupération des cellules faussement positives, ce qui peut se produire si l'un des fluorophores a un arrière-plan élevé. L'utilisation de plus d'un appât antigène peut rendre le signal : l'optimisation du bruit est plus difficile, mais la capacité d'interroger plusieurs peptides simultanément est un autre avantage de cette méthode.

Lorsque l'efficacité de récupération est faible, un ensemble d'amorces d'actine de l'Actine est utilisée pour confirmer la présence d'adncass de modèle. L'inconvénient de cette approche est qu'il est difficile de déterminer s'il n'y avait pas de cellule présente dans le puits ou la réaction de transcription inverse a échoué, ce qui rend le dépannage difficile. À l'occasion, c'est le contraire qui se produira et les gains d'efficacité sont plus élevés que prévu. La récupération typique pour la chaîne lourde est entre 30-45% et les chaînes légères sont plus élevées, entre 40-60%. Chaque réaction PCR (Étape I et II) utilise 50 cycles pour amplifier à partir d'une seule cellule. Le nombre élevé de cycles totaux rend également cette méthode vulnérable à la contamination. L'analyse de séquence des amplicons peut être utilisée pour déterminer si un contaminant a été introduit ou si un taux de récupération anormalement élevé a été légitimement atteint.

L'utilité de cette méthode pour récupérer les anticorps humains indigènes contre un antigène de choix a plusieurs limitations significatives. Tout d'abord, seules les protéines solubles qui peuvent être étiquetées peuvent être utilisées comme « appât » pour la cytométrie du débit. Pour les types présentés dans les résultats représentatifs, nous avons utilisé une série de peptides qui se chevauchent synthétisés à partir de protéines tau, car l'utilisation de la protéine entière s'est avérée difficile. L'utilisation de peptides linéaires n'est probablement pas optimale, car elle peut limiter l'identification des anticorps contre les épitopes non linéaires ou structurels. Cependant, nous avons été en mesure d'identifier plusieurs anticorps uniques contre tau et ceux-ci sont actuellement en cours d'évaluation plus approfondie8,9. Une autre limitation est le faible débit de la récupération de la biologie moléculaire et le clonage des IGG. La stratégie initiale de tri permet le dépistage de millions de cellules, mais le traitement de la biologie moléculaire subséquent se compose de plusieurs étapes. Les efforts d'optimisation en cours pour intégrer de nouvelles technologies, telles que Gibson Assembly10, ont simplifié plusieurs étapes, mais le goulot d'étranglement demeure le clonage des paires individuelles de chaînes lourdes et légères.

La méthode "BSelex" utilise le BCR exprimé à la surface des cellules De mémoire pour identifier les cellules qui présentent une réactivité antigène, puis récupérer ces cellules individuelles par cytométrie d'écoulement11,12. En raison de cette dépendance sur le BCR, la méthode est limitée au compartiment cellulaire de la mémoire B, et ne capture pas les cellules sécrétrices d'anticorps (ASC) telles que les plasmablastes. Cependant, cette approche peut être avantageuse à récupérer un répertoire plus large d'immunoglobines antigène-spécifiques par rapport aux AsC. Les études de vaccination contre la grippe démontrent que même si les ASC réactifs peuvent être dominés par un petit nombre de clones de cellules B élargis, la population de cellules B de mémoire spécifique à l'antigène est rarement clonaque12. Le récepteur des lymphocytes T (TCR) à la surface des lymphocytes T présente des similitudes avec le récepteur des cellules B dans l'arrangement et la recombinaison des gènes afin de maximiser la diversité. Des approches à cellule unique semblables à ce qui est décrit dans la méthode présentée ici ont été développées pour évaluer le répertoire des lymphocytes T, y compris la récupération et le clonage à cellule unique des chaînes alpha et bêta13. Cependant, la reconnaissance du TCR exige que les peptides soient présentés par les molécules de MHC, ce qui ajoute une complexité importante à l'approche d'appât étiquetée pour identifier les lymphocytes T spécifiques au peptide. Contrairement aux cellules B, les lymphocytes T ne subissent pas de maturation d'affinité de toute la région variable, de sorte que l'identification de la courte région CDR3 et une séquence de flanc est tout ce qui est nécessaire pour l'identification et la reconstitution. Enfin, cette méthode décrit l'identification des molécules igG à l'aide de la cytométrie du débit, mais il est également possible d'utiliser d'autres marqueurs phénotypiques pour identifier les cellules B de différents isotypes.

Actuellement, il existe des méthodes en cours de développement pour relier l'énorme quantité de données recueillies à partir du séquençage de prochaine génération avec l'analyse fonctionnelle de la spécificité de l'antigène, mais ces méthodes sont encore en cours d'affinage. Malgré ses limites, la méthode décrite ici a été utilisée pour identifier les anticorps ayant une valeur thérapeutique potentielle pour les maladies infectieuses et non infectieuses8,14,15, et représente un l'approche pour récupérer les IgGs antigènes-spécifiques pertinents des humains, sans manipulation étendue des cellules de B ou de la culture cellulaire étendue.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia et Jeremy Macedo pour les tests approfondis de nombreuses modifications de méthodes et le raffinement de la plate-forme BSelex actuelle.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
MoFlo Astrio EQ, Cell SorterMoFlocell sorting
Biotinylated peptidesNew England PeptideCell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel columnBioRad#7326223
Streptavidin (R-PE)Thermo ScientificSA10041
Streptavidin (APC)Thermo ScientificS32362
CD22 MicroBeads, human Miltenyi#130-046-401
LS columnsMiltenyi#130-042-401
Pre separation filters Miltenyi#130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19BD BiosciencesBD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27 BD Biosciences#560609
FITC mouse anti-human IgGBD Biosciences#560952
DAPILife Technologies#D21490
RNaseOUTLife Technologies#10777-019
Bovine serum albumin, Fraction VSigma#A4503
RPMI mediaHyclone#SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum)Invitrogen#10082147
Mastercycler GradientEppendorfModel #6325PCR machine
PCR 96-well platesPhenixMPS-500
PCR Plate matsPhenixSMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide MixClontech#639125
Superscript IV First-strand synthesis systemInvitrogen#18091050
Phusion High Fidelity PolymeraseThermo ScientificF-531-L
Platinum polymeraseInvitrogen#10966108
Nuclease-free waterQIAGEN#129114
Oligonucleotide primersIDTassortedPrimers for all PCR steps
Gel Extraction KitQIAGEN#28706
PCR Purification kitQIAGEN#28106
Miniprep KitQIAGEN#27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning KitNew England BiolabsE5520SGibson assembly
Expi293 Expression MediaInvitrogen#A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection KitInvitrogen#A14525
Opti-MEM MediaInvitrogen#31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 SystemPall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well PlatesThermo Scientific#15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half AreaCorning#3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary AntibodyJackson Labs#109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary AntibodyJackson Labs#115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) KPL#52-00-03
TMB Stop SolutionKPL#50-85-06

Références

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  2. Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
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