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要約

多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。

要約

細胞浸潤および空間組織の分析のための無傷の組織の微小環境評価は、疾患プロセスの複雑さを理解する上で不可欠である。過去に使用された原理技術には、免疫組織化学(IHC)と免疫蛍光(IF)が含まれており、1~4マーカーを用いて時間内に細胞をスナップショットとして可視化することができます。いずれの技術も、抗原性の低い標的を染色するのが難しい、種間反応性に関する制限を含む欠点を有する。IHCは信頼性が高く再現可能ですが、可視光スペクトルに対する化学の性質と依存性により、少数のマーカーしか使用できず、共ローカリゼーションが困難になります。IFの使用は潜在的なマーカーを広げるが、通常、ホルマリン固定後の広範な組織自己蛍光による凍結組織に依存する。フローサイトメトリーは、複数のエピトープの同時標識を可能にする技術であり、IFおよびIHCの欠陥の多くを損なうが、単一細胞懸濁液として細胞を調べる必要性は、重要な生物学的生物学的を廃棄する細胞の空間的文脈を失う関係。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、これらの技術を橋渡しし、全体的な微小環境アーキテクチャと空間を維持しながら、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織におけるマルチエピトープ細胞表現を可能にします。無傷の組織内の細胞の関係。組織エピトープに共有結合する高蛍光強度蛍光蛍光ホルは、二次抗体による種特異的交差反応性を心配することなく、一次抗体の複数の応用を可能にする。この技術は、疾患の研究のための信頼性と正確な画像を生成することが証明されていますが、有用なmfIHC染色戦略を作成するプロセスは、広範な最適化と設計のために時間がかかり、厳密なことができます。現場で正確な細胞相互作用を表す堅牢な画像を作成し、手動分析の最適化期間を緩和するために、スライド準備、抗体の最適化、多重設計、エラーを示します。染色プロセス中に一般的に遭遇します。

概要

無傷の腫瘍微小環境(TME)の可視化は、固体悪性腫瘍における細胞浸潤だけでなく、細胞間相互作用も評価する上で不可欠である。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、癌および関連疾患1、2、3、4、および癌の研究における細胞の多抗原表現型の有効なツールとして出現した。 5,6,7.これは、大きなデータセットを分析するように設計された新しいソフトウェアおよびプログラムと組み合わせることで、セル1、2、4間の複雑な相互作用の観察を可能にする。データ取得におけるレート制限係数は、多くの場合、分析前の染色組織の品質です。

TMEで細胞を表現するために使用される以前の技術には、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーが含まれており、そのすべてが重要な制限を提示する。IHCは、最も頻繁に1つの抗体によって染色される前に、脱パラフィン化および水分補給されるホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織セクションを使用しています。ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体および化学反応の使用は、単一の抗原エピトープ8の可視化を可能にする。IHCは信頼性が高く、作業が容易なFFPE組織に対して行われるが、可視光スペクトルに対する制限は、1つまたは2つのマーカーのみが非常に困難な抗原の信頼できる区別およびコローカライズできることを意味する8。利用可能なマーカーを拡大し、したがって、単一のセクションでプローブすることができる抗原を拡大する方法は、視覚スペクトルのより広い範囲の使用を可能にする蛍光に変更することです。IFの場合、凍結またはFFPE組織は、様々な蛍石に結合されるスライドおよび抗体上に移される。これにより、プローブできる抗原の数が増加しますが、いくつかの重要な制限があります。第一に、各抗体は通常、蛍光素が1つしか付着していないため、明るさは組織の自己蛍光を克服するのに十分な強さではないことが多い。このため、ほとんどのIFは貯蔵が高価で作業が困難な凍結組織に対して行われる。特に非共役抗体を使用する場合は、スペクトルの重なりと異種反応性のために使用できる蛍光タグの限られた数が利用可能です。フローサイトメトリーは、新鮮な組織処理を単一細胞懸濁液に処理し、蛍光抗体による標識を行い、数十年にわたり免疫フェノタイピングのゴールドスタンダードとなっています9,10。フローサイトメトリーの利点は、ほとんどの場合が結合されているように、種の交差反応性を気にせずに複数の抗体にラベルを付ける能力です。細胞は人間の目ではなく機械によって「視覚化」されるので、利用可能な蛍煙がはるかに多くありますが、これはコストがかかります。報酬は手動で行う必要があり、誤った正と負の母集団を生み出す結果を大幅に変更する可能性があります。フローサイトメトリーの最も重要な制限は、組織アーキテクチャと、その後、すべての空間情報が単一細胞懸濁液の必要性によって失われるということです。

自動蛍光顕微鏡を用いた多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、IHC、IF、フローサイトメトリーの利点を組み合わせ、シグナル増幅による多抗原組織染色を可能にし、補償を必要とせずに空間的な関係を保持します。FFPE組織は、抗原検索後、目的の標的抗原に一次抗体適用のラウンドを受け、続いてIHCと同様のHRP化学タグを有する二次抗体を受ける荷電スライド上に置かれる。二次抗体の配置後、HRP特異的反応は、蛍色素が目的のエピトープ11に共有結合する結果をもたらす。組織が標識されると、スライドを加熱する別のラウンドが完了し、組織エピトープ11に結合した蛍光タグのみを残して、以前に適用された一次および二次抗体複合体を除去する。これにより、任意の種の複数の抗体を、交差反応性11、12を気にすることなく再適用することができる。複数の蛍光色素の手動補償の必要性を最小限に抑えるために、核カウンター染色を含むスペクトルの重みがほとんどない蛍光色素のコレクションを使用してmfIHCを完成させる。FFPE組織で遭遇した自己蛍光を考慮して、ソフトウェアは、蛍光色素に続く抗原特異的蛍光の強さのために可能である空白のスライドからの画像を使用して、最終的な画像から自己蛍光を減算します。信号増幅。大規模なデータセット用に設計された新しいプログラムを使用して、セルの位置を識別し、空間コンテキスト 1、2、4を分析できます。この手法の最も重要な制限は、最適化時間です。実験設計と染色およびイメージング戦略の手順を含む詳細な方法論がここに見つかります。mfIHCは、手動技術を使用して、無傷のFFPE組織における細胞間相互作用の空間的コンテキストをよりよく理解したい、最適化された自動染色システムを現在持っていない実験室に役立ちます。

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プロトコル

すべての作業は、ミシガン大学の内部審査委員会によって承認されています。

1. 一次抗体とスライド製剤の最適化

  1. 従来のIHCを用いて多重化に対する抗体の理想的な濃度を決定する。
    1. 手動従来の免疫組織化学(IHC)13により多重化の抗体を試験する。
    2. CD3抗体検査に扁桃組織を使用するなど、検査された抗体ごとに豊富な細胞型を持つ特定の組織を使用します。
    3. 同社が推奨するIHCの基準濃度を使用し、推奨濃度の抗体濃度と推奨濃度の上下濃度でIHCを完了します。
  2. ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織をスライド上に準備します。
    1. マイクロトームを使用して、4と6 μmの間の厚さでFFPE組織のブロックを切断し、充電されたスライドに適用します。
      注:蒸留水を使用すると、多重を通じて適切な組織の取り付けと付着が保証されます。
    2. スライドを平らにし、ティッシュ側を上に置き、一晩37°Cで乾燥させます。
    3. 多重化を完了する準備ができるまで、極端な温度から離れたスライド ボックスにスライドを格納します。

2. 一般的な染色方法

  1. 洗浄および抗原検索溶液の調製
    1. 脱イオン水の9L、トリス緩衝生理生理生理(TBS)の1L、ポリソルベート20の10mLを混合して0.1%TBSTの洗浄液を調製する。
    2. 両方の抗原検索溶液(pH 6およびpH9;)材料の表)脱イオン水で1xに希釈することによって。
  2. 脱パラフィン化と水分補給
    1. スライドを焼き、平らに横たわり、組織側を60°Cで1時間ハイブリダイゼーションオーブン1で焼く。オーブンからスライドを取り外し、少なくとも5-10分間冷却し、垂直スライドラックに置きます。
    2. 以下の溶液中のスライドを順次処理する:三重のキシレン、続いて100%エタノール、95%エタノール、最後にスライド染色セット1を用いてそれぞれ10分間70%エタノールの単一処理を行う。
    3. プラスチック製のスライドボックスに浸漬し、その後、30分間13分間、中性バッファホルマリンで満たされたプラスチック製のスライドボックスに沈むことで、脱イオン水で2分間スライドのラックを洗います。スライドを脱イオン水で2分間洗い、抗原の回収に進みます。
  3. 抗原検索
    1. スライドのラックを、pH 6 または pH 9 抗原検索バッファーで内部ライン (約 300 mL) に充填された耐熱ボックスに入れます。
      注:抗原検索バッファーは、エピトープごとに最適化する必要があるpH6またはpH9のいずれかでありうる。しかし、核エピトープに結合する抗体にはpH9を使用し、他のすべての抗体に対してpH6を使用します。
    2. 箱をプラスチックラップで覆い、ゴムバンドを使用して固定します。回転板の端にある電子レンジに箱を入れます(マイクロ波は、加熱するインバータ技術を備えておく必要があります)。100%の電力で45sのスライドを熱し、20%の電力13で15分続きます。
      注:マイクロ波処理は、使用するマイクロ波によって最適化が必要な場合があります。
    3. スライドを約15~20分間冷やします。
  4. スライドが涼しい間、抗体および蛍煙素の働く解決を準備する。
    1. ウシ血清アルブミン顆粒の0.5gをTBSTの50mLに溶解することにより、一次抗体希釈剤を調出す。あるいは、顆粒を溶解するために1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の50 mLを使用します。
    2. 各一次抗体作業溶液を、セクション1で決定した最適化濃度に対して、一次抗体希釈液で作る。スライドあたり約 200 μL と見積もる。
    3. 1:100の濃度で蛍油希釈液中の各蛍油を希釈することにより、蛍油作動溶液を調剤する。
      注:これは、抗体に応じて最適化する必要がある場合があります。スライドあたり約 100 μL と見積もる。
    4. 染色の最終日に、TBSTの1mLにDAPIの3滴を加えることによって4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)作業溶液を調製する。
  5. スライド染色(洗浄・遮断)
    1. 冷却後に電子レンジから箱を取り出し、プラスチックラップを取り外し、2分間脱イオン水でスライドを洗い、続いてプラスチック製のスライドボックスで2分間洗浄し、TBST13を充填したプラスチック製のスライドボックスで2分間洗浄する。
    2. 繊細なタスクで組織の周りの各スライドを乾燥させた後、組織が乾燥しないように注意して拭き取り、疎水性バリアペンを使用して組織の外側をトレースします。繊細な作業ワイプやペンでティッシュに触れないでください。
    3. 各スライドを加湿室に置き、組織にブロッキング溶液(約4滴)を追加します。室温(RT)で10分間インキュベートします。
  6. スライド染色(一次抗体塗布)
    1. 各スライドを取り、ペーパータオルのスタック上のスライドの側面をタップし、組織の周りから余分なブロッキング剤を除去するために繊細なタスクワイプを使用して、ブロッキング溶液を削除します。
    2. スライドを加湿室に戻し、働く一次抗体の約200 μLを追加します。RTで1時間加湿室でインキュベートします。
    3. トリプリケート13で浸漬して2分間TBSTで洗浄します。
      注:各洗浄ステップの後、TBSTを変更すると、よりクリーンなイメージを確保するのに役立ちます。
  7. スライド染色(二次抗体塗布)
    1. 各スライドから残りのTBSTを塗布し、約3~4滴の二次抗体(ウサギとマウスの二次HRP結合抗体の混合物)を塗布する。RT13で加湿室で10分間インキュベートする。
      注:マウスまたはウサギ以外の二次抗体を必要とする一次抗体を使用する場合、または代替二次抗体を使用することを選択する場合は、適切なHRP結合二次をスライドに適用し、RTで45分間インキュベートします。代替二次14にはインキュベーション時間が必要な場合がある。
    2. インキュベーション後、TBSTで2分間三部13で洗う。
  8. スライド染色(蛍色素塗布)
    1. フルオロフォア作動液の約100 μLを適用し、RTの加湿室で10分13のインキュベートする。
    2. 三つ三つ13で2分間TBSTで洗います。
  9. 抗体の除去
    1. マイクロ波スライド(100%で45s、20%で15分)抗体13、14の除去のための耐熱ボックス(ステップ2.3.2を参照)で。
      注: これで、多重の 1 ラウンドが完了します。これは、プロトコルを一時停止できる唯一のポイントです。プロトコルを一時停止するには、スライドを室温で一晩抗原検索バッファーに沈めたままにしておきます。
  10. 染色の追加のラウンドを続けます。抗体-フルオロフォアペアの残りの部分について、ステップ2.5.1−2.9.1を繰り返します。すべての抗体と蛍煙管が使用されたら、セクション2.11に進みます。
  11. DAPI アプリケーションとマウント
    1. 多重化における最後の染色ラウンドの後、抗原検索液pH 613を用いて最後の抗体塗布を除去する。脱イオン水で洗い、その後TBSTを2分ずつ13分ずつ洗う。
    2. 作業DAPI溶液の約150 μLをスライドに適用し、RT1で10分間加湿室でインキュベートします。
    3. 約30sのTBSTで洗浄し、アンチフェードマウントでカバースリップをマウントします。取り付けメディアが乾いてカバースリップを固定するために、カバースリップの四隅に明確な指のマニキュアを適用します(オプション)。

3. ライブラリ、モノプレックス、マルチプレックスの詳細

  1. 蛍煙素ライブラリを構築するためのスライドを選択します。
    1. 7色多重化のために、ライブラリ用の7つの免疫細胞豊富な組織スライド(すなわち、扁桃、脾臓など)を収集する。
      注: マルチプレックスで使用される各固有の蛍ッ素を表す各スライドを持つ蛍煙素ライブラリに使用するコントロール スライドを選択します。コントロールスライドは、選択の豊富なエピトープを持っている必要があり、各フルオロフォアのための組織の同じタイプであってもよいです。
  2. モノプレックスおよび多重で使用するためのステインおよびイメージ ライブラリ スライド。
    1. 選択したコントロールスライドとコントロールティッシュスライドを使用して、ステップ2.1−2.9.1に従ってください。1:100の濃度で各スライドに異なる蛍色素を置きます。1 つのスライドに DAPI のみを含める必要があります。
    2. DAPI 染色を省略する場合を除き、セクション 2.11 に進み、代わりに TBST とマウントを使用します。
    3. スライドを一晩乾燥させた後、DAPI、CY3、CY5、CY7、テキサスレッド、半導体量子ドット、蛍光線イソチオシアネート(FITC)を備えた画像を備え、飽和保護機能1で250ミリ秒に露出を設定します。
      注: 露出時間は 50−250 ミリ秒13に設定できます。
    4. ライブラリイメージをソフトウェアにアップロードし、モノプレックスとマルチプレックスの解析に使用します。
  3. モノプレックスのスライドを選択します。
    1. 最適化された抗体に基づいて、豊富なエピトープを持つコントロールスライドを選択します(セクション1)。多重で行われる染色のラウンドごとに、その数のコントロール スライドを選択してモノプレックスを作成します。
      注:モノプレックスの目的は、多重で使用される各抗体に最適な位置(順序)を決定することです。
  4. ステインモノプレックス。
    1. 各スライドの異なる順序(位置)で一次抗体を使用してセクション2.1−2.11に従ってください。各スライドには、他のスライドとは異なる順序(位置)に適用される一次抗体が1つだけ必要です。
      注:ラウンドが一次抗体または蛍河野を呼び出さない各スライドについて、代わりに一次抗体希釈剤および蛍油溶剤13を使用する。
  5. 画像スライドを行い、モノプレックスを解析します。
    1. 顕微鏡を使用し、すべてのチャンネルで露出時間を250ミリ秒に設定すると、DAPIを使用して各画像をキャプチャして焦点を合わせます。
      注: 露出時間は 50−250 ミリ秒14に設定できます。
    2. 分析ソフトウェアを用いて、染色されたマーカーの蛍光強度を見て各モノプレックススライドを評価する。
    3. この強度を背景と比較します。背景の 5~10 倍以上の高さである場合、そのスライドの位置は、最終的な多重で使用するのに最適な位置です。
  6. マルチプレックスのスライドを選択します。
    1. 目的のスライドを選択し、染色とイメージング後の自己蛍光を減算するための空白のスライドとして使用する余分なスライドを追加します。
  7. 多重を染色します。
    1. モノプレックス結果に基づいて、ステップ3.5.3に基づいて、各抗体の適切な順序(位置)を選択します。各蛍煙素を抗体に割り当てます。
      注: これは最適化が必要な場合があります。しかし、より少ないマーカー1に対して明るい抗体を使用する計画は、共局所抗体は互いに遠いスペクトル13の蛍色素と一致するべきであり、スペクトル540と570を有する蛍敵は共局所化されるべきではない。スペクトルオーバーラップ問題1.
    2. セクション2.1−2.11に進み、ブランクスライドが一次抗体、蛍油、またはDAPIを受け取らないようにし、代わりに抗体希釈剤、蛍油剤希釈剤、およびTBSTをそれぞれその場所で使用します。
  8. 画像多重化と染色の完全性を分析
    1. 顕微鏡を使用し、すべてのチャンネルの露出時間を250ミリ秒に設定し、DAPIを利用して各画像を撮影してピントを合わせます。
    2. 分析ソフトウェア(材料の表)を使用して、蛍光偽色で各多重を評価する。
      注: 明確な画像は、各マーカーを明確に示す必要があります。マーカーが拡散して粒状に見える場合、または存在しない場合は、マーカーが機能せず、再最適化する必要があります。
    3. 解析ソフトウェアを使用して、病理学ビューによって各多重を評価します。病理学ビューは、各マーカーの特異性を確認します。以前に最適化された IHC と比較します (セクション 1)。

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結果

7色多重アッセイを得る全体的なプロセスは、反復パターンに従う。図 1は、プロセスを図式形式で記述します。スライドを切断して乾燥させたり、実験室から受け取り、60°Cのハイブリダイゼーションオーブンで1時間焼き上げたら、デパラフィン化と水分補給に進み、再びホルマリンでスライドを固定し、抗原の検索を行います。多重化の各ラウンドは抗原検索から始?...

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ディスカッション

固形腫瘍生検および外科的切除からの無傷の組織標本は、疾患分析および患者の予後のための重要な診断および予測ツールのままである。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーの利点を組み合わせた新しい技術です。その場で細胞をプローブする以前の方法は、組織環境8における細胞間配置の評価を可能にしたが、し?...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者たちは、以前パーキン・エルマーから来たエド・スタックに、オリジナルの多重染色のセットアップと最適化に関する彼の支援に感謝したいと思います。著者らはまた、分析ソフトウェアを使用してヒントをアコヤバイオサイエンスからクリステンシュミットに感謝したいと思います。この出版物で報告された研究は、賞番号P30CA046592の下で国立がん研究所によってサポートされました, K08CA201581(1lf)、K08CA234222(js)、R01CA15158807(mpm)、RSG1417301CSM(mpm)、R01CA19807403(mpm)、U01CA22414501(午後)、hcCA170568 (hc)。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。ジェフリー・A・コルビー・コロン癌とトム・リウ記念研究基金による追加支援が行われました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100% ethanolFisherHC8001GAL
70% ethanolFisherHC10001GL
95% ethanolFisherHC11001GL
Analysis softwareAkoya BiosciencesCLS135783inForm version 2.3.0
Antifade mountantThermoFisherP36961ProLong Diamond
Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Cover SlipsFisher12-548-5E
Delicate task wipeKimberly-Clark34120
Fluorescent diluentAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA diluent
Fluorophore 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
Fluorophore 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorophore 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorophore 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorophore 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorophore 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorophore DAPIAkoya BiosciencesFP14903 drops in TBST or PBS
Heat resistant boxTissue-Tek25608-904Plastic slide box-green
Humidified ChamberIbi ScientificAT-12
Hybridization ovenFisherBiotech
Hydrophobic barrier penVectorH-4000ImmEdge
MicroscopePerkin ElmerCLS140089Mantra quantitative pathology workstation
MicrowavePanasonicNN-A661Swith inverter technology
Neutral buffered formalinFisher ScientificSF100-410% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval bufferAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 antigen retrieval bufferAkoya BiosciencesAR900AR9
Phosphate buffered salineFisherBP3994PBS
Plastic slide boxTissue-Tek25608-906
Plastic wrapFisherNC9070936
Polysorbate 20FisherBP337-800Tween 20
Primary antibody CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Primary antibody CD3DakoA04521:400
Primary antibody CD8Spring BioM53901:400
Primary antibody FOXP3DakoM35151:400
Primary antibody pancytokeratinCell Signaling126531:500
Primary antibody PD-L1Cell Signaling136841:200
Secondary antibodyAkoya BiosciencesARH1001EAOpal polymer
Slide stain setElectron Microscopy Sciences6254001
Tris buffered salineCorning46-012-CMTBS
Vertical slide rackElectron Microscopy Sciences50-294-72
XyleneFisherX3P1GAL

参考文献

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