Ottimizzazione, progettazione ed evitare le falle nella immunostiera fluorescente manuale

Riepilogo

L'immunohistochimica fluorescente multiplex è una tecnologia emergente che consente la visualizzazione di più tipi di cellule all'interno del tessuto incorporato in parina (FFPE) intatto. Le linee guida presentate sono linee guida per garantire un multiplex a 7 colori di successo con istruzioni per ottimizzare anticorpi e reagenti, preparare diapositive, progettare e suggerimenti per evitare problemi comuni.

Abstract

La valutazione microambiente del tessuto intatto per l'analisi dell'infiltrazione cellulare e dell'organizzazione spaziale è essenziale per comprendere la complessità dei processi della malattia. Le tecniche principali utilizzate in passato includono l'immunosintochimica (IHC) e l'immunofluorescenza (IF) che consentono la visualizzazione delle cellule come un'istantanea nel tempo utilizzando tra 1 e 4 marcatori. Entrambe le tecniche presentano carenze, tra cui difficoltà a macchiare obiettivi scarsamente antigenici e limitazioni legate alla reattività tra specie. IHC è affidabile e riproducibile, ma la natura della chimica e della dipendenza dallo spettro della luce visibile consente di utilizzare solo pochi marcatori e rende difficile la co-localizzazione. L'uso di IF amplia i potenziali marcatori, ma in genere si basa sul tessuto congelato a causa dell'estesa autofluorescenza dei tessuti dopo la fissazione della formalina. Citometria di flusso, una tecnica che consente l'etichettatura simultanea di più epitopi, abroga molte delle carenze di SE e IHC, tuttavia, la necessità di esaminare le cellule come una singola sospensione cellulare perde il contesto spaziale delle cellule che scartano importanti sostanze biologiche Relazioni. L'immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) collega queste tecnologie consentendo la fenotipizzazione cellulare multi-epitopo nel tessuto incorporato a paraffina fissa di formalina (FFPE), preservando l'architettura complessiva del microambiente e lo spazio relazione delle cellule all'interno di tessuto intatto senza interruzioni. L'alta intensità fluorescente fluorofori che si legano covalentmente all'epitopo tissutale consente l'applicazione multipla di anticorpi primari senza preoccuparsi della reattività incrociata specifica delle specie da parte di anticorpi secondari. Anche se questa tecnologia ha dimostrato di produrre immagini affidabili e accurate per lo studio della malattia, il processo di creazione di un'utile strategia di colorazione mfIHC può richiedere molto tempo e richiede molto tempo e richiede grazie a un'ampia ottimizzazione e progettazione. Al fine di creare immagini robuste che rappresentano interazioni cellulari accurate in loco e per mitigare il periodo di ottimizzazione per l'analisi manuale, presentate qui sono metodi per la preparazione delle diapositive, l'ottimizzazione degli anticorpi, la progettazione del multiplex e gli errori comunemente riscontrato durante il processo di colorazione.

Introduzione

La visualizzazione di un microambiente tumorale intatto (TME) è essenziale nella valutazione non solo dell'infiltrazione cellulare nelle neoplasie solide, ma anche delle interazioni tra cellule e cellule. L'immunoistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è emersa come uno strumento efficace per la fenofitipo multi-antigene delle cellule nello studio del cancro e delle malattie associate^{1,2,3,4, 5,6,7}. Questo, in combinazione con nuovi software e programmi progettati per analizzare grandi set di dati, consente l'osservazione di interazioni complesse tra le celle^1,2,4. Il fattore di limitazione del tasso nell'acquisizione dei dati è spesso la qualità del tessuto macchiato prima dell'analisi.

Le tecniche precedenti utilizzate per le cellule fenotipiche nel TME includono l'immunosintochimica (IHC), l'immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso che presentano limitazioni significative. IHC utilizza le sezioni di tessuto di paraffina fissa (FFPE) formalina che vengono deparaffinate e reidratate prima di essere macchiate dal più delle volte un anticorpo. L'uso di un anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano (HRP) e una reazione chimica consente la visualizzazione di un singolo epitopo antigenico⁸. Mentre IHC è affidabile ed eseguito su tessuto FFPE che è facile da lavorare, limitazioni allo spettro di luce visibile significa che solo uno o due marcatori possono essere affidabili distinti e co-localizzazione di antigeni abbastanza difficile⁸. Un modo per espandere i marcatori disponibili e quindi gli antigeni che possono essere sondati su una singola sezione è quello di passare alla fluorescenza che consente l'uso di una gamma più ampia dello spettro visivo. Per IF, il tessuto congelato o FFPE viene trasferito su vetrini e anticorpi utilizzati che sono coniugati a vari fluorofori. Mentre questo aumenta il numero di antigeni che possono essere sondati, ci sono diverse limitazioni importanti. In primo luogo, poiché ogni anticorpo in genere ha solo un fluoroforo attaccato, la luminosità spesso non è abbastanza forte per superare l'autofluorescenza dei tessuti. È per questo motivo, la maggior parte IF viene eseguita su tessuto congelato che è costoso da memorizzare e difficile da lavorare. Un numero limitato di tag fluorescenti sono disponibili per l'uso a causa della sovrapposizione spettrale e della reattività delle specie incrociate, in particolare quando vengono utilizzati anticorpi non coniugati. La citometria di flusso, che consiste nell'elaborazione di tessuti freschi in una singola sospensione cellulare enell'etichettatura con anticorpi fluorescenti è stato il gold standard per l'immunofenofizzazione per decenni 9,¹⁰. Un vantaggio della citometria di flusso è la capacità di etichettare più anticorpi senza preoccuparsi della reattività incrociata delle specie, poiché la maggior parte è coniugata. Poiché le cellule sono "visualizzate" da una macchina e non da occhi umani, ci sono molti più fluorofori disponibili, ma questo ha un costo. La compensazione deve essere fatta manualmente che può alterare significativamente i risultati producendo popolazioni false positive e negative. La limitazione più significativa della citometria di flusso è che l'architettura dei tessuti e successivamente tutte le informazioni spaziali vengono perse dalla necessità di sospensione di singole cellule.

Multiplex fluorescente immunohistochimica (mfIHC) utilizzando un microscopio fluorescente automatizzato in combinazione con un nuovo software combina i benefici di IHC, SE e citometria di flusso, consentendo la colorazione dei tessuti multi-antigene con l'amplificazione del segnale e mantenimento delle relazioni spaziali senza la necessità di una compensazione. Il tessuto FFPE viene posto su vetrini carichi che, dopo il recupero dell'antigene, subiscono un ciclo di applicazione primaria dell'anticorpo all'antigene bersaglio di interesse seguito da un anticorpo secondario con un tag chimico HRP, simile all'IHC. Dopo il posizionamento dell'anticorpo secondario, una reazione specifica HRP si traduce in un fluoroforo che si lega covalentmente all'epipologo di interesse¹¹. Una volta etichettato il tessuto, un altro ciclo di riscaldamento dei vetrini viene completato rimuovendo il complesso anticorpale primario e secondario precedentemente applicato lasciando solo il tag fluorescente legato all'epitopo del tessuto¹¹. Ciò consente di riapplicare più anticorpi di qualsiasi specie senza preoccuparsi della reattività incrociata^11,12. Per ridurre al minimo la necessità di una compensazione manuale di più coloranti fluorescenti, una raccolta di fluorofori con poca sovrapposizione spettrale, inclusa una macchia nucleare, viene utilizzata per completare il mfIHC. Per tenere conto dell'autofluorescenza incontrata con il tessuto FFPE, il software sottrae l'autofluorescenza dall'immagine finale utilizzando un'immagine da una diapositiva vuota che è possibile a causa della forza della fluorescenza specifica dell'antigene dopo fluoroforo l'amplificazione del segnale. Utilizzando nuovi programmi progettati per grandi set di dati, le posizioni delle celle possono essere identificate e analizzate per il contesto spaziale^1,2,4. La limitazione più significativa di questa tecnica è il tempo di ottimizzazione. Una metodologia dettagliata con istruzioni per la progettazione sperimentale e la strategia di colorazione e imaging si trova qui. mfIHC sarà utile per i laboratori che attualmente non dispongono di un sistema di colorazione automatizzato ottimizzato che vorrebbe comprendere meglio il contesto spaziale delle interazioni cellula-cellula nel tessuto FFPE intatto utilizzando la tecnica manuale.

Protocollo

Tutto il lavoro è stato approvato dal comitato di revisione interna dell'Università del Michigan.

1. Ottimizzazione degli anticorpi primari e preparazione dello scivolo

1. Determinare la concentrazione ideale di anticorpi per multiplex utilizzando IHC convenzionale.
   1. Testare gli anticorpi per il multiplex mediante immunoistochimica convenzionale manuale (IHC)¹³.
   2. Utilizzare tessuti specifici che hanno un tipo di cellula abbondante per ogni anticorpo testato come l'utilizzo di tessuto tonsille per il test anticorpale CD3.
   3. Utilizzare la concentrazione di riferimento per IHC raccomandata dall'azienda e quindi completare LHC con concentrazioni di anticorpi alle concentrazioni raccomandate, nonché le concentrazioni al di sopra e al di sotto della concentrazione raccomandata.
2. Preparare formalina tessuto incorporato paraffina fissa sulle diapositive.
   1. Utilizzando un microtoma, tagliare blocchi di tessuto FFPE ad uno spessore compreso tra 4 e 6 m e si applicano ai vetrini caricati.
      NOTA: l'utilizzo di acqua distillata garantisce il corretto montaggio dei tessuti e l'aderenza in tutto il multiplex.
   2. Posizionare i vetrini piatti, il lato dei tessuti verso l'alto, e lasciare asciugare a 37 gradi durante la notte.
   3. Conservare le diapositive in una scatola di diapositive lontano dalla temperatura estrema fino a quando non è pronto per completare il multiplex.

2. Metodo di colorazione generale

1. Preparazione di soluzioni di lavaggio e recupero dell'antigene
   1. Preparare la soluzione di lavaggio dello 0,1% TBST mescolando 9 L di acqua deionizzata, 1 L di tris tamponata salina (TBS) e 10 mL di polisoromatto 20.
   2. Preparare entrambe le soluzioni di recupero dell'antigene (pH 6 e pH 9; Tabella dei materiali) diluindo a 1x con acqua deionizzata.
2. Deparaffinazione e reidratazione
   1. Cuocere i vetrini, sdraiati piatti, lato dei tessuti fino a 60 gradi centigradi per 1 h in un forno di ibridazione¹. Togliere i vetrini dal forno e lasciare raffreddare per almeno 5-10 min, quindi mettere in un rack di scorrimento verticale.
   2. Trattare le diapositive nelle seguenti soluzioni in sequenza: xilene in triplice copia, seguito da un singolo trattamento di 100% etanolo, 95% etanolo e infine 70% etanolo per 10 min ciascuno utilizzando un set di colorazione slide¹.
   3. Lavare il rack di vetrini per 2 min con acqua deionizzata per sommersione in una scatola di diapositive di plastica seguita da fissazione per immorbidimento in una scatola di diapositive di plastica piena di formalina tampone neutra per 30 min¹³. Lavare i vetrini in acqua deionizzata per 2 min quindi procedere al recupero dell'antigene.
3. Recupero dell'antigene
   1. Collocare il rack di vetrini in una scatola resistente al calore riempita alla linea interna (circa 300 mL) con pH 6 o pH 9 antigene buffer.
      NOTA: il buffer di recupero dell'antigene può essere pH 6 o pH 9 che potrebbe essere necessario ottimizzare per ogni epitopo. Tuttavia, iniziare utilizzando il pH 9 per gli anticorpi che si legano agli epitopi nucleari e al pH 6 per tutti gli altri anticorpi.
   2. Coprire la scatola con pellicola trasparente e utilizzare un elastico per fissare. Posizionare la scatola nel forno a microonde sul bordo della piastra rotante (microonde deve essere dotato di tecnologia inverter per il riscaldamento uniforme). Riscaldare i vetrini per 45 s al 100% di potenza seguita da 15 min al 20% di potenza¹³.
      NOTA: il trattamento a microonde potrebbe richiedere l'ottimizzazione a seconda del forno a microonde utilizzato.
   3. Lasciare raffreddare gli scivoli per circa 15-20 min.
4. Preparare soluzioni di lavoro di anticorpi e fluorofori mentre gli scivoli sono freschi.
   1. Preparare il diluente anticorpo primario sciogliendo 0,5 g di granuli di albumina del siero bovino in 50 mL di TBST. In alternativa, utilizzare 50 mL di 1x fosfato buffered salina (PBS) per sciogliere i granuli.
   2. Rendere ogni soluzione di lavoro anticorpo primario per la concentrazione ottimizzata determinata nella sezione 1, nel diluente anticorpo primario. Stimare circa 200 L per diapositiva.
   3. Preparare la soluzione di lavoro del fluoroforo diludo ogni fluoroforo nel diluente del fluoroforo ad una concentrazione di 1:100.
      NOTA: Potrebbe essere necessario ottimizzarlo a seconda dell'anticorpo. Stimare circa 100 l per diapositiva.
   4. L'ultimo giorno di colorazione, preparare la soluzione di lavoro DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindole) aggiungendo 3 gocce di DAPI in 1 mL di TBST.
5. Colorazione del vetrino (lavaggio e blocco)
   1. Togliere la scatola dal microonde dopo il raffreddamento e togliere l'involucro di plastica, lavare i vetrini con acqua deionizzata per 2 min seguita da un lavaggio di 2 min in una scatola di diapositive di plastica riempita TBST¹³.
   2. Dopo aver asciugato ogni vetrino intorno al tessuto con un compito delicato pulire attentamente a non lasciare asciugare il tessuto, traccia intorno all'esterno del tessuto utilizzando una penna barriera idrofobica. Non toccare il tessuto con la delicata pulizia o penna.
   3. Posizionare ogni vetrino nella camera umidificata e aggiungere la soluzione di blocco (circa 4 gocce) al tessuto. Incubare per 10 min a temperatura ambiente (RT).
6. Colorazione diapositiva (applicazione anticorpale primaria)
   1. Prendere ogni diapositiva e rimuovere la soluzione di blocco toccando il lato della diapositiva su una pila di asciugamani di carta e utilizzando una delicata pulizia attività per rimuovere l'agente di blocco in eccesso da tutto il tessuto.
   2. Posare il vetrino nella camera umidificata e aggiungere circa 200 l dell'anticorpo primario funzionante. Incubare nella camera umidificata per 1 h a RT.
   3. Lavare con TBST per 2 min con un'immersione in triplice¹³.
      NOTA: dopo ogni passaggio di lavaggio, la modifica della TBST contribuirà a garantire un'immagine più pulita.
7. Colorazione del vetrino (applicazione anticorpale secondaria)
   1. Dab fuori la TBST rimanente da ogni diapositiva e applicare circa 3 a 4 gocce di anticorpo secondario (miscela di coniglio e topo secondario HRP anticorpi coniugati). Incubare per 10 min nella camera umidificata a RT¹³.
      NOTA: Se si pianifica l'uso di un anticorpo primario che richiede un anticorpo secondario diverso da mouse o coniglio o scegliendo di utilizzare un anticorpo secondario alternativo, applicare l'HRP appropriato coniugato secondario ai vetrini e incubare a RT per 45 min. tempo di incubazione può essere necessario per il secondario alternativo¹⁴.
   2. Dopo l'incubazione, lavare con TBST per2 min in triplice 13 .
8. Colorazione scorrevole (applicazione fluoroforo)
   1. Applicare circa 100 l della soluzione di lavoro del fluoroforo e incubare nella camera umidificata a RT per 10 min¹³.
   2. Lavare con TBST per 2 min in triplice¹³.
9. Rimozione di anticorpi
   1. Scivoli a microonde (45 s al 100% poi 15 min al 20%) nella scatola resistente al calore (vedi punto 2.3.2) per la rimozione degli anticorpi^13,14.
      NOTA: questo completa un round del multiplex. Questo è l'unico punto in cui il protocollo può essere messo in pausa. Per sospendere il protocollo, lasciare le diapositive immerse nel buffer di recupero dell'antigene durante la notte a temperatura ambiente.
10. Continuare ulteriori giri di colorazione. Ripetete i passi da 2,5,1 a 2,9,1 per il resto delle coppie anticorpo-fluoroforo. Una volta utilizzati tutti gli anticorpi e i fluorofori, procedere alla sezione 2.11.
11. Applicazione E montaggio DAPI
    1. Dopo l'ultimo giro di colorazione nel multiplex, rimuovere l'ultima applicazione anticorpale con soluzione di recupero antigene pH 6¹³. Lavare con acqua deionizzata seguita da TBST per 2 min ogni¹³.
    2. Applicare circa 150 - L della soluzione DAPI di lavoro per scivoli e incubare nella camera umidificata per 10 min a RT¹.
    3. Lavare con TBST per circa 30 s e montare i coperchi dei coperchi con un montante antisbidiscatore. Applicare lo smalto trasparente delle unghie ai quattro angoli del coperchio una volta che il supporto di montaggio si è asciugato per fissare il coperchio (opzionale).

3. Dettagli per libreria, monoplex e multiplex

1. Scegliere diapositive per la creazione di una libreria di fluorofori.
   1. Per un multiplex a 7 colori raccogliere 7 diapositive di tessuto ricco di cellule immunitarie (ad esempio, tonsille, milza, ecc. ) per la biblioteca.
      NOTA: Scegliere le diapositive di controllo da utilizzare per una libreria di fluorofori con ogni diapositiva che rappresenta ogni fluoroforo univoco che verrà utilizzato nel multiplex. I vetrini di controllo devono avere un abbondante epitopo di scelta e possono essere lo stesso tipo di tessuto per ogni fluoroforo.
2. Colorato e diapositive della libreria di immagini per l'uso con monoplex e multiplex.
   1. Seguite i passaggi 2.1-2.9.1 utilizzando le diapositive di controllo e i vetrini dei tessuti che hanno scelto. Mettere un fluoroforo diverso su ogni vetrino ad una concentrazione di 1:100; una diapositiva deve contenere solo DAPI.
   2. Procedere alla sezione 2.11 tranne omettere la colorazione DAPI e utilizzare invece TBST e montare come descritto.
   3. Dopo aver lasciato i vetrini asciugare durante la notte, immagine con tutti i canali DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, punti quantici semiconduttori, e fluorescein isothiocyanate (FITC) impostando l'esposizione a 250 ms con la funzione di protezione della saturazione¹.
      NOTA: i tempi di esposizione possono essere impostati a 50-250 ms¹³.
   4. Caricare le immagini della libreria sul software e utilizzare nell'analisi dei monoplex e multiplex.
3. Scegliere le diapositive per i monoplex.
   1. Scegliere diapositive di controllo che hanno un abbondante epitopo di scelta in base agli anticorpi ottimizzati (sezione 1). Per ogni giro di colorazione da eseguire nel multiplex, selezionare il numero di diapositive di controllo per creare monoplex.
      NOTA: Lo scopo del monoplex è quello di determinare la posizione migliore (ordine) per ogni anticorpo da utilizzare nel multiplex.
4. Monoplex di macchia.
   1. Seguite le sezioni 2.1-2.11 usando l'anticorpo primario in un ordine diverso (posizione) per ciascuna delle diapositive. Ogni diapositiva deve avere un solo anticorpo primario applicato in un ordine (posizione) diverso rispetto alle altre diapositive.
      NOTA: Per ogni diapositiva in cui il round non richiede anticorpi primari o fluorofori, utilizzare invece il diluente anticorpo primario e il diluente del fluoroforo¹³.
5. Immagini diapositive e analizzare il monoplex.
   1. Utilizzando il microscopio e impostando il tempo di esposizione a 250 ms per tutti i canali catturare ogni immagine utilizzando DAPI per mettere a fuoco.
      NOTA: i tempi di esposizione possono essere impostati a 50-250 ms¹⁴.
   2. Utilizzando il software di analisi valutare ogni diapositiva monoplex osservando l'intensità fluorescente del marcatore colorato.
   3. Confrontare questa intensità con lo sfondo. Se è almeno 5/10 volte superiore a quello dello sfondo, la posizione di quella diapositiva è una posizione ottimale da utilizzare nel multiplex finale.
6. Scegliere le diapositive per il multiplex.
   1. Scegliere le diapositive di interesse e aggiungere una diapositiva supplementare da utilizzare come diapositiva vuota per la sottrazione dell'autofluorescenza dopo la colorazione e l'imaging.
7. Macchia il multiplex.
   1. In base ai risultati monoplex, scegliere l'ordine appropriato (posizioni) per ogni anticorpo in base al passaggio 3.5.3. Assegnare ogni fluoroforo a un anticorpo.
      NOTA: potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione; tuttavia, il piano di utilizzare anticorpi luminosi per marcatori meno abbondanti¹, gli anticorpi co-localizzanti devono essere abbinati a fluorofori lontani l'uno dall'altro¹³, e i fluorofori con lo spettro 540 e 570 non devono essere co-localizzati a causa di alle emissioni spettrali di sovrapposizione¹.
   2. Procedere con le sezioni 2.1-2.11 assicurandosi che la diapositiva vuota non riceva anticorpi primari, fluoroforo o DAPI, ma utilizzare invece anticorpi diluenti, diluenti del fluoroforo e TBST rispettivamente al suo posto.
8. Immagine multiplex e analisi per l'integrità della colorazione
   1. Utilizzando il microscopio e impostando il tempo di esposizione a 250 ms per tutti i canali, acquisire ogni immagine utilizzando DAPI per mettere a fuoco.
   2. Utilizzando il software di analisi (Tabella dei materiali), valutare ogni multiplex per colore falso fluorescente.
      NOTA: un'immagine chiara dovrebbe dimostrare chiaramente ogni marcatore. Se un marcatore sembra diffuso e granuloso o è inesistente, è probabile che il marcatore non ha funzionato e deve essere ri-ottimizzato.
   3. Utilizzando il software di analisi, valutare ogni multiplex in base alla vista patologica. La vista patologica confermerà la specificità di ogni marcatore. Confrontare con IHC precedentemente ottimizzato (sezione 1).

Risultati

Il processo complessivo di ottenimento di un multiplex assay a 7 colori segue un modello ripetitivo. Figura 1 descrive il processo in una forma diagrammatica. Una volta che i vetrini vengono tagliati e asciugati o vengono ricevuti dal laboratorio e cotti in un forno di ibridazione a 60 gradi centigradi per 1 h, quindi procedere alla deparaffinazione e alla reidratazione, fissare nuovamente i vetrini in formalina seguiti dal recupero dell'antigene. Ogni round di multiplexing inizia al recuper...

Discussione

I campioni di tessuto intatti della biopsia tumorale solida e della resezione chirurgica rimangono importanti strumenti diagnostici e predittivi per l'analisi della malattia e la prognosi del paziente. L'immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è una nuova tecnica che combina i benefici dell'immunostochimica (IHC), l'immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso. Precedenti metodi per sondare le cellule in situ hanno permesso la valutazione delle disposizioni da cellula a cellula in un ambiente tissutale

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL