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摘要

多路荧光免疫组织化学是一项新兴技术,能够可视化完整形式固定的石蜡嵌入(FFPE)组织内的多种细胞类型。介绍了确保成功7色多路复用的指南,其中包含优化抗体和试剂、准备幻灯片、设计和避免常见问题的技巧的说明。

摘要

对完整组织进行微环境评估,用于分析细胞渗透和空间组织,对于了解疾病过程的复杂性至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光 (IF),这些技术能够使用 1 到 4 个标记将细胞可视化为快照。这两种技术都有缺点,包括难以染色不良的抗原靶点和与跨物种反应相关的局限性。IHC 是可靠和可重现的,但化学性质和对可见光光谱的依赖只允许使用几个标记,使共同本地化具有挑战性。使用IF拓宽了潜在的标记,但通常依赖于冷冻组织,由于形式固定后广泛的组织自荧光。流式细胞学,一种能够同时标记多个表位的技术,可消除IF和IHC的许多缺陷,然而,需要将细胞作为单个细胞悬浮液检查,从而失去了放弃重要生物的细胞的空间环境关系。多路复用荧光免疫组织化学 (mfIHC) 桥接这些技术,允许在形式固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织中进行多表细胞表型,同时保留整体微环境架构和空间完整未破坏组织内细胞的关系。高荧光强度荧光荧光荧光荧光荧光荧光荧光 , 共价结合组织表位 , 使初级抗体的多种应用 , 而不必担心二次抗体的物种特异叉反应。尽管该技术已被证明能够产生可靠和准确的疾病研究图像,但由于广泛的优化和设计,创建有用的 mfIHC 染色策略的过程可能非常耗时且耗时。为了制作能够准确定位的细胞交互的可靠图像,并减轻手动分析的优化周期,这里介绍了用于幻灯片准备、优化抗体、多路复用设计以及错误的方法在染色过程中经常遇到。

引言

完整的肿瘤微环境(TME)的可视化对于评估固体恶性肿瘤中的细胞渗透以及细胞与细胞的相互作用至关重要。多路荧光免疫组织化学(mfIHC)已成为研究癌症和相关疾病1、2、3、4, 5,6,7.这与设计用于分析大型数据集的新型软件和程序相结合,能够观察单元1、2、4之间的复杂相互作用。数据采集中的速率限制因子通常是分析前染色组织的质量。

以前用于 TME 中表型细胞的技术包括免疫组织化学 (IHC)、免疫荧光 (IF) 和流式细胞学,所有这些都存在重大限制。IHC使用形式固定石蜡嵌入(FFPE)组织部分,在被最常见的一种抗体染色之前,这些组织部分是去蜡化和再水化的。使用马萝卜过氧化物酶 (HRP) 结合二级抗体和化学反应允许可视化单个抗原表位8。虽然IHC是可靠的,并在FFPE组织上执行,这是容易使用,对可见光光谱的限制意味着只有一个或两个标记可以可靠地区分和共定位抗原相当困难8。扩展可用标记物,因此可在单个部分探测抗原的一种方法是更改为荧光,从而允许使用更广泛的视觉光谱。对于IF,冷冻或FFPE组织被转移到幻灯片上,并结合各种荧光团使用的抗体。虽然这会增加可以探测的抗原的数量,但有几个重要的局限性。首先,由于每个抗体通常只有一个荧光团,亮度通常不足以克服组织自荧光。正因如此,大多数IF是在冷冻组织上执行的,这种组织储存成本高昂,难以使用。由于光谱重叠和跨物种反应,可以使用数量有限的荧光标记,特别是在使用非结合抗体时。流动细胞学,包括新鲜组织加工成单个细胞悬浮液和荧光抗体标签,是免疫吸血功能的几十年9,10的黄金标准。流式细胞学的一个好处是能够标记多个抗体,而不必担心物种交叉反应,因为大多数是结合的。因为细胞是由机器而不是人眼"可视化"的,因此有更多的荧光道可用,但这样做是有代价的。补偿必须手动进行,这能显著改变产生假阳性和阴性群体的结果。流动细胞学的最大限制是组织架构和随后的所有空间信息因单细胞悬浮的必要性而丢失。

使用自动荧光显微镜与新型软件相结合的多路荧光免疫组织化学 (mfIHC) 结合了 IHC、IF 和流式细胞学的优点,允许多抗原组织染色,并实现信号扩增和无需补偿即可保留空间关系。FFPE组织被放置在带电的幻灯片上,在抗原检索后,对目标抗原进行一轮初级抗体应用,然后使用具有HRP化学标记的次级抗体,类似于IHC。放置二级抗体后,HRP特异性反应导致荧光团与兴趣表位11共价结合。一旦组织被标记,另一轮加热幻灯片完成删除先前应用的初级和二级抗体复合物只留下荧光标记绑定到组织表位11。这允许任何物种的多种抗体重新应用,而不必担心交叉反应11,12。为了尽量减少对多种荧光染料的人工补偿的需要,使用一组光谱重叠小(包括核计数器染色)的荧光光道来完成 mfIHC。为了考虑 FFPE 组织遇到的自荧光,软件使用空白幻灯片中的图像从最终图像中减去自荧光,这可能是由于荧光后抗原特异性荧光的强度信号放大。使用专为大型数据集设计的新型程序,可以识别和分析空间上下文1、2、4 的单元位置。该技术最大的限制是优化时间。此处提供了包含实验设计和染色和成像策略说明的详细方法。mfIHC 将可用于目前尚未优化的自动染色系统的实验室,该系统希望使用手动技术更好地了解完整 FFPE 组织中细胞与细胞间相互作用的空间环境。

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研究方案

所有工作都已获得密歇根大学内部审查委员会的批准。

1. 优化初级抗体和滑动制备

  1. 使用常规 IHC 确定多路复用抗体的理想浓度。
    1. 通过手动常规免疫组织化学(IHC)13测试多路复用抗体。
    2. 使用具有丰富细胞类型的特定组织,用于测试的每个抗体,例如使用扁桃体组织进行CD3抗体测试。
    3. 使用公司推荐的IHC参考浓度,然后以推荐浓度的抗体浓度完成IHC,以及高于和低于推荐浓度的浓度。
  2. 在幻灯片上准备正式固定石蜡嵌入组织。
    1. 使用微体,在厚度在4至6μm之间切割FFPE组织块,并应用于带电的幻灯片。
      注:使用蒸馏水可确保在整个多路复用过程中正确安装和粘附。
    2. 将幻灯片平放,组织侧朝上,并在 37°C 下过夜干燥。
    3. 将幻灯片存放在远离极端温度的幻灯片盒中,直到准备好完成多路复用。

2. 一般染色方法

  1. 洗涤和抗原检索溶液的制备
    1. 通过混合9 L的去离子水、1 L的三分缓冲盐水(TBS)和10 mL的聚山梨酸20,制备0.1%TBST的洗涤溶液。
    2. 准备两种抗原检索溶液(pH 6和pH9;材料表)用去离子水稀释到1倍。
  2. 脱蜡和补液
    1. 在杂交炉1中,在60°C下烘烤幻灯片,平放,组织侧向向上1小时。从烤箱中取出滑轨,冷却至少 5~10 分钟,然后放入垂直滑动机架中。
    2. 按顺序处理以下溶液中的幻灯片:三联苯中的二甲苯,然后单次处理 100% 乙醇、95% 乙醇,最后使用幻灯片染色集1进行 70% 乙醇处理,每次 10 分钟。
    3. 将去离子水浸入塑料滑动盒中,然后浸入装有中性缓冲形式塑料的滑动盒中,将水浸在30分钟13分钟,然后浸入塑料滑盒中,将滑架清洗2分钟。在去离子水中清洗幻灯片2分钟,然后继续抗原回收。
  3. 抗原检索
    1. 将滑片架放入一个耐热盒中,内部管(约 300 mL),使用 pH 6 或 pH 9 抗原检索缓冲液。
      注:抗原检索缓冲液可以是pH 6或pH 9,可能需要根据表位进行优化。然而,首先使用pH9来结合核表位的抗体和pH6的所有其他抗体。
    2. 用塑料包装盖住盒子,用橡皮筋固定。将盒子放入旋转板边缘的微波炉中(微波炉必须配备逆变器技术,以便均匀加热)。以 100% 的功率加热幻灯片 45 秒,然后以 20%的功率加热 15 分钟。
      注:微波处理可能需要根据所使用的微波进行优化。
    3. 让幻灯片冷却约 15-20 分钟。
  4. 在滑凉时准备抗体和荧光道的工作溶液。
    1. 通过将 0.5 克牛血清白蛋白颗粒溶解成 50 mL 的 TBST,制备原抗体稀释剂。或者,使用50 mL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解颗粒。
    2. 使每个初级抗体的溶液工作到第 1 节中确定的优化浓度,即初级抗体稀释剂中。估计每张幻灯片约 200 μL。
    3. 在浓度为1:100的荧光稀释剂中稀释每个荧光酸溶液,制备荧光酸液。
      注:这可能需要根据抗体进行优化。估计每张幻灯片约 100 μL。
    4. 在染色的最后一天,通过在TBST的1mL中加入3滴DAPI,制备4+,6-二酰胺-2-苯胺醇(DAPI)工作溶液。
  5. 滑动染色(洗涤和堵塞)
    1. 冷却后从微波炉中取出盒子,取下塑料包装,用去离子水清洗幻灯片2分钟,然后用填充TBST13的塑料滑动盒洗2分钟。
    2. 干燥后,每个幻灯片周围的组织用微妙的任务擦拭小心不要让组织干燥,跟踪周围的组织使用疏水屏障笔。请勿用细腻的任务擦拭或笔触摸组织。
    3. 将每张幻灯片放入加湿室,并在组织中加入阻滞溶液(约 4 滴)。在室温 (RT) 下孵育 10 分钟。
  6. 滑动染色(初级抗体应用)
    1. 抓住每张幻灯片,通过点击纸巾上的幻灯片侧面,并使用精细的任务擦除去除组织周围的多余阻滞剂,取出阻滞溶液。
    2. 将滑轨放回加湿室,并添加约 200 μL 的工作原抗体。在 RT 处在加湿室中孵育 1 小时。
    3. 用TBST洗涤2分钟,在三重体13中浸没。
      注:每次洗涤步骤后,更改 TBST 将有助于确保图像更干净。
  7. 滑动染色(二次抗体应用)
    1. 从每张幻灯片上清除剩余的TBST,并涂抹大约3至4滴的二次抗体(兔子和小鼠二次HRP结合抗体的混合物)。在RT13的加湿室中孵育10分钟。
      注:如果计划使用需要小鼠或兔子以外的二级抗体的初级抗体,或选择使用替代二级抗体,则对幻灯片应用适当的HRP共聚二次抗体,并在RT孵育45分钟。替代二级14可能需要孵育时间。
    2. 孵育后,用TBST在三联体13中洗涤2分钟。
  8. 滑动染色(荧光剂应用)
    1. 应用约100μL的荧光酸工作溶液,在RT的加湿室中孵育10分钟13。
    2. 用TBST洗涤2分钟,在三联体13。
  9. 抗体的去除
    1. 微波幻灯片(45 秒,100% 时,15 分钟,20%)在耐热盒(见步骤2.3.2)中去除抗体13,14。
      注:这将完成一轮多路复用。这是可以暂停协议的唯一点。要暂停协议,请让幻灯片在室温下在抗原检索缓冲液中过夜。
  10. 继续额外的污渍。对于抗体-荧光团的其余部分,重复步骤 2.5.1_2.9.1。一旦使用了所有抗体和荧光光道,继续执行第2.11节。
  11. DAPI 应用和安装
    1. 在多路复用中最后一轮染色后,用抗原检索溶液pH613去除最后一个抗体应用。用去离子水清洗,然后TBST每13分钟洗2分钟。
    2. 将大约 150 μL 的工作 DAPI 溶液涂抹到幻灯片上,并在加湿室中孵育 10 分钟,在 RT1。
    3. 用 TBST 清洗约 30 s,并安装带防褪色安装器的盖玻片。安装介质干燥后,在盖玻片的四个角涂抹清晰的指甲油,以确保盖玻片(可选)。

3. 库、单体和多路复用的详细信息

  1. 选择用于构建荧光库的幻灯片。
    1. 对于 7 色多路复用收集 7 免疫细胞丰富的组织幻灯片 (即扁桃体, 脾脏等) 为库。
      注: 选择用于荧光库的控制幻灯片,每张幻灯片表示将在多路复用中使用的每个唯一荧光。控制幻灯片应具有丰富的表位选择,并且可以是每种荧光剂的相同类型的组织。
  2. 污点和图像库幻灯片,用于单体和多路复用。
    1. 使用所选择的控制幻灯片和控制组织幻灯片执行步骤 2.1_2.9.1。将不同的荧光酸放在每张幻灯片上,浓度为1:100;一张幻灯片应仅包含 DAPI。
    2. 继续第 2.11 节,除非省略 DAPI 染色,而是按照所述使用 TBST 和安装。
    3. 在让幻灯片在一夜之间干燥后,所有通道的影像 DAPI、CY3、CY5、CY7、得克萨斯红、半导体量子点和氟素等氰酸酯 (FITC) 设置曝光 250 ms,具有饱和保护功能1。
      注:曝光时间可设置为50~250 ms13。
    4. 将库图像上传到软件,用于分析单体和多路复用。
  3. 为单体选择幻灯片。
    1. 根据优化的抗体选择具有丰富表位的控制幻灯片(第 1 节)。对于在多路复用中要完成的每一轮染色,选择该数量的控制幻灯片以创建单体。
      注: 单体的目的是确定在多路复用中使用的每个抗体的最佳位置(顺序)。
  4. 染色单体。
    1. 按照第 2.1_2.11 节,对每个幻灯片使用不同的顺序(位置)使用主抗体。每张幻灯片应只应用一个主抗体,其顺序(位置)与其他幻灯片不同。
      注:对于每张圆形不需要原发抗体或荧光团的幻灯片,则使用原发抗体稀释剂和荧光稀释剂13。
  5. 图像幻灯片并分析单体。
    1. 使用显微镜,将曝光时间设置为 250 ms,所有通道利用 DAPI 捕捉每个图像进行聚焦。
      注:曝光时间可设置为50~250 ms14。
    2. 使用分析软件通过查看染色标记的荧光强度来评估每个单体幻灯片。
    3. 将此强度与背景进行比较。如果该幻灯片至少比背景高 5-10 倍,则该幻灯片的位置是最终多路复用中的最佳位置。
  6. 选择多路复用的幻灯片。
    1. 选择感兴趣的幻灯片,并添加一张额外的幻灯片,用作染色和成像后自动荧光减法的空白幻灯片。
  7. 染色复用。
    1. 根据单体结果,根据步骤3.5.3为每个抗体选择适当的顺序(位置)。将每个荧光团分配给抗体。
      注意:这可能需要优化;然而,计划使用明亮的抗体对不太丰富的标记1,共定位抗体应匹配荧光道在遥远的光谱彼此13,和荧光540和570的荧光道不应该共同本地化,由于到光谱重叠问题1。
    2. 继续第 2.1-2.11 节,确保空白滑块不会接收原抗体、荧光酸或 DAPI,而是分别使用抗体稀释剂、荧光稀释剂和 TBST 代替其。
  8. 图像多路复用和分析染色的完整性
    1. 使用显微镜并将所有通道的曝光时间设置为 250 毫秒,利用 DAPI 捕捉每个图像进行聚焦。
    2. 使用分析软件(材料表),用荧光假色评估每个多路复用。
      注:清晰的图像应清楚地显示每个标记。如果标记看起来漫反射和颗粒状或不存在,则标记可能不起作用,需要重新优化。
    3. 使用分析软件,通过病理学视图评估每个多路复用。病理学观点将确认每个标记的特异性。与先前优化的 IHC 相比(第 1 节)。

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结果

获得 7 色多路测定的整个过程遵循重复模式。图 1以图表形式描述该过程。一旦幻灯片被切割和干燥,或从实验室收到,并在60°C的杂交炉中烘烤1小时,然后继续脱蜡和补液,修复幻灯片在形式再次,然后抗原检索。每一轮多路复用从抗原检索开始,在抗体去除时完成(图1)。

优化流程中的每个步骤对于实现清晰且可利用的图像至关重要。IHC...

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讨论

固体肿瘤活检和手术切除的结块组织标本仍然是疾病分析和患者预后的重要诊断和预测工具。多路复用荧光免疫组织化学(mfIHC)是一种将免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和流式细胞学的优点相结合的新技术。以前在原位探测细胞的方法允许评估细胞与细胞在组织环境中的排列8,然而,可探测的表位数量少限制了复杂的分析。流式细胞测定,虽然在分析标本中的许多细胞类型时很有用,?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者要感谢EdStack,以前来自珀金埃尔默,他协助设置和优化原始多路复用染色。作者还希望感谢来自阿科亚生物科学的克里斯汀·施密特使用分析软件的提示。本出版物中报道的研究得到了国家癌症研究所的支持,奖励编号为P30CA046592, K08CA201581(tlf),K08CA234222(js),R01CA15158807(mpm),RSG1417301CSM(mpm),R01CA19807403(mpm),U01CA22414501(mpm,hc),CA170568 (hc)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。杰弗瑞·科尔比结肠癌和汤姆·刘纪念研究基金提供了额外的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
100% ethanolFisherHC8001GAL
70% ethanolFisherHC10001GL
95% ethanolFisherHC11001GL
Analysis softwareAkoya BiosciencesCLS135783inForm version 2.3.0
Antifade mountantThermoFisherP36961ProLong Diamond
Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Cover SlipsFisher12-548-5E
Delicate task wipeKimberly-Clark34120
Fluorescent diluentAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA diluent
Fluorophore 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
Fluorophore 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorophore 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorophore 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorophore 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorophore 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorophore DAPIAkoya BiosciencesFP14903 drops in TBST or PBS
Heat resistant boxTissue-Tek25608-904Plastic slide box-green
Humidified ChamberIbi ScientificAT-12
Hybridization ovenFisherBiotech
Hydrophobic barrier penVectorH-4000ImmEdge
MicroscopePerkin ElmerCLS140089Mantra quantitative pathology workstation
MicrowavePanasonicNN-A661Swith inverter technology
Neutral buffered formalinFisher ScientificSF100-410% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval bufferAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 antigen retrieval bufferAkoya BiosciencesAR900AR9
Phosphate buffered salineFisherBP3994PBS
Plastic slide boxTissue-Tek25608-906
Plastic wrapFisherNC9070936
Polysorbate 20FisherBP337-800Tween 20
Primary antibody CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Primary antibody CD3DakoA04521:400
Primary antibody CD8Spring BioM53901:400
Primary antibody FOXP3DakoM35151:400
Primary antibody pancytokeratinCell Signaling126531:500
Primary antibody PD-L1Cell Signaling136841:200
Secondary antibodyAkoya BiosciencesARH1001EAOpal polymer
Slide stain setElectron Microscopy Sciences6254001
Tris buffered salineCorning46-012-CMTBS
Vertical slide rackElectron Microscopy Sciences50-294-72
XyleneFisherX3P1GAL

参考文献

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