Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Zusammenfassung

Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.

Zusammenfassung

Die Mikroumweltbewertung von intaktem Gewebe zur Analyse der Zellinfiltration und räumlichen Organisation ist für das Verständnis der Komplexität von Krankheitsprozessen von entscheidender Bedeutung. Zu den in der Vergangenheit verwendeten Prinziptechniken gehören Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF), die die Visualisierung von Zellen als Momentaufnahme in der Zeit mit 1 bis 4 Markern ermöglichen. Beide Techniken weisen Mängel auf, darunter Schwierigkeiten bei der Färbung schlecht anogener Ziele und Einschränkungen im Zusammenhang mit der artenübergreifenden Reaktivität. IHC ist zuverlässig und reproduzierbar, aber die Art der Chemie und die Abhängigkeit vom sichtbaren Lichtspektrum ermöglicht nur wenige Marker und macht die Kolokalisierung schwierig. Die Verwendung von IF erweitert potenzielle Marker, beruht aber aufgrund der umfangreichen Gewebe-Autofluoreszenz nach formaler Fixierung in der Regel auf gefrorenes Gewebe. Durchflusszytometrie, eine Technik, die die gleichzeitige Etikettierung mehrerer Epitope ermöglicht, beseitigt viele der Mängel von IF und IHC, jedoch verliert die Notwendigkeit, Zellen als einzelzellige Suspension zu untersuchen, den räumlichen Kontext von Zellen, die wichtige biologische Beziehungen. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) überbrückt diese Technologien, die eine multiepitopzelluläre Phänotypisierung in formalin fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe ermöglichen und gleichzeitig die gesamte Mikroumgebungsarchitektur und die räumliche Beziehung der Zellen innerhalb intakten, ungestörten Gewebes. Fluorophore mit hoher fluoreszierender Intensität, die kovalent mit dem Gewebeepitop verbunden sind, ermöglichen mehrere Anwendungen primärer Antikörper, ohne sich um eine artspezifische Kreuzreaktivität durch sekundäre Antikörper zu kümmern. Obwohl sich diese Technologie als zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten erwiesen hat, kann der Prozess der Erstellung einer nützlichen mfIHC-Färbestrategie aufgrund umfangreicher Optimierung und Design zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Um robuste Bilder zu erstellen, die genaue zelluläre Interaktionen vor Ort darstellen, und um den Optimierungszeitraum für die manuelle Analyse zu mildern, werden hier Methoden zur Folienvorbereitung, Optimierung von Antikörpern, Multiplex-Design sowie Fehler vorgestellt. häufig während des Färbevorgangs auftreten.

Einleitung

Die Visualisierung einer intakten Tumormikroumgebung (TME) ist wichtig, um nicht nur die zelluläre Infiltration bei festen Malignomen, sondern auch bei Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu bewerten. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) hat sich als wirksames Werkzeug für Multi-Antigen-Phänotypisierung von Zellen in der Untersuchung von Krebs und assoziierten Krankheiten^{1,2,3,4, 5,6,7}. Dies ermöglicht in Kombination mit neuartigen Software und Programmen zur Analyse großer Datensätze die Beobachtung komplexer Interaktionen zwischen den Zellen^1,2,4. Der Ratenbegrenzungsfaktor bei der Datenerfassung ist oft die Qualität des gebeizten Gewebes vor der Analyse.

Frühere Techniken, die zur Phänotyp-Zelle in der TME verwendet wurden, umfassen Immunhistochemie (IHC), Immunfluoreszenz (IF) und Durchflusszytometrie, die alle signifikante Einschränkungen aufweisen. IHC verwendet formalin fixiertes Paraffin eingebettet (FFPE) Gewebeabschnitte, die deparaffiniert und rehydriert werden, bevor sie von den meisten von einem Antikörper gefärbt werden. Die Verwendung eines meerrettichperoxidase (HRP) gebundenen Sekundärantikörpers und einer chemischen Reaktion ermöglicht die Visualisierung eines einzelnen antigenen Epitops⁸. Während IHC zuverlässig ist und auf FFPE-Gewebe durchgeführt wird, das einfach zu arbeiten ist, bedeutet die Begrenzung des sichtbaren Lichtspektrums, dass nur ein oder zwei Marker zuverlässig unterschieden und die Kolokalisierung von Antigenen ziemlich schwierig ist⁸. Eine Möglichkeit, verfügbare Marker und damit Antigene zu erweitern, die auf einem einzigen Abschnitt untersucht werden können, besteht darin, auf Fluoreszenz umzustellen, was die Verwendung eines breiteren Spektrums des visuellen Spektrums ermöglicht. Für IF wird gefrorenes oder FFPE-Gewebe auf Dias und Antikörper übertragen, die zu verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind. Während dies die Anzahl der Antigene erhöht, die untersucht werden können, Gibt es mehrere wichtige Einschränkungen. Erstens, da jeder Antikörper in der Regel nur ein Fluorophor befestigt hat, ist die Helligkeit oft nicht stark genug, um die Gewebeautofluoreszenz zu überwinden. Es ist aus diesem Grund, die meisten IF wird auf gefrorenem Gewebe durchgeführt, die teuer zu lagern und schwierig zu arbeiten ist. Eine begrenzte Anzahl von fluoreszierenden Tags steht aufgrund von Spektralüberlappungen und artenübergreifender Reaktivität zur Verfügung, insbesondere wenn nicht konjugierte Antikörper verwendet werden. Die Durchflusszytometrie, die aus der Verarbeitung von frischem Gewebe zu einer Einzelzellsuspension und der Etikettierung mit fluoreszierenden Antikörpern besteht, ist seit Jahrzehnten der Goldstandard für Dieimmunphenotypisierung^9,10. Ein Vorteil der Durchflusszytometrie ist die Fähigkeit, mehrere Antikörper ohne Sorge um die Kreuzreaktivität der Arten zu kennzeichnen, da die meisten konjugiert sind. Da die Zellen von einer Maschine "visualisiert" werden und nicht von menschlichen Augen, gibt es viel mehr Fluorophore zur Verfügung, aber dies hat seinen Preis. Die Kompensation muss manuell erfolgen, was die Ergebnisse, die zu falschen positiven und negativen Populationen führen, erheblich verändern kann. Die bedeutendste Einschränkung der Durchflusszytometrie ist, dass die Gewebearchitektur und anschließend alle räumlichen Informationen durch die Notwendigkeit der Suspension einzelner Zellen verloren gehen.

Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit neuartiger Software kombiniert die Vorteile der IHC-, IF- und Durchflusszytometrie, indem multiantigene Gewebefärbung mit Signalverstärkung und Beibehaltung räumlicher Beziehungen ohne Entschädigung. FFPE-Gewebe wird auf geladenen Dias platziert, die nach dem Antigen-Retrieval eine Runde primärer Antikörperanwendung auf das Zielantigen von Interesse durchlaufen, gefolgt von einem sekundären Antikörper mit einem HRP-Chemikalien-Tag, ähnlich wie IHC. Nach der Platzierung des sekundären Antikörpers führt eine HRP-spezifische Reaktion zu einem Fluorophor, das kovalent an das Epitop von Interesse bindet¹¹. Sobald das Gewebe beschriftet ist, wird eine weitere Runde der Erwärmung der Dias abgeschlossen, um den zuvor angewendeten primären und sekundären Antikörperkomplex zu entfernen, so dass nur das fluoreszierende Tag an das Gewebeepitop¹¹gebunden ist. Dies ermöglicht die wiederanwendung von mehreren Antikörpern jeder Art ohne Bedenken bei der Kreuzreaktivität^11,12. Um jeglichen Bedarf an manueller Kompensation mehrerer fluoreszierender Farbstoffe zu minimieren, wird eine Ansammlung von Fluorophoren mit geringer spektraler Überlappung einschließlich eines nuklearen Zählerflecks verwendet, um den mfIHC zu vervollständigen. Um die Mitfluoreszenz mit FFPE-Gewebe zu berücksichtigen, subtrahiert die Software die Autofluoreszenz vom endgültigen Bild mit einem Bild von einem leeren Dia, was aufgrund der Stärke der antigenspezifischen Fluoreszenz nach Fluorophor möglich ist. Signalverstärkung. Mit neuartigen Programmen, die für große Datensätze entwickelt wurden, können Zellpositionen identifiziert und für den räumlichen Kontext^1,2,4analysiert werden. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die Optimierungszeit. Eine detaillierte Methodik mit Anleitungen für experimentelles Design und Färbe- und Bildgebungsstrategie finden Sie hier. mfIHC wird für Laboratorien nützlich sein, die derzeit nicht über ein optimiertes automatisiertes Färbesystem verfügen, das den räumlichen Kontext von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen in intaktem FFPE-Gewebe mit der manuellen Technik besser verstehen möchte.

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Protokoll

Alle Arbeiten wurden vom internen Überprüfungsausschuss der University of Michigan genehmigt.

1. Optimierung der primärantikörper und Der Diavorbereitung

1. Bestimmen Sie die ideale Konzentration von Antikörpern für Multiplex mit konventionellem IHC.
   1. Testen Sie die Antikörper für den Multiplex durch manuelle konventionelle Immunhistochemie (IHC)¹³.
   2. Verwenden Sie spezifische Gewebe, die einen reichlichen Zelltyp für jeden getesteten Antikörper haben, z. B. die Verwendung von Tonsillengewebe für CD3-Antikörpertests.
   3. Verwenden Sie die vom Unternehmen empfohlene Referenzkonzentration für IHC und vervollständigen Sie dann IHC mit Antikörperkonzentrationen in den empfohlenen Konzentrationen sowie Konzentrationen oberhalb und unterhalb der empfohlenen Konzentration.
2. Bereiten Sie formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe auf Dias vor.
   1. Mit einem Mikrotome Blöcke aus FFPE-Gewebe mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m schneiden und auf geladene Dias auftragen.
      HINWEIS: Die Verwendung von destilliertem Wasser sorgt für eine ordnungsgemäße Gewebemontage und Haftung im gesamten Multiplex.
   2. Die Dias flach, Gewebeseite nach oben legen und bei 37 °C über Nacht trocknen lassen.
   3. Bewahren Sie Dias in einer Folienbox weg von extremer Temperatur auf, bis sie bereit sind, das Multiplex abzuschließen.

2. Allgemeine Färbemethode

1. Vorbereitung von Wasch- und Antigen-Retrieval-Lösungen
   1. Bereiten Sie die Waschlösung von 0,1% TBST vor, indem Sie 9 L entionisiertes Wasser, 1 L Tris gepufferte Salzsalzlösung (TBS) und 10 ml Polysorbat 20 mischen.
   2. Bereiten Sie beide Antigen-Retrieval-Lösungen (pH 6 und pH 9; Materialtabelle) durch Verdünnen auf 1x mit entionisiertem Wasser.
2. Deparaffinierung und Rehydratation
   1. Dias backen, flach liegen, Gewebeseite bei 60 °C für 1 h im Hybridisierungsofen¹. Entfernen Sie die Dias aus dem Ofen und lassen Sie sie mindestens 5 x 10 min abkühlen und dann in ein vertikales Schiebeträger stecken.
   2. Behandeln Sie die Dias in den folgenden Lösungen sequenziell: Xylol in Dreifacharbeit, gefolgt von einer einzigen Behandlung von 100% Ethanol, 95% Ethanol und schließlich 70% Ethanol für je 10 min mit einem Gleitfärbeset¹.
   3. Waschen Sie das Zahnstangengestell für 2 min mit entionisiertem Wasser durch Tauchen in einer Kunststoff-Schiebebox gefolgt von Fixierung durch Untertauchen in einer Kunststoff-Schiebebox gefüllt mit neutral gepufferten Formalin für 30 min¹³. Waschen Sie die Rutschen in entionisiertem Wasser für 2 min dann gehen Sie zu Antigen-Retrieval.
3. Antigen-Retrieval
   1. Legen Sie das Zahnradregal in eine hitzebeständige Box, die mit pH 6 oder pH 9 Antigen-Abrufpuffer an die Innenleitung (ca. 300 ml) gefüllt ist.
      HINWEIS: Antigen-Abrufpuffer kann entweder pH 6 oder pH 9 sein, die möglicherweise pro Epitop optimiert werden müssen. Verwenden Sie jedoch zunächst pH 9 für Antikörper, die an nukleare Epitope binden, und pH 6 für alle anderen Antikörper.
   2. Bedecken Sie die Box mit Plastikfolie und verwenden Sie ein Gummiband, um zu sichern. Legen Sie die Box in die Mikrowelle am Rand der rotierenden Platte (Mikrowelle muss mit Wechselrichter-Technologie für gleichmäßiges Heizen ausgestattet sein). Erhitzen Sie die Rutschen für 45 s mit 100% Leistung gefolgt von 15 min bei 20% Leistung¹³.
      HINWEIS: Die Mikrowellenbehandlung kann je nach verwendeter Mikrowelle optimiert werden müssen.
   3. Lassen Sie die Dias ca. 15 bis 20 min abkühlen.
4. Bereiten Sie Arbeitslösungen von Antikörpern und Fluorophoren vor, während die Dias abkühlen.
   1. Bereiten Sie das primäre Antikörperverdünnungsmittel vor, indem Sie 0,5 g Rinderserumalbumingranulat in 50 ml TBST auflösen. Alternativ können Sie 50 ml 1x Phosphatgepufferte Saline (PBS) verwenden, um Granulat aufzulösen.
   2. Machen Sie jede primäre Antikörperarbeitslösung für die optimierte Konzentration, die in Abschnitt 1 im primären Antikörperverdünner bestimmt wird. Schätzen Sie ca. 200 l pro Folie.
   3. Bereiten Sie die Fluorophor-Arbeitslösung vor, indem Sie jedes Fluorophor im Fluorophor-Verdünnungsmittel in einer Konzentration von 1:100 verdünnen.
      HINWEIS: Dies muss möglicherweise je nach Antikörper optimiert werden. Schätzen Sie ca. 100 l pro Folie.
   4. Bereiten Sie am letzten Tag der Färbung die Arbeitslösung 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) vor, indem Sie 3 Tropfen DAPI in 1 ml TBST hinzufügen.
5. Gleitfärbung (Waschen und Blockieren)
   1. Entfernen Sie die Box aus der Mikrowelle nach dem Abkühlen und nehmen Sie die Kunststofffolie, waschen Sie die Dias mit entionisiertem Wasser für 2 min gefolgt von einer 2 min Waschen in einer Kunststoff-Schiebebox gefüllt TBST¹³.
   2. Nach dem Trocknen jeder Rutsche um das Gewebe mit einer empfindlichen Aufgabe wischen Darauf achten, das Gewebe nicht austrocknen lassen, verfolgen um die Außenseite des Gewebes mit einem hydrophoben Barriere-Stift. Berühren Sie das Gewebe nicht mit dem empfindlichen Aufgabenwisch oder Stift.
   3. Legen Sie jede Rutsche in die befeuchtete Kammer und fügen Sie dem Gewebe eine Blockierlösung (ca. 4 Tropfen) hinzu. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
6. Gleitfärbung (primäre Antikörperanwendung)
   1. Nehmen Sie jede Folie und entfernen Sie die blockierende Lösung, indem Sie auf die Seite der Folie auf einem Stapel von Papiertüchern tippen und eine empfindliche Aufgabe wischen, um überschüssiges Blockierungsmittel aus dem Gewebe zu entfernen.
   2. Legen Sie das Dia wieder in die befeuchtete Kammer und fügen Sie etwa 200 L des arbeitenden Primärantikörpers hinzu. Inkubieren Sie in der befeuchteten Kammer für 1 h bei RT.
   3. Waschen Sie mit TBST für 2 min durch Tauchen in dreifacher Ausführung¹³.
      HINWEIS: Nach jedem Waschschritt wird durch das Ändern des TBST ein saubereres Bild sichergestellt.
7. Gleitfärbung (sekundäre Antikörperanwendung)
   1. Die verbleibenden TBST von jeder Rutsche abziehen und ca. 3 bis 4 Tropfen sekundären Antikörpern (Mischung aus Kaninchen und Maus sekundären HRP konjugierten Antikörpern) auftragen. 10 min in der befeuchteten Kammer bei RT¹³brüten.
      ANMERKUNG: Wenn Sie einen primären Antikörper verwenden möchten, der einen anderen sekundären Antikörper als Maus oder Kaninchen erfordert, oder einen alternativen sekundären Antikörper verwenden möchten, wenden Sie den entsprechenden HRP konjugierten Sekundäraufden auf die Dias an und inkubieren Sie bei RT für 45 min. Inkubationszeit kann für die alternative sekundäre¹⁴benötigt werden.
   2. Nach der Inkubation mit TBST für 2 min in Dreifache¹³waschen.
8. Gleitfärbung (Fluorophor-Anwendung)
   1. Etwa 100 l der Fluorophor-Arbeitslösung auftragen und in der befeuchteten Kammer bei RT 10 min¹³inkubieren.
   2. Waschen Sie mit TBST für 2 min in dreifacher Ausführung¹³.
9. Entfernung von Antikörpern
   1. Mikrowellenrutschen (45 s bei 100% dann 15 min bei 20%) in der hitzebeständigen Box (siehe Schritt 2.3.2) zur Entfernung von Antikörpern^13,14.
      HINWEIS: Damit wird eine Runde des Multiplexs abgeschlossen. Dies ist der einzige Punkt, an dem das Protokoll angehalten werden kann. Um das Protokoll anzuhalten, lassen Sie die Dias über Nacht bei Raumtemperatur im Antigen-Abrufpuffer untergetaucht.
10. Weitere Färberunden. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.9.1 für die übrigen Antikörper-Fluorophor-Paare. Sobald alle Antikörper und Fluorophore verwendet wurden, fahren Sie mit Abschnitt 2.11 fort.
11. DAPI-Anwendung und -Montage
    1. Nach der letzten Färberunde im Multiplex entfernen Sie die letzte Antikörperanwendung mit Antigen-Retrievallösung pH 6¹³. Waschen Sie mit entionisiertem Wasser, gefolgt von TBST für 2 min je¹³.
    2. Tragen Sie ca. 150 l der arbeitenden DAPI-Lösung auf Dias auf und inkubieren Sie in der befeuchteten Kammer 10 min bei RT¹.
    3. Mit TBST ca. 30 s waschen und Abdeckungen mit einem Antifade-Mountant montieren. Nach dem Trocknen des Montagemediums an den vier Ecken des Deckels, sobald das Montagemedium getrocknet ist, um den Deckel zu sichern (optional), müssen Sie klare Fingernagellackur auftragen.

3. Details für Bibliothek, Monoplexe und Multiplex

1. Wählen Sie Folien für den Aufbau einer Fluorophorbibliothek aus.
   1. Für einen 7-Farben-Multiplex sammeln 7 Immunzellreiche Gewebe-Dias (d.h. Mandeln, Milz, etc.) für die Bibliothek.
      HINWEIS: Wählen Sie Steuerfolien aus, die für eine Fluorophorbibliothek verwendet werden sollen, wobei jede Folie jedes einzelne Fluorophor darstellt, das im Multiplex verwendet wird. Kontrollschlitten sollten ein reichliches Epitop der Wahl haben und können für jedes Fluorophor die gleiche Art von Gewebe sein.
2. Flecken- und Bildbibliotheksfolien zur Verwendung mit Monoplexen und Multiplexen.
   1. Führen Sie die Schritte 2.1-2.9.1 mit den Steuerschlitten und der Steuerung von Gewebeschlitten Ihrer Wahl aus. Legen Sie ein anderes Fluorophor auf jeder Folie mit einer Konzentration von 1:100; eine Folie sollte nur DAPI enthalten.
   2. Fahren Sie mit Abschnitt 2.11 fort, außer dAPI-Färbung wegzulassen, und verwenden Sie stattdessen TBST und Mount wie beschrieben.
   3. Nachdem Sie Dias über Nacht trocknen lassen, bilden Sie mit allen Kanälen DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, Halbleiterquantenpunkten und Fluoresceinisothiocyanat (FITC), das die Belichtung s. 250 ms mit der Sättigungsschutzfunktion¹einstellt.
      HINWEIS: Die Belichtungszeiten können auf 50 bis 250 ms¹³eingestellt werden.
   4. Laden Sie die Bibliotheksbilder auf die Software hoch und verwenden Sie sie bei der Analyse der Monoplexe und Multiplex.
3. Wählen Sie Folien für Monoplexe aus.
   1. Wählen Sie Steuerfolien, die ein reichliches Epitop ihrer Wahl haben, basierend auf optimierten Antikörpern (Abschnitt 1). Wählen Sie für jede Färbungsrunde im Multiplex die Anzahl der Steuerelementfolien aus, um Monoplexe zu erstellen.
      HINWEIS: Der Zweck des Monoplexistes ist es, die beste Position (Ordnung) für jeden Antikörper zu bestimmen, der im Multiplex verwendet werden soll.
4. Fleckenmonoplexe.
   1. Folgen Sie den Abschnitten 2.1-2.11 mit dem primären Antikörper in einer anderen Reihenfolge (Position) für jede der Folien. Auf jeder Folie sollte nur ein Primärantikörper in einer anderen Position (Position) angewendet werden, die sich von den anderen Folien unterscheidet.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Folie, bei der die Runde keinen primären Antikörper oder Fluorophor erfordert, stattdessen primäres Antikörperverdünnungsmittel und Fluorophorverdünnungsmittel¹³.
5. Bild diagleitet und analysiert das Monoplex.
   1. Mit dem Mikroskop und der Einstellung der Belichtungszeit auf 250 ms für alle Kanäle erfassen jedes Bild unter Verwendung von DAPI zu fokussieren.
      HINWEIS: Die Belichtungszeiten können auf 50 bis 250 ms¹⁴eingestellt werden.
   2. Mit Hilfe der Analysesoftware bewerten Sie jedes Monoplex-Dia, indem Sie die fluoreszierende Intensität des gebeizten Markers betrachten.
   3. Vergleichen Sie diese Intensität mit dem Hintergrund. Wenn er mindestens 5 bis 10 Mal höher ist als der Hintergrund, ist die Position dieses Dias eine optimale Position, die im endgültigen Multiplex verwendet werden kann.
6. Wählen Sie Folien für das Multiplex aus.
   1. Wählen Sie die Folien von Interesse und fügen Sie eine zusätzliche Folie als leere Folie für die Subtraktion der Autofluoreszenz nach Färbung und Bildgebung verwendet werden.
7. Stain der Multiplex.
   1. Wählen Sie auf der Grundlage der Monoplex-Ergebnisse die passende Reihenfolge (Positionen) für jeden Antikörper auf Basis von Schritt 3.5.3 aus. Weisen Sie jedes Fluorophor einem Antikörper zu.
      HINWEIS: Dies kann eine Optimierung erforderlich sein; jedoch planen, helle Antikörper für weniger reichlich eimierte Marker¹zu verwenden, kolokalisierende Antikörper sollten mit Fluorophoren in weiten Spektren von einander¹³abgeglichen werden, und Fluorophore mit dem Spektrum 540 und 570 sollten nicht aufgrund von zu spektralen Überlappungsproblemen¹.
   2. Fahren Sie mit den Abschnitten 2.1-2.11 fort, um sicherzustellen, dass der Blindschlitten keine primären Antikörper, Fluorophor oder DAPI erhält, sondern stattdessen Antikörperverdünnung, Fluorophorverdünnung stritten und TBST an seiner Stelle verwenden.
8. Bildmultiplex und Analyse auf Integrität der Färbung
   1. Mit dem Mikroskop und der Einstellung der Belichtungszeit auf 250 ms für alle Kanäle, erfassen Sie jedes Bild mit DAPI zu fokussieren.
   2. Bewerten Sie mit der Analysesoftware (Tabelle der Materialien) jeden Multiplex anhand einer fluoreszierenden falschen Farbe.
      HINWEIS: Ein klares Bild sollte jede Markierung deutlich zeigen. Wenn ein Marker diffus und körnig aussieht oder nicht vorhanden ist, funktioniert der Marker wahrscheinlich nicht und muss erneut optimiert werden.
   3. Bewerten Sie mit der Analysesoftware jedes Multiplex nach Pathologieansicht. Die Pathologieansicht bestätigt die Spezifität jedes Markers. Vergleichen Sie mit IHC zuvor optimiert (Abschnitt 1).

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Ergebnisse

Der gesamte Prozess der Erlangung eines 7-Farben-Multiplex-Assays folgt einem sich wiederholenden Muster. Abbildung 1 beschreibt den Prozess in einer schemamatischen Form. Sobald die Dias geschnitten und getrocknet oder aus dem Labor empfangen und in einem Hybridisierungsofen bei 60 °C für 1 h gebacken werden, dann gehen Sie zur Deparaffinierung und Rehydrierung, fixieren Sie die Dias in Formalin wieder, gefolgt von Antigen-Retrieval. Jede Multiplexing-Runde beginnt bei der Antigenabrufung...

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Diskussion

Intakte Gewebeproben aus der soliden Tumorbiopsie und der chirurgischen Resektion bleiben wichtige diagnostische und prädiktive Werkzeuge für die Krankheitsanalyse sowie patientenprognose. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) ist eine neuartige Technik, die die Vorteile der Immunhistochemie (IHC), der Immunfluoreszenz (IF) und der Durchflusszytometrie kombiniert. Frühere Methoden zur Untersuchung von Zellen vor Ort haben die Auswertung der Zell-zu-Zell-Anordnungen in einer Gewebeumgebung

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL