Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Özet

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Özet

İnsan antikor repertifiti potansiyel terapötik antikorlar ve yararlı biyobelirteçler büyük ölçüde kullanılmayan kaynağı temsil eder. Yeni nesil sıralama (NGS) gibi mevcut hesaplama yöntemleri, dizi düzeyinde antikor repertoire üzerinde muazzam veri setleri verirken, belirli bir antijen veya dizi için hangi dizilerin ilgili olduğunu belirlemek için işlevsel veriler gereklidir. Antijen. Burada, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMCs) insan kanı donöründen bireysel antijene özgü antikorları tanımlamak ve kurtarmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem olgun B hücrelerinin ilk zenginleştirme kullanır ve akış sitometri yoluyla IgG bellek B hücrelerini izole etmek için henotypik hücre belirteçleri ve floresan etiketli protein bir arada gerektirir. Ağır ve hafif zincir değişken bölgeleri daha sonra klonlanır ve yeniden taranır. Bellek B hücre bölmesi ile sınırlı olmasına rağmen, bu yöntem milyonlarca B hücresini sorgulamak için akış sitometrisinden yararlanır ve ifade ve özgüllük onayı için hazır bir biçimde tek bir hücreden eşleştirilmiş ağır ve hafif zincir dizilerini döndürür. Bu yöntemle geri lehte olan antikorlar terapötik potansiyel açısından düşünülebilir, ancak bireylerde B hücre repertifini değerlendirmek için özgüllük ve işlevi biyoinformatik yaklaşımlarla da ilişkilendirebilirler.

Giriş

Antikorlar terapötik moleküllerin büyüyen bir sınıf, ve herhangi bir insan mevcut B hücre repertifiti bu tür antikorların potansiyel bir kaynağıdır. Bir insan donör kurtarıldı zaman, hiçbir adaptasyon veya "insanlaşma" gerektirir, diğer hayvan sistemlerinde üretilen antikorlar için gerekli olan adımlar. B hücre aktivasyonu ve proliferasyon 1, EBV dönüşümü ile ölümsüzleştirme^1,ve hibridoma hücre hatlarının üretimi 4 dahil olmak üzere insan antikorlarının tanımlanması ve izole edilmesi için çeşitli yöntemler vardır. ^,5. Ancak, tüm bu yöntemlerin tarama ve antijen özgü antikorlar kurtarmak için geniş hücre kültürü gerektirir. İnsan antikor repertuarı hakkındaki bilgiler, yeni nesil sıralama (NGS) teknolojisinin geliştirilmesiyle büyük ölçüde genişletilerek, donör örneklerinde bulunan büyük miktarda bireysel dizinin tanımlanmasına olanak sağladı. Ancak, NGS mevcut tüm dizilerin agnostik bir görünüm verir, bu tanımlama ve antijene özgü antikorların izolasyon, özellikle nadir veya düşük frekanslı antikorlar durumunda izin vermez.

"BSelex" yönteminin amacı, insan donörlerinde periferik kan mononükleer hücrelerinin dolaşımından kaynaklanan antijene özgü antikorları belirlemek ve daha fazla analiz için bu antikordizilerini izole etmek ve kurtarmaktır. Bu yöntem, bellek B hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen B hücre reseptörü (BCR) yararlanmak için akış sitometrisi ve hücre sıralama kullanır. Daha düşük iş moleküler biyoloji yöntemleri başlatılmadan önce milyonlarca B hücresi akış sitometrisi yoluyla antijen özgüllüğü açısından taranabilir. Hücre dizilerini toplu olarak analiz eden ngs yöntemlerinin çoğunda eşleştirilmiş ağır ve hafif zincir tanımlaması mümkün değildir. Burada açıkladığımız yöntemde, hücreler ayrı ayrı izole edilir ve hem ağır hem de hafif zincir dizilerinin eşleştirilmiş olarak geri kazanımı mümkündür, bu da doğrudan klonlama ve tam IgG'nin ifade edilmesine olanak sağlar.

Protokol

İnsan gönüllülerden alınan örneklerin kullanımı, Scripps Araştırma Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip etti. Kan bağışı ndan önce bağışçılardan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Reaktif Hazırlama

1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs)
   1. Ficoll-Plaque Plus izolasyonu ile normal insan donörlerinden periferik kan mononükleer hücrelerini kurtarın. %90 fetal sığır serumu (FBS) ve %10 dimetil sülfoksitte (DMSO) 50 milyon hücre/mL'de kriyokorun. Hücreleri -80 °C'de dondurun ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.
2. Sıralama için hedef antijen peptidlerin etiketleme
   1. Terminal biotin ile hedef proteine özgü (70 kalıntı uzunluğunda) peptidler oluşturun veya elde edin.
   2. Etiket 4 streptavidin ile her bir biyotinylated peptid kovalent PE bağlı (R-phycoerythrin) veya APC (allophycocyanin) ayrı tüpler. SA-PE ve 5,7 μM SA-APC için yaklaşık 3,2 μM son konsantrasyonu ile streptavidin (SA) için 9:1 peptid molar oranı kullanarak hazırlayın. Biotin tetramerleri negatif kontrol olarak hazırlayın.
   3. Her peptit karışımını bir gecede, karanlıkta, 4 °C'de yavaş karıştırma ile kuluçkaya yatırın.
   4. Polyakrilamid boncuklar içeren mikrosütunlar aracılığıyla etiketli peptidler geçirerek sınırsız florofor kaldırın.
   5. Peptit tetramerlerini 2 aya kadar 4 °C'de saklayın.

2. Hücre Sıralama

1. CD22+ izolasyonundan önce en az 1 saat ila 16 saat, donör PBMC'leri eritin ve 37 °C'de dinlenmeye izin verin.
   1. Dondurulmuş PBMC şişelerini dondurucudan çıkarın ve hemen 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın. Şişeler neredeyse çözüldüğünde, çalışma alanına aktarın.
   2. Her şişenin içeriğini önceden ısıtılmış ortam içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın (bağışçıları ayrı tutmak). 50 mL'lik son hacme orta ekleyin. İçeriği yavaşça karıştırın.
   3. Oda sıcaklığında 6 dk için 370 x g santrifüj. Supernatant atın, RPMI tam orta 15 mL hücreleri yeniden askıya ve bir hücre sayımı gerçekleştirin.
   4. Hücre konsantrasyonu 2,0 x 10⁷ hücre/mL RPMI tam orta ile ayarlayın ve hücreleri t75 şişe veya daha büyük ve en az 1 saat ve en fazla 16 saat için 37 °C'de kuluçka ya da çözülmüş hücreler için kurtarma süresi sağlamak için tüp hücre aktarın.
   5. Hücreleri toplayın (istenirse havuz) ve santrifüj 370 x g'de 6 dk 4 °C'de. 5 mL buz gibi macs arabelleği (PBS, pH 7.6 %0.5 BSA ve 2 mM EDTA içeren) hücreleri atın, MACS arabelleği yle 50 mL'ye getirin ve hücre sayımı yapın.
   6. 4 °C'de 7 dk için 400 x g'deki hücreleri santrifüj edin.
   7. CD22 mikroboncukları yakalayarak OLUMLU seçerek CD22⁺ B hücrelerini izole edin. Tüm yıkıntılar için MACS arabelleği kullanın. 4 °C'de 7 dk için 400 x g kont ve santrifüj. Beklenen iyileşme toplam PBMC nüfusunun %5-10'udur.
   8. Hücreleri mL FACS tamponu başına 40 milyon (Tris tampon, pH 8.0 %0.5 BSA ve 2 mM EDTA içeren) yeniden askıya alın ve bağışçıların hücre boyamasını tek tek veya havuz olarak devam ettirin.
2. Bellek B hücre sıralama için leke hücreleri
   1. Sitometre kurulumu için bir hücre aliquot'u çıkarın ve kullanılan etiketleme floroforlarının her biri için tazminat alın. Bir denetim olarak lekesiz hücreleri ekleyin.
   2. Elde edilen CD22⁺ hücre sayısı için son boyama hacmini hesaplayın (100°L'de 2 milyon boyama).
   3. B hücreleri (CD19-PerCP-Cy5.5), IgG (IgG-FITC) ve bellek bölmesi (CD27-PECy7) için üreticilerin seyreltme önerilerine göre hücre dışı belirteçler ekleyin ve hafifçe karıştırın. Aliquot 10⁷ hücreleri negatif kontrol için 1,5 mL tüp içine ve 15 mL tüp kalan hücreleri aktarın.
   4. Çift etiketli biotin-SA tetramerleri, her biri PE ve APC için 36 nM'lik son konsantrasyonla negatif kontrol tüpüne ekleyin ve facs tamponuyla (örn. 10 peptid x 36 nM=360 nM) hacmi 0,5 mL finale getirin.
   5. PE ve APC için her biri 36 nM'de sıralama tüpüne peptit tetramerleri ekleyin ve hücreleri TBS Tampon ile 100°L'de 2x10 6'ya getirin. Karanlıkta 4 °C'de ve 30-60 dk hafif rotasyonla kuluçkaya yatırın.
   6. Yıkama 2x 4 °C, 400 x g, 7 dk, son yıkamadan önce saymak için bir aliquot kaldırarak. 5 mL filtre kapağı tüpleri kullanarak hücreleri filtreleyin. HÜCRE ZARI bütünlüğünün bir belirteci olarak sıralamadan hemen önce 0,3 μM son konsantrasyonuna DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindole) lekesini ekleyin.
3. Akış sitometrisi ile tek hücreli sıralama
   1. Sıralama için 96 kuyulu PCR plakalardan 48 kuyu hazırlayın.
      1. Ana karışım hazırlayın: (2 μL 10x RT tampon, 0,5 μL RNase inhibitörü, 7,5 μL steril PCR sınıfı su) numune başına. Aliquot 10 μL/well, kapak ve sıralamaiçin hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
   2. Hücre ayırıcısı üzerindeki negatif denetimi çalıştırın ve tüm örneği analiz edin.
      1. Tek hücre li sıralama için uygun hücre popülasyonlarını yalıtmak için akış sitometri kapılarını ayarlayın.
         1. Arsa FSC alan vs SSC alan ve lenfositler izole etmek için Gate R1 ayarlayın.
         2. FSC yüksekliği vs FSC genişliği arsa ve FSC doublets hariç Gate R3 ayarlayın.
         3. SSC yüksekliği vs SSC genişliği arsa ve SSC doublets hariç Gate R4 ayarlayın.
         4. SSC yüksekliği vs DAPI'yi çizin ve Canlı hücreleri yalıtmak için R5 Kapısı'nı ayarlayın (DAPI^-).
         5. Çizim IgG vs CD19 ve IgG⁺ B hücreleri (CD19⁺ IgG^{+ )}izole etmek için Kapı R6 ayarlayın.
         6. Çizim IgG vs CD27 ve bellek B hücreleri (CD27^yüksek)seçmek için Gate R7 ayarlayın.
         7. Arsa Antigen-PE (Ag-PE) vs antijen-APC (Ag-APC) ve çift pozitif kapı olayların düşük sayıda bir Ag-PE⁺/ Ag-APC⁺ çeyrek olarak Gate R8 ayarlayın.
   3. Sinyalin gürültüye doğru belirlenmesi için antijen-pozitif (Ag⁺) örneğinden eşit sayıda bellek hücresi toplayın.
   4. Tek hücreleri cd19⁺ CD27⁺ Ag-PE⁺ Ag-APC⁺ (Gate R8) içeren tek hücreleri hazırlanmış 96 kuyulu PCR plakalarına sıralayın.
   5. Alüminyum bant pedleri ile kapak plakaları, 400 x g 1 dakika santrifüj ve gelecekteki klonlama için -80 °C'de saklayın.

3. Tek Hücreli Klonlama

1. Ters transkripsiyon reaksiyonları
   1. Tek B hücre sıralama plakasını 80 °C'den çıkarın. 2 dk. Açmadan önce kuyuların altındaki havuz içeriğini havuza 3.300 x g 2 dakika boyunca buz üzerinde çözülme.
   2. Ters astar olarak %10 non-iyonik deterjan ve oligo (dT) içeren bir dNTP/tampon ana karışımı hazırlayın. Tek hücreiçeren her kuyuya enzim karışımı ekleyin ve KARıŞTıRMAYıN.
   3. 65 °C'de 5 dk kuluçka. Toplam hacmi 20 μL'ye çıkarmak için 100 mM DTT, RNase inhibitörü ve ters transkriptaz enzimi içeren enzim ana karışımını ekleyin.
   4. PCR adımlarını başlatmadan önce buza aktarma
2. Çok adımlı iç içe PCR reaksiyonları
   1. Ağır zincir (HC) ve hafif zincir (LC) amplifikasyonu için ayrı iç içe pcr reaksiyonları kullanılır.
   2. PCR amplifikasyonunun ilk turu için (Adım I), hc ve LC değişken bölgelerini ayrı PCR reaksiyonlarında yükseltmek içinileri astar havuzu ve tek bir ters astar kullanın (Şekil 2). Tasarım olarak, ileri astar havuzu germline lideri (L) dizileri büyük bir yüzdesi yükseltmek ve ters astar ışık zincirleri için kappa (κ) ve lambda (λ) dahil olmak üzere her zincirin downstream sabit bölgelere özgüdür¹⁶.
      1. Her PCR (Adım I) reaksiyonu için şablon olarak 2,5 μL cDNA ürünü kullanın. Her biri için 1 μM'lik son reaksiyon konsantrasyonuna astar ekleyin. 10x polimeraz tamponu ile 2x konsantrasyonu iki katına çıkararak son hacmi reaksiyon başına 25°L'ye getirin. HC PCR reaksiyonlarını 50 döngü boyunca [94 °C/4 dk; 94 °C /15 s, 55 °C /20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 dk] kullanarak çalıştırın. 50 döngü için [98 °C/4 dk; 98 °C /15 s, 72 °C /20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 dk] kullanarak LC PCR reaksiyonlarını çalıştırın.
   3. Her (Step II) PCR reaksiyonu için şablon olarak Adım I ürününün 2,5 μL'sini kullanın. HC ve LC (κ ve λ) çerçevesi 1 bölgesine özgü ileri astar havuzunu ve her antikor zincirinin bağlantı bölgesine özgü ters astar havuzunu ekleyin. 10x polimeraz tamponu 2x konsantrasyonuna iki katına çıkın ve Adım I ile aynı parametreleri kullanarak PCR reaksiyonlarını 50'şer döngü çalıştırın.
   4. Pozitif amplifikasyon vuruşlarını görselleştirmek için tamamlanmış PCR reaksiyonlarını %1 agarose jel üzerinde çalıştırın. Eşleştirilmiş ampliconları (aynı hücreden hem ağır hem de hafif zincir) kurtarın ve jel ekstraksiyonu yoluyla izole edin. Doğru ligasyon karışımı hesaplamaları için OD₂₆₀ ile DNA parça konsantrasyonunu belirleyin.
   5. Kurtarılan ağır ve hafif zincir parçalarını bir bağlayıcı parçası ve ifade vektör omurgasını ticari bir kit kullanarak 4 parçalı ligasyon reaksiyonu kullanarak birleştirin.
   6. Ticari bir kit kullanarak kimyasal olarak yetkin bakterilere ligasyon reaksiyonları dönüştürün. Antibiyotik plakalara bir kez kaplandıktan sonra, kalan dönüşüm kültürüne 4 mL büyüme ortamı (antibiyotikle) ekleyin ve 250 rpm'de bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bu "ligasyon karışımı kültür."
   7. Ticari bir kit kullanarak gece ligasyon karışımı kültürlerden miniprep DNA hazırlayın ve ortaya çıkan plazmid DNA konsantrasyonunu belirlemek.

4. Antijen özgüllüğünün teyidi için ELISA Ekranı

1. Transfect 10 μg miniprep DNA katyonik lipid bazlı reaktif ile 10 mL süspansiyon 293 hücre içine, ve 3-4 gün boyunca kuluçka 37 °C (8% CO₂) ise 125 rpm döndü. Hasat için, santrifüj kültürü 10 dk 1.000 x g ve açıklık medya kurtarmak.
   1. Protein A'ya yakınlık yoluyla süpernatantlarda IgG konsantrasyonu ölçün.
   2. Her IgG'yi (supernatant içinde) 20 μg/mL'de enzime bağlı adsorbent testi (ELISA) ile streptavidin plakası üzerinde yakalanan veya negatif kontrol olarak aktin olarak yakalanan tek tek peptidlere karşı test edin. Rekombinant klonları tespit etmek için insan IgG Fab karşı bir keçi anti-insan peroksidaz ikincil antikor kullanın. Arka planın çıkarTını ndan sonra, OD > 0.5 ekran pozitif olarak tanımlanır.
   3. Ek bir ELISA gerçekleştirerek ekran pozitif vuruşlarını onaylayın, mL başına 20 g'dan başlayan bir konsantrasyon eğrisi oluşturmak için IgG süpernatant seyreltmelerini kullanarak ve ilk ekran ELISA'da reaktivite gösteren her bir antijen için OD'ye karşı çizim yaparak.

Sonuçlar

Bu yöntem insan donörlerden antijene özgü antikorları izole etmek için çok aşamalı bir süreci kapsar. Burada gösterilen temsili verilerde, hücreler, putatif fosforilasyon alanlarını taklit etmek için fosforitane peptidler de dahil olmak üzere tau proteininin çeşitli farklı alanlarını temsil eden floresan etiketli peptidler havuzu ile kuluçkaya yatırıldı. Bu peptidler tau epitopyaları(lar) ile reaktif olan hücreleri tanımlamak için "yem" olarak kullanılmıştır. Sıralamaya hazırlanırken, zenginleştirilmiş B hücre popülasyonu içindeki farklı hücre popülasyonlarını tanımlamak için floresan etiketli henotypik belirteçlerden oluşan bir panel kullanılmıştır. Hedef bellek B hücrelerini izole etmek için bir dizi sitometri kapısı geliştirildi (Şekil 1). Lenfositler hücre büyüklüğüne ve granüleritliğine göre ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) akım sitometrisi^6,7çizimleri kullanılarak izole edildi. Birden fazla hücre ("doublets") ve ölü hücrelerin dışlanmasından sonra, henotibik belirteçler IgG⁺ bellek B hücrelerinin IgG, CD19 (B hücresi) ve CD27 (bellek) üzerinden ayrılmasına olanak sağladı. Bu yaklaşımda, CD27 işaretçisi iki ayrı popülasyona dağılmaz, bu nedenle CD27⁺ ifade hücrelerinin en üst %45'i son kapıya dahil edilir. Son olarak, hem APC hem de PE floroforlar için çift pozitif hücreler, peptidlerin her iki etiketli versiyonlarına reaktiviteyi gösteren gating grafiğinin sağ üst kadranda dağıtır. Çekilen kapının içine düşen hücreler izole edildi ve 96 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına ayrı şıldı. İki farklı etiketli antijenin kullanılması sinyal-gürültü oranını artırır ve sonraki moleküler biyoloji sürecinde yanlış pozitif lerin sayısını azaltır. Sıralanmış hücreler son kapıdaki bellek B hücrelerinin yaklaşık %0,1'ini ve başlangıç hücre örneğinin %0,001'ini temsil eder.

Tek hücreli klonlamanın ilk okuması, ilgili ağır ve hafif değişkenzincirlerin amplifikasyonunun doğrulanmasıdır (Şekil 2). Her iki amplikonlunın eşleştirilmiş geri kazanımı istendiğinden, PCR reaksiyonları agarose jel üzerinde yan yana değerlendirilir ve eşleşen çiftler jelden çıkarılır ve DNA parçaları çıkarılır. Amplifikasyon tipik verimliliği% 30-50 ağır zincir ve% 50-70 hafif (kappa) zinciridir. Eşleştirilmiş amplikonrların geri kazanımı genellikle %25-40 arasında verimliliktir. Bu verimlilik donör havuzları arasında farklılık gösterir ve temsiliveriler (Şekil 3) 24 tek hücreden (%42 eşleştirilmiş kurtarma) çok verimli bir amplifikasyon örneğidir. IgG klonlama sonra, IgG ifade vektörinsan embriyonik böbrek içine transfected (HEK-293) süspansiyon hücreleri, hangi ifade maksimize etmek için kullanılır. Serumsuz ortam kullanımı rekombinant antikor hazırlığındaki kirletici proteinleri azaltır ve sonraki bağlayıcı tahlillerde gürültüyü en aza indirmeye yardımcı olur. Kurtarılan antikorlar tau peptidlerin orijinal paneline karşı taranır ve ELISAtarafından reaktivite için puanlandırılır (Şekil 4). Pozitif antijen reaktivitesini göstermek için od = 0.5'in ilk eşiği kullanılır ve β-aktin proteini spesifik olmayan bağlanma için bir kontrol olarak kullanılır. Akış sitometrisi ve sıralama adımları karışık bir peptid havuzu kullanıyorsa, tarama ELISA kurtarılan IgG'lerin spesifik reaktivitelerini deconvolutingin ilk adımıdır. 10 IgG'den üçü fosforiile CBTAU2.1 peptidine karşı reaktivite gösterdi ve biri fosforilasyonsuz CBTAU27.1'e reaktif tiyatuyet oldu (Şekil4A). İlave doğrulama, ilk ekranda tanımlanan peptidlere karşı aynı rekombinant antikor örneklerinin konsantrasyon eğrisi ve negatif kontrol olarak ek bir peptid kullanılarak tamamlanmıştır (Şekil4B). Her pozitif vuruş için, tek bir plazmid klon dönüştürülmüş havuzdan izole edildi ve aynı ELISA yöntemi ile yeniden doğrulandı. Sadece Klon 34'e sunulan veriler gösterilmiştir ve fosforilasyonsuz CBTAU27.1'e reaktivite doğrulanırken, fosforlu 27.1 peptid ile daha düşük afinite bağlama gözlenmiştir (Şekil 4C).

Şekil 1 : Akım sitometrisi ile antijen-reaktif tek hücrelerin izolasyonu. (A) Gösterilen lenfosit popülasyonu çizilen kapı içinde yer aldığı temsili bir arsadır. (B) İleri ve yan dağılıma dayalı kapılar (FSC yüksekliği v FSC genişliği (R3); SSC- yükseklik v SSC- genişlik (R4)) doublets hariç kullanılmıştır. Sonraki parsellerde sadece çizilen kapılardaki hücreler değerlendirildi. DAPI⁺ hücreleri ölü olarak kabul edildi ve dışlandı (R5). Bu deneyde 3.7 x 10⁷ "canlı" hücreler sorgulandı. Canlı hücrelerin çoğu B hücreleri (CD19⁺) ve IgG⁺ hücreleri (%4.66) idi. bu popülasyondan izole edilmiştir (R6). CD27⁺ifade bellek hücrelerinin üst %43,2'si seçim kapısına (R7) dahil edildi. (C) Quadrant 2 (Q2) etiketli antijenlere (peptit-APC v peptid-PE) reaktif hücreler içeriyordu ve bu hücreler ayrı ayrı 96-well plakaiçine alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2 : PCR amplifikasyonu klonlama için IgG ağır ve hafif değişken dizikurtarır. (A) Hem ağır (VH) hem de hafif (Vk veya Vl) zincir değişken bölgeleri iç içe pcr reaksiyonları kullanılarak kurtarılır. Adım I astarlar yerli lider dizisinden ileri ye doğru yükseltmek ve sabit bölge içinde ters. Birden fazla ok, olası mikropların geniş kapsama alanını sağlamak için kullanılan 7-12 astarlık bir havuzu temsil eder. Adım II astarlar, değişken açık okuma çerçevesinin aşırı uçlarına özgü iç içe ve ifade vektöründe bitişik sıraya homolog olan amfikonların uçlarına sıra eklenir. (B) Bağlayıcı sabit hafif zincir (Ck veya Cl), ağır zincir organizatörü ve yerli olmayan bir sinyal peptid dizisi takip oluşur. Amplicons, bağlayıcı ve plazmid omurga aynı anda Step II PCR amplifikasyon sırasında oluşturulan örtüşen homolog dizisi ile ligated, ve bozulmamış plazmid olarak izole. Son ifade vektöründeki rekombinant ağır ve hafif zincirler bağımsız (ve özdeş) CMV destekçileri tarafından tahrik edilir ve ayrı proteinler olarak tercüme edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 : IgG ağır ve hafif değişken zincirli amplikonlar tek hücreden elde edilir. İç içe pcr reaksiyonları (Step II) doğrudan% 1 agarose jel üzerine yüklendi ve görselleştirilmiş. Aynı hücreden gelen ağır zincir (H) ve kappa hafif zincir (L) PCR reaksiyonları bitişik kuyulara yüklenmiş, böylece eşleştirilmiş amfinler kolayca gözlemlenmiştir. Başarılı ağır ve hafif zincir ürünleri sırasıyla yaklaşık 400 bp ve 350 bp vardır. Eşleştirilmiş amfikonların başarılı bir şekilde kurtarılması bir (*) ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4 : Antijen özgüllüğü rekombinant IgGs'den doğrulanır. Kurtarılan ağır ve hafif zincir dizilerini içeren plazmidler ifade için HEK hücrelerine aktarılır. Dört gün sonra rekombinant antikorlar ELISA tarafından reaktivite için değerlendirilir. (A) Açıklığa kavuşturulan ortamdaki IgG konsantrasyonu ölçüldü ve 20 g/mL'ye seyreltildi. Sıralama için kullanılan peptidhavuzu streptavidin plakalarında her kuyuda 40 pmol kullanılarak ayrı ayrı değerlendirildi. Tüm IgG'ler yinelenen kuyularda test edildi. (B) OD450 ölçümü >0.5 görüntülenen klonlar ekranda tanımlanan peptidlere karşı 1:5 seyreltme adımı kullanılarak yeniden değerlendirildi (klonlar #32, #34, #35) yeniden değerlendirildi. (C) Bir kez bir hit olarak doğrulandı, tek bir plazmid klon dönüştürülmüş ligasyonlar #34 klon izole edildi, transfected, ve ELISA tarafından reconfirmed. Aynı klonlar #32 ve #35 (veri gösterilmez) için yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem akış sitometrisi ve tek hücreli klonlama birleştirir ve burada tanımladığımız yöntemler daha önce Tiller ve meslektaşları tarafından geliştirilen yöntemlere dayalı¹¹. Çalışmaları, insanlarda b hücre repertifini tek tek hücre düzeyinde incelemek için monoklonal antikorların geri kazanımını ve klonlamalarını tanımlar. Çok aşamalı amplifikasyon astar stratejisi de dahil olmak üzere, bellek B hücrelerinin bir popülasyondan antijene özgü monoklonal antikorların geri kazanımı sağlamak için onların sürecinin ana bileşenleri ni uyarladık. Büyük değişiklik etiketli antijen "yem" eklenmesidir. Klonlama vektör omurgasının tek bir ifade plazmidi, germline repertuarının ek astar kapsamı (hem lider sırası hem de çerçeve 1) olarak değiştirilmesi dahil olmak üzere (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) yayınlanan protokole ek uyarlamalar yapılmıştır. daha yüksek ekspresyon için süspansiyon HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu ve PCR amplifikasyon sırasında yüksek sadakat polimerazların kullanımı.

Burada açıklanan yöntemler için, en kritik adımlar akış sitometrisi ve tek hücreli klonlama arasındaki geçiş yakındır. İlk olarak, plaka içine sıralanmış tek hücrelerin uygun yerleştirme esastır. Bırakma gecikmesini sıralayıcıda doğru şekilde ayarlamak önemli bir adımdır. Hedef sıra plakalarında statik bir silah kullanılmadığı sürece geri kazanım verimimizin önemli ölçüde düştüğünü bulduğumuzdan, düşük nem gibi çevresel faktörler de dikkate alınmalıdır. Hücre yerleşimini takiben, plakalar, hücrelerin kuyuların altındaki 10 μL arabellekle temas etmesini sağlamak için santrifüj edilir. Tüm bu önlemler moleküler biyoloji bölümünün başarılı olması için çok önemlidir. Tek bir hücrenin ters transkripsiyon reaksiyonu için koşullar alt-optimal ise, β-aktinin bile PCR amplifikasyonu zor olabilir. Sunulan yöntemin gücü milyonlarca hücreyi sorgulama ve sadece antijen reaktivite kriterlerini tercih edilen antijenle karşılaştıran ları sıralama yeteneğidir. Bu, sinyalin gürültü oranının mümkün olduğunca yüksek olmasını gerektirir ve bu da sıralamadan önce yem konsantrasyonlarını optimize ederek yapılır. Çift etiketli yem, floroforlardan birinin yüksek arka plana sahip olması durumunda ortaya çıkabilen yanlış pozitif hücrelerin iyileşmesini azaltmak için kullanılır. Birden fazla antijen yem kullanarak sinyal yapabilirsiniz: gürültü optimizasyonu daha zor, ama aynı anda birden fazla peptidler sorgulamak için yeteneği bu yöntemin başka bir yararıdır.

Kurtarma verimliliği düşük olduğunda, şablon cDNA'nın mevcut olduğunu doğrulamak için iç içe gelişmiş β-aktin astarları kümesi kullanılır. Bu yaklaşımın dezavantajı, kuyuda hücre bulunup bulunmadığını veya ters transkripsiyon reaksiyonunun başarısız olup olmadığını belirlemenin zor olması ve bu da sorun gidermenin zor olmasıdır. Bazen tersi meydana gelecek ve verimlilik beklenenden daha yüksektir. Ağır zincir için tipik iyileşme% 30-45 arasında ve hafif zincirler% 40-60 arasında, daha yüksektir. Her PCR reaksiyonu (Adım I & II) tek bir hücreden yükseltmek için 50 döngü kullanır. Toplam çevrim sayısının yüksek olması da bu yöntemi kontaminasyona karşı duyarlı hale getirir. Amplicons dizi analizi bir kirletici tanıtıldı veya alışılmadık yüksek kurtarma oranı meşru elde edilmiştir olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

Bu yöntemin bir antijene karşı yerli insan antikorları kurtarmak için yarar birkaç önemli sınırlamaları vardır. İlk olarak, sadece etiketlenebilir çözünür proteinler akış sitometri için "yem" olarak kullanılabilir. Temsili sonuçlarda sunulan tür için, tau proteininden sentezlenmiş bir dizi üst üste binme peptidkullandık, çünkü tüm proteini kullanmak zor oldu. Doğrusal peptidlerin kullanımı muhtemelen en iyi değildir, çünkü doğrusal olmayan veya yapısal epitoplara karşı antikorların belirlenmesini sınırlayabilir. Ancak, tau karşı birkaç benzersiz antikorları tespit başardık ve bu şu anda daha fazla^{değerlendirme}8 geçiyor^,9. Başka bir sınırlama moleküler biyoloji kurtarma ve IgGs klonlama düşük iş bölümüdür. İlk sıralama stratejisi milyonlarca hücrenin taranmasına olanak sağlar, ancak sonraki moleküler biyoloji işleme birden fazla aşamadan oluşur. Gibson Assembly¹⁰ gibi yeni teknolojileri dahil etmek için devam eden optimizasyon çabaları çeşitli adımları düzene, ancak darboğaz bireysel ağır ve hafif zincir çiftleri klonlama kalır.

"BSelex" yöntemi, bellek B hücrelerinin yüzeyinde antijen reaktivite gösteren hücreleri tanımlamak için ifade bcr kullanır, vedaha sonra akış sitometri 11 ile bu bireysel hücreleri kurtarmak 11^,12. BCR'ye olan bu güven nedeniyle, yöntem bellek B hücre bölmesi ile sınırlıdır ve plazmablastlar gibi antikor salgılayıcı hücreleri (ASC) yakalamaz. Ancak, bu yaklaşım, ASC'lere kıyasla antijene özgü immünoglobinlerin daha geniş bir repertoresini kurtarmak için avantajlı olabilir. Grip aşılama çalışmaları reaktif ASCs genişletilmiş B hücre klonları az sayıda hakim olabilir iken, antijene özgü bellek B hücre nüfusu nadiren klonal olduğunu göstermektedir¹². T hücrelerinin yüzeyindeki T hücre reseptörü (TCR), çeşitliliği en üst düzeye çıkarmak için gen düzenlemesi ve rekombinasyonda B hücre reseptörüne benzerlikler gösterir. Burada sunulan yöntemde anlatılanlara benzer tek hücreli yaklaşımlar, alfa ve beta zincirlerinin geri kazanımı ve tek hücreli klonlama dahil olmak üzere T hücre repertoisini değerlendirmek için geliştirilmiştir¹³. Ancak, TCR tanıma peptidler MHC molekülleri tarafından sunulmasını gerektirir, peptid özgü T hücrelerini tanımlamak için etiketli yem yaklaşımına önemli karmaşıklık ekleyerek. B hücrelerinin aksine, T hücreleri tüm değişken bölgenin yakınlık olgunlaşması tabi değildir, bu nedenle kısa CDR3 bölgesinin tanımlanması ve bazı yan diziler tanımlama ve yeniden yapılanma için gerekli olan tek şeydir. Son olarak, bu yöntem akış sitometrisi kullanarak IgG moleküllerinin tanımlanmasını açıklar, ancak farklı izotiplerin B hücrelerini tanımlamak için alternatif henotipik belirteçler kullanmak da mümkündür.

Şu anda, antijen özgüllüğünün fonksiyonel analizi ile yeni nesil sıralamatoplanan büyük miktarda veri bağlamak için geliştirilen yöntemler vardır, ancak bu yöntemler hala rafine edilmektedir. Sınırlamalarına rağmen, burada açıklanan yöntem hem enfeksiyöz hem de bulaşıcı olmayan hastalıklar için potansiyel terapötik değeri olan antikorları tanımlamak için kullanılmıştır^8,14,15, ve güvenilir bir temsil b hücreleri veya geniş hücre kültürü kapsamlı manipülasyon olmadan, insanlardan ilgili antijen özgü IgGs kurtarmak için yaklaşım.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter	MoFlo		cell sorting
Biotinylated peptides	New England Peptide		Cell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel column	BioRad	#7326223
Streptavidin (R-PE)	Thermo Scientific	SA10041
Streptavidin (APC)	Thermo Scientific	S32362
CD22 MicroBeads, human	Miltenyi	#130-046-401
LS columns	Miltenyi	#130-042-401
Pre separation filters	Miltenyi	#130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19	BD Biosciences	BD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27	BD Biosciences	#560609
FITC mouse anti-human IgG	BD Biosciences	#560952
DAPI	Life Technologies	#D21490
RNaseOUT	Life Technologies	#10777-019
Bovine serum albumin, Fraction V	Sigma	#A4503
RPMI media	Hyclone	#SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum)	Invitrogen	#10082147
Mastercycler Gradient	Eppendorf	Model #6325	PCR machine
PCR 96-well plates	Phenix	MPS-500
PCR Plate mats	Phenix	SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix	Clontech	#639125
Superscript IV First-strand synthesis system	Invitrogen	#18091050
Phusion High Fidelity Polymerase	Thermo Scientific	F-531-L
Platinum polymerase	Invitrogen	#10966108
Nuclease-free water	QIAGEN	#129114
Oligonucleotide primers	IDT	assorted	Primers for all PCR steps
Gel Extraction Kit	QIAGEN	#28706
PCR Purification kit	QIAGEN	#28106
Miniprep Kit	QIAGEN	#27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Gibson assembly
Expi293 Expression Media	Invitrogen	#A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection Kit	Invitrogen	#A14525
Opti-MEM Media	Invitrogen	#31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 System	Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates	Thermo Scientific	#15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area	Corning	#3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody	Jackson Labs	#109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody	Jackson Labs	#115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)	KPL	#52-00-03
TMB Stop Solution	KPL	#50-85-06