אופטימיזציה, עיצוב והימנעות החסרונות בתוך מולטיפלקס במגה ומין אימונוהיסטוכימיה

Summary

הטכנולוגיה המתהווה של מולטיפלקס מאפשרת הדמיה של סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה הקבועה, שאינה מוטבעת ברקמת פרפין (FFPE). הציגו הם הנחיות להבטחת מולטיפלקס 7-צבע מוצלח עם הוראות אופטימיזציה של נוגדנים וריאגנטים, הכנת שקופיות, עיצוב וטיפים להימנעות בעיות נפוצות.

Abstract

הערכה מיקרוסביבתית של רקמות שלמות לניתוח חדירת תאים וארגון מרחבי הינם חיוניים להבנת המורכבות של תהליכי המחלות. הטכניקות העיקריות המשמשות בעבר כוללות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו immunofluorescence (IF) המאפשרים ויזואליזציה של תאים כתמונה בזמן שימוש בין 1 ל 4 סמנים. לשתי הטכניקות יש חסרונות כולל קושי לצביעת מטרות מנוגדות ומגבלות לא מקושרות הקשורות לפעילות מחודשת במינים. IHC אמינים ומיושנים, אבל הטבע של הכימיה וההסתמכות על ספקטרום האור הנראה מאפשר רק כמה סמנים לשמש והופך שיתוף לוקליזציה מאתגרת. השימוש אם מרחיב סמנים פוטנציאליים אך בדרך כלל מסתמך על רקמות קפואות בשל הרקמה המקיפה של הרקמות האוטומטיות לאחר קיבוע פורמלין. Cy, שיטת זרימה, טכניקה המאפשרת תיוג סימולטני של אפיציסקופים מרובים, abrogates רבים של ליקויים של IF ו-IHC, עם זאת, הצורך לבחון תאים כהשעיה תא יחיד מאבד את ההקשר המרחבי של תאים להשליך ביולוגי חשוב יחסים. מולטיפלקס (mfIHC) מגשר על טכנולוגיות אלה ומאפשר הפנוטיפים סלולריים רב אפיטביים ברקמת פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של המיקרו-סביבה ומרחבי קשר של תאים. בתוך רקמה שאינה מופרת בחוזק פלורסנט גבוהה fluorophores כי קשר בעוצמה לאפירופה רקמות מאפשר יישומים מרובים של הנוגדנים העיקריים ללא חשש של מינים החוצה פעילות משנית על ידי נוגדנים משני. למרות טכנולוגיה זו הוכח לייצר תמונות אמינות ומדויקות לחקר המחלה, תהליך יצירת אסטרטגיה שימושי mfIHC צביעת יכול להיות זמן רב ומדויק עקב אופטימיזציה ועיצוב נרחב. כדי ליצור תמונות חזקות המייצגות אינטראקציות סלולריות מדויקות באתרו ולהמתיק את תקופת האופטימיזציה לניתוח ידני, מוצגות כאן שיטות להכנת שקופיות, אופטימיזציה של נוגדנים, עיצוב מולטיפלקס, כמו גם שגיאות נתקל בדרך כלל במהלך תהליך הצביעת.

Introduction

ויזואליזציה של מיקרוסביבה הגידול ללא פגע (TME) הוא חיוני בהערכת לא רק חדירה תאית בגידולים ממאירים מוצק אלא גם תא לאינטראקציות תאים. מולטיפלקס אימונוהיסטוכימיה (mfihc) התפתחה ככלי יעיל עבור מולטי אנטיגן פנוויקליד של תאים במחקר של סרטן ומחלות הקשורות^{1,2,3,4, 5,6,7}. זאת, בשילוב עם תוכנות ותוכניות הרומן שנועדו לנתח ערכות נתונים גדולות, מאפשר התבוננות באינטראקציות מורכבות בין תאים^1,2,4. גורם הגבלת הקצב ברכישת נתונים הוא לעתים קרובות איכות הרקמה המוכתמת לפני ניתוח.

הטכניקות הקודמות השתמשו כדי להתאים את התאים ב-TME כוללים אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy, שכולם מהווה מגבלות משמעותיות. IHC משתמשת במקטעי פרפין קבועים (FFPE) משובצים ברקמות שאינן מוכתמים לפני הכתם על ידי נוגדן אחד לרוב. השימוש של חזרת peroxidase (HRP) נוגדן משני מאוגד ותגובה כימית מאפשר ויזואליזציה של אפיגניים אחד נגד הגנים⁸. בעוד IHC הוא אמין ומבוצע על רקמת FFPE אשר קל לעבוד עם, מגבלות על ספקטרום אור גלוי פירושו רק אחד או שניים סמנים יכול להיות אמין מכובד ולוקליזציה של אנטיגנים די קשה⁸. דרך להרחיב סמנים זמינים ולכן אנטיגנים שניתן לנחקר על מקטע אחד היא לשנות את הזריחה המאפשרת להשתמש במגוון רחב יותר של הספקטרום החזותי. עבור IF, מוקפא או רקמת FFPE מועבר על שקופיות ונוגדנים בשימוש כי הם מושכן fluorophores שונים. בעוד זה מגדיל את מספר אנטיגנים שניתן לנחקר, קיימות מספר מגבלות חשובות. ראשון, כי כל נוגדן בדרך כלל רק מצורף אחד fluorophore הבהירות היא לעתים קרובות לא חזק מספיק כדי להתגבר על הרקמה האוטומטית של רקמות. מסיבה זו, רוב IF מבוצע על רקמות קפואות אשר יקר לאחסן וקשה לעבוד עם. מספר מצומצם של תגי פלורסנט זמינים לשימוש עקב חפיפה ספקטרלית ומינים לחצות פעילות מחודשת במיוחד כאשר נוגדנים לא מצובית משמשים. זרימה cy, אשר מורכב עיבוד רקמות טריות לתוך השעיה תא אחד ותיוג עם נוגדנים פלורסנט היה תקן זהב עבור immunophenotyping קלדה במשך עשורים^9,10. היתרון של cytometry זרימה היא היכולת לתייג נוגדנים מרובים בלי לדאוג מינים לחצות פעילות מחדש כמו רוב מצוחים. בגלל התאים הם "דמיינו" על ידי מכונה ולא העיניים האנושיות, יש fluorophores הרבה יותר זמין אבל זה מגיע עם עלות. יש לבצע פיצוי באופן ידני שיכול לשנות באופן משמעותי את התוצאות המייצרות אוכלוסיות חיוביות ושליליות כוזבות. המגבלה המשמעותית ביותר של הזרימה cy, מנסה להיות בארכיטקטורת רקמות ולאחר מכן כל מידע מרחבי אובד על-ידי הצורך עבור תאים בודדים ההשעיה.

באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי בשילוב עם התוכנה הרומן משלבת את היתרונות של ihc, IF וזרימה cy, לנסות על ידי מתן מכתים רקמות רב אנטיגן עם הגברה האות ו שמירה על מערכות יחסים מרחבית ללא צורך בפיצוי. רקמת FFPE מושם על שקופיות טעונה אשר, לאחר אחזור אנטיגן, לעבור סיבוב של יישום הנוגדן העיקרי אנטיגן היעד של עניין ואחריו נוגדן משני עם תג כימי HRP, דומה ל-IHC. לאחר המיקום של הנוגדן המשני, תגובה מסוימת HRP התוצאות מחייב מחייבת fluorophore כריכה האפירופה של ריבית¹¹. לאחר הרקמה מתויג, סיבוב נוסף של חימום השקופיות הושלמה הסרת מורכב הנוגדן העיקרי הקודם והמשני משאיר רק את תג פלורסנט מאוגד לרקמות הרקמה¹¹. הדבר מאפשר למרוח מחדש נוגדנים מרובים של מינים כלשהם מבלי לדאוג לפעילות חוצת-שתיים^11,12. כדי למזער כל צורך פיצוי ידני של צבעי פלורסנט מרובים, אוסף של fluorophores עם חפיפה מעט ספקטרלית כולל כתם גרעיני משמש להשלמת mfIHC. כדי להסביר את הגרסה האוטומטית הנתקלת עם רקמת FFPE, התוכנה מפחית את הקרינה האוטומטית מהתמונה הסופית באמצעות תמונה משקופית ריקה האפשרית בגלל כוחה של אנטיגן מסוים של פלואורסצנטית הבאים fluorophore . הגברה של האות שימוש בתוכניות הרומן המיועדות לערכות נתונים גדולות, ניתן לזהות ולנתח מיקומי תאים עבור הקשר מרחבי^1,2,4. המגבלה המשמעותית ביותר של טכניקה זו היא זמן אופטימיזציה. מתודולוגיה מפורטת עם הנחיות לתכנון ניסיוני ולצביעת ואסטרטגיית דימות נמצאה כאן. mfIHC יהיה שימושי עבור מעבדות כי לא כרגע יש מערכת ממוטבת מכתים אוטומטית שרוצה להבין טוב יותר את ההקשר המרחבי של האינטראקציה תא לתאים ברקמת FFPE שלמים באמצעות הטכניקה הידנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העבודה אושרה על ידי לוח הביקורת הפנימית של אוניברסיטת מישיגן.

1. מיטוב נוגדנים ראשוניים והכנת שקופיות

1. קביעת הריכוז האידיאלי של נוגדנים עבור מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונאלי.
   1. בדקו את הנוגדנים לקולנוע באמצעות האימונוהיסטוכימיה הידנית (IHC)¹³.
   2. השתמש ברקמות ספציפיות שיש להם סוג תא שופע עבור כל נוגדן נבדק כגון באמצעות רקמת שקדים עבור בדיקות CD3 נוגדן.
   3. השתמש בריכוז הייחוס עבור IHC המומלץ על ידי החברה ולאחר מכן מלא IHC עם ריכוזי נוגדנים בריכוזים המומלצים, כמו גם ריכוזים מעל ומתחת לריכוז המומלץ.
2. הכינו את הרקמה המוטבעת. של פורמאלין לשקופיות
   1. באמצעות מיקרוטומה, בלוקים לחתוך של רקמת ffpe בעובי בין 4 ו 6 יקרומטר ולהחיל על שקופיות טעונה.
      הערה: השימוש במים מזוקקים מבטיח הרכבה נכונה של רקמות ודבקות ברחבי הקולנוע.
   2. מניחים את השקופיות שטוחות, בצד הרקמה מעלה, ומאפשרים להתייבש ב-37 ° c למשך הלילה.
   3. אחסן שקופיות בתיבת שקופיות הרחק מטמפרטורה קיצונית עד שתהיה מוכן להשלמת המגה-בית.

2. שיטת הצביעת הכללי

1. הכנת פתרונות כביסה ואחזור אנטיגן
   1. הכינו את פתרון השטיפה של 0.1% TBST על ידי ערבוב 9 L של מים מיוהים, 1 L של מלוחים באגירה טריס (TBS) ו-10 מ ל של פוליסורbate 20.
   2. להכין הן פתרונות אחזור אנטיגן (pH 6 ו-pH 9; רשימת חומרים) על-ידי דילול ל-1x עם מים מאוהים.
2. לחות והתחדשות
   1. לאפות שקופיות, שוכב שטוח, רקמות למעלה ב 60 ° c עבור 1 h בתנור הכלאה¹. הסר שקופיות מהתנור ואפשר לצנן לפחות 5 עד 10 דקות מקום במדף שקופיות אנכי.
   2. פנקו את השקופיות בפתרונות הבאים ברציפות: קסילן ב טרילקאט, ואחריו טיפול יחיד של 100% אתנול, 95% אתנול, ולבסוף 70% אתנול עבור 10 דקות כל אחד באמצעות מכתים שקופית ערכת¹.
   3. שטוף את מתלה השקופיות במשך 2 דקות עם מים מיוהים על-ידי שטיפה בתיבת שקופיות פלסטיק ולאחריה קיבוע על-ידי שטיפת שקופיות בתיבת פלסטיק מלאה בפורמאלין נייטרלי עבור 30 דקות¹³. לשטוף את השקופיות במים מוכי 2 דקות ולאחר מכן להמשיך לאחזור אנטיגן.
3. שליפת אנטיגן
   1. מניחים את מתלה השקופיות לתוך תיבה עמידים בחום ממולא לקו הפנימי (כ 300 mL) עם מאגר אחזור אנטיגן של pH 6 או pH 9.
      הערה: מאגר אחזור אנטיגן יכול להיות pH 6 או pH 9 אשר עשוי להיות ממוטב לכל אפיפי. עם זאת, להתחיל באמצעות pH 9 עבור נוגדנים הכרוך באפיסקופים גרעיניים ו-pH 6 עבור כל הנוגדנים אחרים.
   2. כסו את הקופסה בניילון נצמד והשתמשו בגומייה כדי לאבטח. מניחים את התיבה לתוך המיקרוגל בקצה הצלחת מסתובבת (מיקרוגל חייב להיות מצויד בטכנולוגיה מהפך לחימום אפילו). לחמם את השקופיות עבור 45 s ב 100% כוח ואחריו 15 דקות ב 20% כוח¹³.
      הערה: טיפול במיקרוגל עשוי להזדקק למיטוב בהתאם למיקרוגל שבשימוש.
   3. תנו לשקופיות להתקרר במשך כ-15-20 דקות.
4. הכינו פתרונות עבודה של נוגדנים ו-fluorophores תוך שקופיות קריר.
   1. להכין את הנוגדן העיקרי מדלל על ידי המסת 0.5 g של סרום הפרה אלבומין לתוך 50 mL של TBST. לחילופין, השתמש 50 mL של מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS) כדי לפזר גרגירים.
   2. להפוך כל נוגדן העיקרי לעבוד פתרון ריכוז אופטימיזציה נקבע בסעיף 1, את הנוגדן העיקרי מדלל. הערכת כ-200 μL לכל שקופית.
   3. להכין את הפתרון fluorophore לעבוד על ידי דילול כל fluorophore ב fluorophore מדלל בריכוז של 1:100.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב בהתאם לנוגדן. הערכת כ-100 μL לכל שקופית.
   4. ביום האחרון של כתמים, להכין את 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) פתרון העבודה על ידי הוספת 3 טיפות של DAPI לתוך 1 מ ' TBST.
5. מכתים שקופית (כביסה וחסימה)
   1. להסיר את הקופסה מהמייקרוגל לאחר קירור ולהסיר את עטיפת הפלסטיק, לשטוף את השקופיות עם מים מוכי עבור 2 דקות ואחריו 2 דקות לשטוף בתיבת שקופית פלסטיק מלא TBST¹³.
   2. לאחר ייבוש כל שקופית סביב הרקמה עם מחיקה עדין משימה להיזהר לא לתת את הרקמה להתייבש, מעקב סביב החלק החיצוני של הרקמה באמצעות עט המכשול הידרופובי. אין לגעת ברקמה עם מחיקה או עט משימה עדינה.
   3. מניחים כל שקופית בחדר החות ומוסיפים פתרון חסימה (כ -4 טיפות) לרקמה. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
6. מכתים שקופית (יישום נוגדן ראשי)
   1. קח כל שקופית והסר את פתרון החסימה על-ידי הקשה על צד השקופית על ערימת מגבות נייר ובאמצעות מחיקה עדינה של משימה כדי להסיר סוכן חוסם עודף מסביב לרקמה.
   2. הנח את השקופית חזרה לתוך החדר מחולל לחות ולהוסיף כ 200 μL של הנוגדן הראשי עובד. מודטה בחדר מחולל לחות במשך 1 h ב RT.
   3. לשטוף עם TBST עבור 2 דקות על ידי שייט בטריליטה¹³.
      הערה: לאחר כל צעד שוטף, שינוי ה-TBST יסייע להבטיח דימוי נקי יותר.
7. החלקת צביעת (יישום נוגדן משני)
   1. ביטול של TBST הנותרים מכל שקופית ולהחיל כ 3 כדי 4 טיפות של נוגדן משני (תערובת של ארנב ועכבר משני HRP נוגדנים מצופנים). המשך 10 דקות בחדר המיחולל. בשעה¹³
      הערה: אם מתכנן להשתמש בנוגדן העיקרי המחייב נוגדן משני מאשר עכבר או ארנב או בחירה להשתמש בנוגדן משני חלופי, להחיל את HRP המתאים מעלה משני לשקופיות ו-הדגירה ב-RT עבור 45 דקות. אופטימיזציה של זמן דגירה עשוי להיות צורך עבור השני החלופי¹⁴.
   2. לאחר הדגירה, לשטוף עם TBST עבור 2 דקות בטרילקאט¹³.
8. צביעת שקופיות (יישום fluorophore)
   1. החל כ 100 μL של פתרון העבודה fluorophore ו הדגירה בחדר מחולל לחות ב-RT עבור 10 דקות¹³.
   2. לשטוף עם TBST עבור 2 דקות בטריליטה¹³.
9. הסרת נוגדנים
   1. שקופיות מיקרוגל (45 s ב 100% לאחר מכן 15 דקות ב -20%) בתיבה עמיד בחום (ראה שלב 2.3.2) להסרת נוגדנים^13,14.
      הערה: הדבר משלים סיבוב אחד של המגה-פלקס. זוהי הנקודה היחידה שבה ניתן להשהות את הפרוטוקול. כדי להשהות את הפרוטוקול, השאר את השקופיות מתחת למאגר אחזור האנטיגן לילה בטמפרטורת החדר.
10. המשך סיבובים נוספים של כתמים. חזור על הצעדים 2.5.1-2.9.1 עבור שאר הצמדים-fluorophore. לאחר כל נוגדנים fluorophores השתמשו, להמשיך בסעיף 2.11.
11. יישום DAPI והרכבה
    1. לאחר הסיבוב האחרון הכתים בתוך הקולנוע, להסיר את יישום הנוגדן האחרון עם הפתרון לאחזור אנטיגן pH 6¹³. לשטוף עם מים מוכי ואחריו TBST עבור 2 דקות כל¹³.
    2. החל כ 150 μL של פתרון DAPI העבודה לשקופיות ו-דגירה בחדר מחולל לחות עבור 10 דקות ב-RT¹.
    3. לשטוף עם TBST עבור כ 30 s ואת הכיסויים מחליק עם השוטר נגד עמעום. החל לק ציפורן ברור בארבע פינות של שמיכות פעם אחת המדיה ההרכבה התייבש כדי לאבטח coverslip (אופציונלי).

3. פרטים עבור הספריה, מונוליסים ומולטיפלקס

1. בחרו שקופיות לבניית ספריית פלואורואופפור.
   1. עבור הקולנוע 7-צבע לאסוף 7 תאים חיסוניים שקופיות רקמות עשירות (כלומר, tonsil, טחול, וכו ') עבור הספריה.
      הערה: בחר שקופיות בקרה שישמשו עבור ספריית fluorophore עם כל שקופית המייצגת כל פלואורואופפור ייחודיים שישמשו במגה-בית. שקופיות בקרה צריך להיות אפירופה שופע של הבחירה יכול להיות אותו סוג של רקמות עבור כל fluorophore.
2. שקופיות של ספריות כתמים ותמונות לשימוש עם מונוקסים וריבוב.
   1. בצע את השלבים 2.1 ל2.9.1 באמצעות שקופיות הבקרה ובקרת שקופיות רקמת הבחירה. מניחים פלואורואופפור שונים על כל שקופית בריכוז של 1:100; שקופית אחת צריכה להכיל DAPI בלבד.
   2. המשך לסעיף 2.11 למעט השמטת צביעת DAPI ובמקום זאת השתמש ב-TBST ו-mount כמתואר.
   3. לאחר שנתן שקופיות יבש בן לילה, התמונה עם כל הערוצים DAPI, CY3, CY5, CY7, טקסס האדום, מוליך למחצה נקודות קוואנטום, ופלואורואסעין isothiocyanate (FITC) הגדרת החשיפה 250 ms עם הגנה על הרוויה תכונה¹.
      הערה: ניתן לקבוע את זמני החשיפה ב-50-250 ms¹³.
   4. העלה את תמונות הספרייה אל התוכנה והשתמש בניתוח של מונוליסים ומולטיפלקס.
3. בחר שקופיות עבור מונוליסים.
   1. בחר שקופיות בקרה בעלי אפירופה שופע של בחירה המבוססת על נוגדנים ממוטבים (סעיף 1). עבור כל סיבוב של כתמים להתבצע באולמות הקולנוע, בחר את מספר שקופיות הבקרה כדי ליצור מונוליסים.
      הערה: מטרת הונולקס היא לקבוע את המיקום הטוב ביותר (סדר) עבור כל נוגדן לשמש בחדרי הקולנוע.
4. . כתמי מונוליסים
   1. בצע את סעיפים 2.1 ל2.11 באמצעות הנוגדן העיקרי בסדר אחר (מיקום) עבור כל אחת מהשקופיות. כל שקופית צריכה להיות רק נוגדן ראשי אחד שהוחל בסדר (מיקום) שונה מהשקופיות האחרות.
      הערה: עבור כל שקופית שבה הסיבוב קורא ללא נוגדן ראשוני או fluorophore במקום זאת להשתמש נוגדן העיקרי דילול ו fluorophore מדלל¹³.
5. תמונה שקופיות ולנתח את הונולקס.
   1. באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
      הערה: ניתן לקבוע את זמני החשיפה ב-50/250 אלפיות¹⁴.
   2. באמצעות תוכנת הניתוח להעריך כל שקופית מונולקס על ידי מסתכל על עוצמת פלורסנט של סמן מוכתם.
   3. השווה עוצמה זו לרקע. אם הוא גבוה פי 5 מאשר ברקע, מיקומו של שקופית זו הוא מיקום אופטימלי לשימוש בבית הקולנוע הסופי.
6. בחרו שקופיות למגה-פלקס.
   1. בחר את שקופיות הריבית והוסף שקופית נוספת שישמשו כשקופית ריקה עבור חיסור של פלואורסצנטית אוטומטי לאחר כתמים והדמיה.
7. . להכתים את הקולנוע
   1. בהתבסס על תוצאות מונולקס, לבחור את הסדר המתאים (עמדות) עבור כל נוגדן מבוסס על שלב 3.5.3. הקצה כל פלואורואופפור לנוגדן.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך במיטוב; עם זאת, תוכנית להשתמש בנוגדנים בהירים עבור סמנים שופע פחות¹, שיתוף נוגדנים לוקליזציה צריך להיות מותאם עם fluorophores במרחק נסרה מן השני¹³, ו fluorophores עם הספקטרום 540 ו 570 לא צריך להיות שיתוף מקומי בשל לחפיפה ספקטרלית בעיות¹.
   2. המשך עם סעיפים 2.1-2.11 המבטיח שהשקופית הריקה אינה מקבלת נוגדן ראשוני, fluorophore או DAPI, במקום זאת להשתמש בנוגדן מדלל, fluorophore מדלל, ו TBST בהתאמה במקומו.
8. מולטיפלקס תמונה ולנתח עבור תקינות של צביעת
   1. באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים, ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
   2. באמצעות תוכנת הניתוח (טבלה של חומרים), להעריך כל מולטיפלקס על ידי צבע שווא פלורסנט.
      הערה: תמונה ברורה צריך להדגים כל סמן בבירור. אם הסמן נראה מפוזר או גרעינית או לא קיים, סביר להניח כי הסמן לא עבד וצריך להיות ממוטב מחדש.
   3. באמצעות תוכנת הניתוח, הערך כל מולטיפלקס באמצעות מראה פתולוגיה. הראייה הפתולוגית תאשר. את הספציפיות של כל סמן השווה ל-IHC בעבר אופטימיזציה (סעיף 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התהליך הכולל של קבלת שיטת מולטיצבעוניות בעלת 7 צבעים מלווה בדפוס חוזר. איור 1 מתאר את התהליך בצורת דיאגרמה. ברגע שהגלשות מיובשות ומתייבשות או מתקבלות מהמעבדה ומעואפות בתנור הכלאה ב-60 ° c עבור 1, לאחר מכן המשיכו לדאפיזציה ומחזור, לתקן את השקופיות בפורמאלין שוב ולאחר מכן לאחר מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דגימות רקמה שלמה של ביופסיה הגידול מוצק כריתת כירורגית להישאר כלים אבחון וחיזוי חשוב לניתוח מחלות, כמו גם פרוגנוזה המטופל. מולטיפלקס (mfIHC) היא טכניקה חדשנית המשלבת את היתרונות של אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy,. השיטות הקודמות כדי לחקור את התאים באתרו הורשו הערכה של תא אל התא ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL