Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

Resumen

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Resumen

La evaluación del microambiente del tejido intacto para el análisis de la infiltración celular y la organización espacial son esenciales para comprender la complejidad de los procesos de la enfermedad. Las técnicas principales utilizadas en el pasado incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) que permiten la visualización de las células como una instantánea en el tiempo utilizando entre 1 y 4 marcadores. Ambas técnicas tienen deficiencias, incluida la dificultad para manchar objetivos malgénicos y limitaciones relacionadas con la reactividad entre especies. IHC es confiable y reproducible, pero la naturaleza de la química y la dependencia del espectro de luz visible permite utilizar sólo unos pocos marcadores y hace que la colocalización sea un reto. El uso de IF amplía los marcadores potenciales, pero normalmente se basa en el tejido congelado debido a la extensa autofluorescencia del tejido después de la fijación de formalina. La citometría de flujo, una técnica que permite el etiquetado simultáneo de múltiples epítopos, deroga muchas de las deficiencias de IF e IHC, sin embargo, la necesidad de examinar las células como una suspensión de una sola célula pierde el contexto espacial de las células que descartan Relaciones. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puentes de estas tecnologías que permiten el fenotipado celular multiepitope en tejido de parafina fija inhacina (FFPE) de formalina, preservando al mismo tiempo la arquitectura general del microambiente y el espacio relación de las células dentro del tejido intacto no interrumpido. Los fluoróforos de alta intensidad fluorescente que se unen covalentemente al epítopo tisular permiten múltiples aplicaciones de anticuerpos primarios sin preocuparse de la reactividad cruzada específica de la especie por anticuerpos secundarios. Aunque se ha demostrado que esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de enfermedades, el proceso de creación de una estrategia de tinción mfIHC útil puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la amplia optimización y diseño. Con el fin de hacer imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para mitigar el período de optimización para el análisis manual, presentados aquí son métodos para la preparación de diapositivas, optimización de anticuerpos, diseño multiplex, así como errores, así como errores comúnmente durante el proceso de tinción.

Introducción

La visualización de un microambiente tumoral intacto (TME) es esencial para evaluar no sólo la infiltración celular en neoplasias malignas sólidas, sino también las interacciones de células a células. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) ha surgido como una herramienta eficaz para el fenotipado multiantígeno de células en el estudio del cáncer y las enfermedades asociadas^{1,2,3,4, 5,6,7}. Esto, en combinación con nuevos programas y software diseñados para analizargrandes conjuntos de datos, permite la observación de interacciones complejas entre las células 1,^2,4. El factor limitante de la velocidad en la adquisición de datos es a menudo la calidad del tejido manchado antes del análisis.

Las técnicas anteriores utilizadas para las células fenotipo en el TME incluyen inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo, todas las cuales presentan limitaciones significativas. IHC utiliza secciones de tejido de parafina fija incrustada de formalina (FFPE) que se deparan y rehidratan antes de ser manchadas por la mayoría de las veces un anticuerpo. El uso de un anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante(HRP) y una reacción química permite la visualización de un solo epítopo antigénico 8. Mientras que IHC es confiable y se realiza en el tejido FFPE que es fácil de trabajar con, limitaciones al espectro de luz visible significa que sólo uno o dos marcadores pueden ser confiables distinguidos y la colocación de antígenos bastante difícil⁸. Una forma de ampliar los marcadores disponibles y, por lo tanto, los antígenos que se pueden sondear en una sola sección es cambiar a fluorescencia que permite el uso de una gama más amplia del espectro visual. Para IF, el tejido congelado o FFPE se transfiere a diapositivas y anticuerpos utilizados que se conjugan a varios fluoróforos. Si bien esto aumenta el número de antígenos que se pueden sondear, hay varias limitaciones importantes. En primer lugar, debido a que cada anticuerpo normalmente sólo tiene un fluoróforo unido, el brillo a menudo no es lo suficientemente fuerte como para superar la autofluorescencia tisular. Es por esta razón, la mayoría de IF se realiza en tejido congelado que es caro de almacenar y difícil de trabajar con. Un número limitado de etiquetas fluorescentes están disponibles para su uso debido a la superposición espectral y la reactividad de las especies cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos no conjugados. La citometría de flujo, que consiste en el procesamiento de tejido fresco en una suspensión de una solacélula y el etiquetado con anticuerpos fluorescentes ha sido el estándar de oro para el inmunofenotipado durante décadas 9,¹⁰. Un beneficio de la citometría de flujo es la capacidad de etiquetar múltiples anticuerpos sin preocupación por la reactividad cruzada de las especies, ya que la mayoría se conjugan. Debido a que las células son "visualizadas" por una máquina y no los ojos humanos, hay muchos más fluoróforos disponibles, pero esto tiene un costo. La compensación debe hacerse manualmente, lo que puede alterar significativamente los resultados produciendo poblaciones falsas positivas y negativas. La limitación más significativa de la citometría de flujo es que la arquitectura tisular y posteriormente toda la información espacial se pierde por la necesidad de la suspensión de células individuales.

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) utilizando un microscopio fluorescente automatizado en combinación con un software novedoso combina los beneficios de IHC, IF y la citometría de flujo al permitir la tinción de tejido multiantígeno con amplificación de señal y retención de relaciones espaciales sin necesidad de compensación. El tejido FFPE se coloca en diapositivas cargadas que, después de la recuperación del antígeno, se someten a una ronda de aplicación de anticuerpos primarios al antígeno objetivo de interés seguido de un anticuerpo secundario con una etiqueta química HRP, similar a IHC. Después de la colocación del anticuerpo secundario, una reacción específica de HRP da como resultado una unión covalente de fluoróforo al epítopo de interés¹¹. Una vez que el tejido está etiquetado, se completa otra ronda de calentamiento de las diapositivas eliminando el complejo de anticuerpos primarios y secundarios previamente aplicados dejando sólo la etiqueta fluorescente unida al epítopo de tejido^11. Esto permite que múltiples anticuerpos de cualquier especie sean reaplicados sin preocupación por la reactividad cruzada^11,12. Para minimizar cualquier necesidad de compensación manual de múltiples colorantes fluorescentes, se utiliza una colección de fluoróforos con poca superposición espectral, incluida una mancha de contador nuclear, para completar el mfIHC. Para tener en cuenta la autofluorescencia encontrada con el tejido FFPE, el software resta la autofluorescencia de la imagen final utilizando una imagen de una diapositiva en blanco que es posible debido a la fuerza de fluorescencia específica de antígeno después del fluoróforo amplificación de la señal. Utilizando programas novedosos diseñados para grandes conjuntos de datos, las ubicaciones de celdas se pueden identificar y analizar para el contexto espacial^1,2,4. La limitación más significativa de esta técnica es el tiempo de optimización. Una metodología detallada con instrucciones para el diseño experimental y la estrategia de tinción e imagen se encuentra aquí. mfIHC será útil para laboratorios que actualmente no tienen un sistema de tinción automatizado optimizado que le gustaría entender mejor el contexto espacial de las interacciones de célula a célula en el tejido FFPE intacto utilizando la técnica manual.

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Protocolo

Todo el trabajo ha sido aprobado por la junta de revisión interna de la Universidad de Michigan.

1. Optimización de anticuerpos primarios y preparación de diapositivas

1. Determinar la concentración ideal de anticuerpos para multiplex utilizando IHC convencional.
   1. Pruebe los anticuerpos para el multiplex mediante inmunohistoquímica convencional manual (IHC)¹³.
   2. Utilice tejidos específicos que tengan un tipo de célula abundante para cada anticuerpo analizado, como el uso de tejido de amígdala para pruebas de anticuerpos CD3.
   3. Utilice la concentración de referencia para IHC recomendada por la empresa y luego complete el IHC con concentraciones de anticuerpos a las concentraciones recomendadas, así como las concentraciones superiores y inferiores a la concentración recomendada.
2. Prepare el tejido incrustado de parafina fija de formalina en las diapositivas.
   1. Usando un microtome, corte bloques de tejido FFPE a un espesor de entre 4 y 6 m y aplíquelos a las diapositivas cargadas.
      NOTA: El uso de agua destilada garantiza un montaje y adherencia adecuados del tejido en todo el multiplex.
   2. Coloque las diapositivas planas, el lado del tejido hacia arriba y deje secar a 37 oC durante la noche.
   3. Guarde las diapositivas en una caja deslizante lejos de las temperaturas extremas hasta que estén listas para completar el multiplex.

2. Método general de tinción

1. Preparación de soluciones de lavado y recuperación de antígenos
   1. Preparar la solución de lavado de 0,1% TBST mezclando 9 L de agua desionizada, 1 L de solución salina tamponada (TBS) y 10 ml de polisorbato 20.
   2. Preparar ambas soluciones de recuperación de antígenos (pH 6 y pH 9; Tabla de Materiales) diluyendo a 1x con agua desionizada.
2. Desparafinación y rehidratación
   1. Hornee los portaobjetos, acostados, el lado del tejido hacia arriba a 60 oC durante 1 h en un horno de hibridación¹. Retire los portaobjetos del horno y deje enfriar durante al menos 5 x 10 minutos y luego colóquelos en un portaobjetos vertical.
   2. Tratar las diapositivas en las siguientes soluciones secuencialmente: xileno en triplicado, seguido de un único tratamiento de 100% etanol, 95% etanol, y por último 70% etanol para 10 min cada uno utilizando un conjunto de tinción de diapositivas¹.
   3. Lavar el bastidor de los portaobjetos durante 2 minutos con agua desionizada por inmersión en una caja de plástico, seguido de fijación por inmersión en una caja de plástico rellena de formalina tamponada neutra durante 30 min^13. Lavar los portaobjetos en agua desionizada durante 2 minutos y luego proceder a la recuperación de antígenos.
3. Recuperación de antígenos
   1. Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena a la línea interna (aproximadamente 300 ml) con tampón de recuperación de antígeno pH 6 o pH 9.
      NOTA: El tampón de recuperación de antígenos puede ser pH 6 o pH 9, que puede necesitar ser optimizado por epítopo. Sin embargo, comience por usar pH 9 para anticuerpos que se unen a epítopos nucleares y pH 6 para todos los demás anticuerpos.
   2. Cubra la caja con una envoltura de plástico y use una banda de goma para asegurarla. Coloque la caja en el microondas en el borde de la placa giratoria (microondas debe estar equipado con tecnología de inversor para calefacción uniforme). Calentar los portaobjetos durante 45 s al 100% de potencia seguido de 15 min a 20% de potencia¹³.
      NOTA: El tratamiento de microondas puede necesitar optimización dependiendo del microondas utilizado.
   3. Deje que las diapositivas se enfríen durante aproximadamente 15 x 20 minutos.
4. Prepare soluciones de trabajo de anticuerpos y fluoróforos mientras se enfrían los portaobjetos.
   1. Preparar el diluyente de anticuerpos primarios disolviendo 0,5 g de gránulos de albúmina sérica bovina en 50 ml de TBST. Alternativamente, utilice 50 ml de 1x solución salina tamponada de fosfato (PBS) para disolver gránulos.
   2. Realizar cada solución de trabajo de anticuerpos primarios a la concentración optimizada determinada en la sección 1, en el diluyente de anticuerpos primarios. Estimar aproximadamente 200 l por diapositiva.
   3. Preparar la solución de trabajo de fluoróforo diluyendo cada fluoróforo en el diluyente de fluoróforo a una concentración de 1:100.
      NOTA: Esto puede necesitar ser optimizado dependiendo del anticuerpo. Estimar aproximadamente 100 l por diapositiva.
   4. En el último día de tinción, prepare la solución de trabajo de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) añadiendo 3 gotas de DAPI en 1 ml de TBST.
5. Tinción de diapositivas (lavado y bloqueo)
   1. Retire la caja del microondas después de enfriar y quite la envoltura de plástico, lave los portaobjetos con agua desionizada durante 2 minutos seguido de un lavado de 2 minutos en una caja de plástico llena de plástico TBST¹³.
   2. Después de secar cada diapositiva alrededor del tejido con una delicada tarea limpiar con cuidado de no dejar que el tejido se seque, rastrear alrededor del exterior del tejido usando una pluma de barrera hidrófoba. No toque el tejido con la delicada toallita o pluma de la tarea.
   3. Coloque cada diapositiva en la cámara humidificada y agregue la solución de bloqueo (aproximadamente 4 gotas) al tejido. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
6. Tinción por diapositivas (aplicación de anticuerpos primarios)
   1. Tome cada diapositiva y retire la solución de bloqueo tocando el lado de la diapositiva en una pila de toallas de papel y usando una toallita de tarea delicada para eliminar el exceso de agente de bloqueo alrededor del tejido.
   2. Vuelva a poner el portaobjetos en la cámara humidificada y añada aproximadamente 200 ml del anticuerpo primario de trabajo. Incubar en la cámara humidificada durante 1 h a RT.
   3. Lavar con TBST durante 2 min por inmersión en triplicado¹³.
      NOTA: Después de cada paso de lavado, cambiar el TBST ayudará a garantizar una imagen más limpia.
7. Tinción por deslizamiento (aplicación secundaria de anticuerpos)
   1. Elimina el TBST restante de cada diapositiva y aplica aproximadamente de 3 a 4 gotas de anticuerpo secundario (mezcla de anticuerpos conjugados secundarios de HRP de conejo y ratón). Incubar durante 10 min en la cámara humidificada a^{RT 13}.
      NOTA: Si planea utilizar un anticuerpo primario que requiera un anticuerpo secundario que no sea ratón o conejo o elija utilizar un anticuerpo secundario alternativo, aplique el HRP conjugado secundario adecuado a las diapositivas e incubar en RT durante 45 minutos. tiempo de incubación puede ser necesario para la secundaria alternativa¹⁴.
   2. Después de la incubación, lavar con TBST durante 2 min en triplicado¹³.
8. Tinción por diapositivas (aplicación de fluoróforo)
   1. Aplicar aproximadamente 100 l de la solución de trabajo del fluoróforo e incubar en la cámara humidificada a RT durante 10 min¹³.
   2. Lavar con TBST durante 2 min en triplicado¹³.
9. Eliminación de anticuerpos
   1. Toboganes de microondas (45 s al 100% y 15 min a 20%) en la caja resistente al calor (ver paso 2.3.2) para la eliminación de anticuerpos^13,14.
      NOTA: Esto completa una ronda del multiplex. Este es el único punto en el que se puede pausar el protocolo. Para pausar el protocolo, deje las diapositivas sumergidas en el búfer de recuperación de antígenos durante la noche a temperatura ambiente.
10. Continúe rondas adicionales de tinción. Repita los pasos 2.5.1-2.9.1 para el resto de los pares de anticuerpos-fluoróforos. Una vez utilizados todos los anticuerpos y fluoróforos, proceda a la sección 2.11.
11. Aplicación y montaje DAPI
    1. Después de la última ronda de tinción en el multiplex, retire la última aplicación de anticuerpos con solución de recuperación de antígenos pH 6¹³. Lavar con agua desionizada seguido de TBST durante 2 min cada^13.
    2. Aplicar aproximadamente 150 l de la solución DAPI en funcionamiento a los portaobjetos e incubar en la cámara humidificada durante 10 min a RT¹.
    3. Lavar con TBST durante aproximadamente 30 s y montar los cubreobjetos con un soporte antidescolor. Aplique esmalte de uñas transparente en las cuatro esquinas del cubreobjetos una vez que el soporte de montaje se haya secado para asegurar el cubreobjetos (opcional).

3. Detalles de biblioteca, monoplexes y multiplex

1. Elija diapositivas para crear una biblioteca de fluoróforos.
   1. Para un multiplex de 7 colores, recopile 7 diapositivas de tejido rico en células inmunitarias (es decir, amígdalas, bazo, etc.) para la biblioteca.
      NOTA: Elija las diapositivas de control que se utilizarán para una biblioteca de fluoróforos con cada diapositiva que represente cada fluoróforo único que se utilizará en el multiplex. Las diapositivas de control deben tener un epítopo abundante de elección y pueden ser el mismo tipo de tejido para cada fluoróforo.
2. Diapositivas de la biblioteca de imágenes y manchas para su uso con monoplexes y multiplexores.
   1. Siga los pasos 2.1 a 2.9.1 utilizando las diapositivas de control y las diapositivas de tejido de control de su elección. Coloque un fluoróforo diferente en cada diapositiva a una concentración de 1:100; una diapositiva debe contener sólo DAPI.
   2. Continúe con la sección 2.11 excepto omitir la tinción DAPI y, en su lugar, utilice TBST y monte como se describe.
   3. Después de dejar que las diapositivas se sequen durante la noche, la imagen con todos los canales DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, puntos cuánticos semiconductores y isotiocianato de fluoresceína (FITC) estableciendo la exposición a 250 ms con la función de protección de saturación¹.
      NOTA: Los tiempos de exposición se pueden ajustar a 50 a 250 ms¹³.
   4. Cargue las imágenes de la biblioteca en el software y utilíquelas en el análisis de los monoplexes y multiplex.
3. Elija diapositivas para monoplexes.
   1. Elija diapositivas de control que tengan un abundante epítopo de elección basado en anticuerpos optimizados (sección 1). Para cada ronda de tinción que se realice en el multiplex, seleccione ese número de diapositivas de control para crear monoplexes.
      NOTA: El propósito del monoplex es determinar la mejor posición (orden) para cada anticuerpo que se utilizará en el multiplex.
4. Monoplexes de manchas.
   1. Siga las secciones 2.1-2.11 utilizando el anticuerpo primario en un orden diferente (posición) para cada una de las diapositivas. Cada diapositiva debe tener un solo anticuerpo primario aplicado en un orden (posición) diferente de las otras diapositivas.
      NOTA: Para cada diapositiva en la que la ronda no solicite ningún anticuerpo primario o fluoróforo, utilice en su lugar diluyente de anticuerpos primarios y diluyente de fluoróforo¹³.
5. Diapositivas de imagen y analizar el monoplex.
   1. Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales capturacadacada cada imagen utilizando DAPI para enfocar.
      NOTA: Los tiempos de exposición se pueden ajustar a 50 a 250 ms¹⁴.
   2. Usando el software de análisis evaluar cada diapositiva monoplex mirando la intensidad fluorescente del marcador manchado.
   3. Compare esta intensidad con el fondo. Si es al menos 5 a 10 veces mayor que el fondo, la posición de esa diapositiva es una posición óptima para usar en el multiplex final.
6. Elija diapositivas para el multiplex.
   1. Elija las diapositivas de interés y agregue una diapositiva adicional que se utilizará como diapositiva en blanco para la resta de autofluorescencia después de la tinción y la creación de imágenes.
7. Mancha el multiplex.
   1. Sobre la base de los resultados monoplex, elija el orden apropiado (posiciones) para cada anticuerpo basado en el paso 3.5.3. Asigne cada fluoróforo a un anticuerpo.
      NOTA: Esto puede necesitar optimización; sin embargo, el plan de utilizar anticuerpos brillantes para marcadores menos abundantes¹, los anticuerpos colocalizadores deben combinarse con fluoróforos en espectros lejanos entre^{sí 13,}y los fluoróforos con el espectro 540 y 570 no deben ser colocalizados debido a a los problemas de superposición espectral¹.
   2. Continúe con las secciones 2.1 a 2.11 asegurando que la diapositiva en blanco no reciba anticuerpos primarios, fluoroforós o DAPI, en su lugar use diluyente de anticuerpos, diluyente de fluorofótesis y TBST respectivamente en su lugar.
8. Multiplexdez de imagen y análisis de la integridad de la tinción
   1. Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales, capture cada imagen utilizando DAPI para enfocar.
   2. Utilizando el software de análisis (Tablade materiales),evalúe cada multiplex por color falso fluorescente.
      NOTA: Una imagen clara debe demostrar cada marcador claramente. Si un marcador se ve difuso y granulado o es inexistente, es probable que el marcador no funcionara y necesite volver a optimizarse.
   3. Usando el software de análisis, evalúe cada multiplex por vista patológico. La vista patopatos confirmará la especificidad de cada marcador. Comparar con IHC previamente optimizado (sección 1).

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Resultados

El proceso general de obtención de un ensayo multiplex de 7 colores sigue un patrón repetitivo. La Figura 1 describe el proceso en forma diagramamática. Una vez que los portaobjetos se cortan y secan o se reciben del laboratorio y se hornean en un horno de hibridación a 60 oC durante 1 h, luego proceder a la desfinación y rehidratación, fijar los portaobjetos en formalina de nuevo seguido de recuperación de antígeno. Cada ronda de multiplexación comienza en la recuperación del ant?...

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Discusión

Las muestras de tejido intactas de la biopsia de tumores sólidos y la resección quirúrgica siguen siendo importantes herramientas diagnósticas y predictivas para el análisis de la enfermedad, así como el pronóstico del paciente. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) es una técnica novedosa que combina los beneficios de la inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF) y la citometría de flujo. Los métodos anteriores para sondear las células in situ hanpermitido l...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL