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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Resumen

Glycomics es una nueva subespecialidad en investigación de sistemas omics que ofrece un potencial significativo en el descubrimiento de biomarcadores de próxima generación para la susceptibilidad a enfermedades, el descubrimiento de objetivos de fármacos y la medicina de precisión. Se han notificado igG N-glicanos alternativos en varias enfermedades crónicas comunes y se ha sugerido que tienen un gran potencial en aplicaciones clínicas (es decir, biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de enfermedades). Los IgG N-glicanos se caracterizan ampliamente utilizando el método de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC). UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y alta precisión cuantitativa relativa. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada, y la composición de glicanos y la abundancia relativa en plasma se caracterizan.

Introducción

N-glicosilación de proteínas humanas es una modificación post-traduccional común y esencial1 y puede ayudar a predecir la aparición y el desarrollo de enfermedades con relativa precisión. Debido a la complejidad de su estructura, se espera que haya más de 5.000 estructuras glicanas, proporcionando un gran potencial como biomarcadores diagnósticos y predictivos para enfermedades2. Se ha demostrado que los Nglicanos unidos a la inmunoglobulina G (IgG) son esenciales para la función de IgG, y IgG N-glicosilación participa en el equilibrio entre los sistemas pro yantiinflamatorio3. La IgG Ndiferencial-glicosilación participa en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, representando tanto una predisposición como un mecanismo funcional implicado en la patología de la enfermedad. El papel inflamatorio de IgG N-glicosilación se ha asociado con el envejecimiento, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, y el cáncer4.

Con el desarrollo de la tecnología de detección, los siguientes métodos se utilizan más ampliamente en glicómics de alto rendimiento: cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultra rendimiento con detección de fluorescencia (UPLC-FLR), electroforesis de gel capilar multiplex con fluores inducidos por láser Detección de cence (xCGE-LIF), espectrometría de masas de tiempo de tiempo de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) y espectrometría de masas electrospray por cromatografía líquida (LC-ESI-MS) . Estos métodos han superado las deficiencias anteriores de bajo flujo, resultados inestables y especificidad de sensibilidad deficiente5,6.

UPLC es ampliamente utilizado para explorar la asociación entre IgG N-glicosilación y ciertas enfermedades (es decir, envejecimiento7, obesidad8, dislipidemia9, tipo II diabetes10, hipertensión11, accidente cerebrovascular isquémico12, y la enfermedad de Parkinson13). En comparación con los otros tres métodos antes mencionados, UPLC tiene las siguientes ventajas5,14. En primer lugar, proporciona un método de análisis cuantitativo relativo, y el análisis de datos que implica la normalización total del área mejora la comparabilidad de cada muestra. En segundo lugar, el costo de los equipos y la experiencia requerida son relativamente bajos, lo que facilita la implementación y transformación de biomarcadores de glicosilación en aplicaciones clínicas. Aquí se presenta una introducción a UPLC para que pueda ser más ampliamente utilizado.

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Protocolo

Todos los temas incluidos en el protocolo han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad Médica Capital, Beijing, China12. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada tema al comienzo del estudio.

1. Aislamiento IgG

  1. Preparar los productos químicos incluyendo tampón de unión (sina tamponada de fosfato, PBS): 1x PBS (pH a 7,4), tampón neutralizante: 10x PBS (pH a 6,6-6,8), eluyente: 0,1 M de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyente: 1 M de bimonio de amonio, tampón de carbonato almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M de bimonio de amonio, tampán almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M de bimonio de amonio, tampán almacenado: 20% de ácido fórmico etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH a 7,4), solución limpiadora para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
    NOTA: El nivel de pH es crítico en este protocolo. La elución de IgG requiere un pH muy bajo, y existe el riesgo de pérdida de ácidos siálicos debido a la hidrólisis ácida. Por lo tanto, la elución se produce en cuestión de segundos, y el pH se restaura rápidamente a la neutralidad, preservando la integridad de IgG y los ácidos siálicos.
  2. Preparar las muestras: descongelar la muestra de plasma congelado y luego centrifugar a 80 x g durante 10 min, y dejar la placa monolítica de proteína G y los productos químicos antes mencionados durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
  3. Transferir una muestra de 100 l (que se puede utilizar para detectar 2 veces para evitar la primera falla) en una placa de recogida de 2 ml (aquí, un total de seis muestras estándar, una muestra de control [agua ultrapura] y 89 muestras de plasma fueron diseñadas para 96 placas de pozos y asignadas aleatoriamente al plato).
  4. Diluir las muestras con 1pbS por 1:7 (v/v).
  5. Limpie una placa de filtro de polipropileno hidrófilo (GHP) de 0,45 m con 200 ml de agua ultrapura (repetir 2x).
  6. Transfiera las muestras diluidas a la placa de filtro y filtre las muestras en la placa de recogida utilizando una bomba de vacío (controle la presión de vacío a 266.6-399.9 Pa).
  7. Preparación de las placas monolíticas de proteína G
    1. Deseche el búfer de almacenamiento.
    2. Limpie las placas monolíticas con 2 ml de agua ultrapura, 2 ml de 1x PBS, 1 ml de ácido fórmico de 0,1 M, 2 ml de 10 pbS 10 x, 2 ml de 1 x PBS (secuencialmente) y retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.
  8. Transfiera las muestras filtradas a la placa monolítica de proteína G para la unión y limpieza de IgG, luego limpie las placas monolíticas con 2 ml de 1x PBS (repetir la limpieza 2x).
  9. Eluir IgG con 1 ml de ácido fórmico de 0,1 M y filtrar las muestras en la placa de recogida mediante bomba de vacío, a continuación, añadir 170 ol de 1 M de bicarbonato de amonio en la placa de recogida.
  10. Detectar la concentración de IgG utilizando un espectrofotómetro de absorción (longitud de onda óptima de 280 nm).
    1. Abra el software y seleccione el modo proteína-CY3.
    2. Dibuja 2 s de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla, luego haz clic en Blanco en el software para borrar la pantalla (repetir 1x).
    3. Dibuja 2 ml de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla y, a continuación, haz clic en Muestra en el software para detectar el agua ultrapura.
    4. Dibuje 2 s de la muestra de IgG y cárguelo en la pantalla, luego haga clic en Muestra en el software para detectar la muestra.
    5. Dibuja 2 s de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla, luego haz clic en Blanco en el software para borrar la pantalla.
    6. Cierre el software.
      NOTA: La fórmula para calcular la concentración de IgG es la siguiente:

      CIgG - coeficiente de absorción/extinción (13,7) x 1.000 g/ml
  11. Poner el IgG extraído para secar en un horno a 60 oC y conservar el IgG extraído (300 l de IgG extraído durante 4 h).
    1. Retirar 300 s de IgG extraído si la concentración es superior a 1.000 g/ml.
    2. Retirar 350 s de IgG extraído si la concentración está entre 500-1.000 g/ml.
    3. Retirar 400 s de IgG extraído si la concentración se encuentra entre 200-500 g/ml.
    4. Retirar 600 ml de IgG extraído si la concentración es inferior a 200 g/ml.
      NOTA: La concentración de IgG debe ser preferiblemente de >200 g/ml para su posterior detección. La cantidad media de IgG debe ser preferiblemente >1.200 g, que se puede probar 2 veces en caso de que falle la primera prueba.
  12. Limpieza de la placa monolítica de proteína G para su reutilización
    1. Lave la placa con 2 ml de agua ultrapura, 1 ml de 0,1 M NaOH (para eliminar proteínas precipitadas), 4 ml de agua ultrapura y 4 ml de 1 x PBS (secuencialmente), luego retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.
    2. Lave la placa con 2 ml de agua ultrapura, 2 ml de 30% de propan-2-ol (para eliminar proteínas hidrófobas unidas), 2 ml de agua ultrapura y 4 ml de 1pbS (secuencialmente), luego retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.
    3. Lavar la placa con 1 ml de tampón (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) y añadir 1 ml de tampón (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) a la placa, luego dejar la placa a 4 oC.

2. Lanzamiento de Glycan

  1. Preparar el IgG seco y almacenar los productos químicos incluyendo 1.33% SDS, 4% Igepal (almacenar lejos de la luz), y 5x PBS en RT.
  2. Preparar la enzima PNGase F diluyendo la enzima 250 U con 250 ml de agua ultrapura.
  3. Desnaturalización de IgG
    1. Añadir 30 sl de 1,33% de SDS y mezclar por vórtice, transferir la muestra a un horno de 65 oC durante 10 minutos, luego retirarla del horno y dejar reposar durante 15 minutos.
    2. Añadir 10 s de 4% Igepal y colocarlo en la incubadora de agitación durante 5 min.
  4. Eliminación y liberación de glicanos
    1. Añadir 20 s de 5x PBS y 30-35 l de 0,1 mol/L NaOH para regular un pH de 8,0, y mezclar por vórtice. Añadir 4 l de enzima PNGase F y mezclar por vórtice. A continuación, incubar durante 18-20 h en un baño de agua de 37oC.
    2. Poner los glicanos liberados a secar en un horno a 60 oC durante 2,5-3,0 h.
    3. Guarde los glicanos liberados a -80 oC hasta que se mmeasuremente más.
      NOTA: Este paso es crítico. La clave para la liberación de glicano es mejorar la actividad de la enzima PNGase F para maximizar su eficiencia.

3. Etiquetado y purificación de glicanos

  1. Preparar el reactivo de etiquetado 2-aminobenzamida (2-AB) con 0,70 mg de 2-AB, 10,50 l de ácido acético, 6 mg de cianoborohídrido sódico (NaBH3CN) y 24,50 l de sulfóxido de dimetil (DMSO) (volumen total a 35 ol). A continuación, agregue ácido acético, 2-AB, y NaBH3CN en el DMSO en orden.
  2. Etiquetar los glicanos utilizando 35 l de reactivo de etiquetado de 2-AB, transferir los glicanos etiquetados al oscilador durante 5 minutos, transferir al horno durante 3 h a 65 oC, luego transferir a RT durante 30 minutos.
    NOTA: Todo el paso de etiquetado de glicano debe realizarse mientras está protegido de la luz.
  3. Prerretíe una placa de filtro De0m de 0,2 m con 200 ml de etanol al 70%, 200 ml de agua ultrapura y 200 ml de acetonitrilo al 96% (4 oC) y, a continuación, retire los residuos con una bomba de vacío.
  4. Purificación de glicano 2-AB etiquetado
    1. Añadir 700 l de acetonitrilo al glicano etiquetado 2-AB y transferira a una incubadora de agitación durante 5 min.
    2. Centrífuga a 134 x g durante 5 min (4oC).
    3. Transfiera la muestra a una placa de filtro GHP de 0,2 m durante 2 minutos y retire el filtrado (líquido de flujo) utilizando una bomba de vacío.
  5. Lavar el glicano etiquetado 2-AB con 200 ml de acetonitrilo al 96% (4 oC) y retirar el filtrado (líquido que fluye) con una bomba de vacío 5x-6x.
  6. Elute 2-AB glicano etiquetado con 100 l de agua ultrapura 3x.
  7. Transfiera el glicano 2-AB a un horno para secara a 60oC durante 3,5 h.
  8. Guarde los N-glicanos etiquetados a -80 oC hasta que se manda más.

4. Cromatografía de interacción hidrófila y análisis de glicanos

  1. Acondicionamiento de instrumentos UPLC y preparación de fases móviles
    1. Preparar fases móviles incluyendo disolvente A: 100 mM de formato de amonio (pH a 4,4), disolvente B: 100% acetonitrilo, disolvente C: 90% agua ultrapura (10% metanol) y disolvente D: 50% metanol (agua ultrapura).
    2. Abra el software para controlar las fases móviles.
    3. Lave los instrumentos UPLC a un caudal de equilibrio de 0,2 ml/min (50% disolvente B y 50% disolvente C) durante 30 minutos, luego a un caudal de 0,2 ml/min (25% disolvente A y 75% disolvente B) equilibrado durante 20 minutos y, a continuación, un caudal de equilibrio de 0,4 ml/min.
  2. Disolver los Nglicanos etiquetados con 25 ml de una mezcla de acetonitrilo al 100% y agua ultrapura en una proporción de 2:1 (v/v). A continuación, centrifugar a 134 og durante 5 min (4 oC) y cargar 10 sL de los N-glicanos etiquetados en los instrumentos UPLC.
  3. Separe los N-glicanos etiquetados a un caudal de 0,4 ml/min con un gradiente lineal de 75% a 62% de acetonitrilo durante 25 min. A continuación, realice una ejecución analítica por la escalera de calibración de dextran/columna de glucopéptido en una UPLC a 60 oC (aquí, las muestras se mantuvieron a 4 oC antes de la inyección).
  4. Detectar fluorescencia De N-glicano a longitudes de onda de excitación y emisión de 330 nm y 420 nm, respectivamente.
  5. Integre los glicanos en función de la posición máxima y el tiempo de retención.
  6. Calcular el valor relativo de cada pico de Glycan (GP)/todos los picos de Glican (GP) (porcentaje, %) de la siguiente manera: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.

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Resultados

Como se muestra en la Figura 1,los IgG N-glicanos se analizaron en 24 picos iniciales de IgG glicano (GPs) basados en la posición máxima y el tiempo de retención. Las estructuras N-glicano están disponibles a través de la detección de espectrometría de masas según un estudio anterior (Tabla 1)15. Para garantizar que los resultados fueran comparables, se aplicó la normalización total de la s...

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Discusión

UPLC sirve como método de análisis cuantitativo relativo5,15. Los resultados indican que UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y precisión cuantitativa relativa. La cantidad de glicanos en cada pico se expresa como un porcentaje del área integrada total utilizando UPLC, que es el valor relativo. La cuantificación relativa mejora la comparabilidad de las muestras de prueba. Además, 96 placas de proteína G de pozo se utiliz...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Natural Science Foundation of China (81673247 y 81872682) y Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-aminobenzamide, 2-ABSigma, China
96-well collection plateAXYGEN
96-well filter platePol0.45 um GHP
96-well monolithic plateBIA Separations
96-well plate rotorEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
Acetic acidSigma, China
AcetonitrileHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonateShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formateBeijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rockerZhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, ChinaZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide columnWatts technology Co., Ltd, ChinaBEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma, China
Disodium phosphateShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovensTester instruments Co., Ltd202-2AB
Empower 3.0Waters technology Co., Ltd, America
EthanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acidSigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kitSigma, China
HClJunrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifugeEppendorf Co., Ltd, Germany5430
IgepalSigma, China
Low temperature centrifugeEppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigeratorQingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plateWatts technology Co., Ltd, China186001831
MethanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meterMillipore Co., Ltd, AmericaAdvantage A10
NaOHShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH testerSartorius Co., Ltd, GermanyPB-10
Phosphate buffered saline, PBSShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PipetteEppendorf Co., Ltd, Germany4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzymeSigma, China
Potassium dihydrogen phosphateShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-olHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDSSigma, China
Sodium chlorideShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)Sigma, China
SpectrophotometerShanghai Yuanxi instrument Co., LtdB-500
Transfer liquid gunSmer Fell Science and Technology Co., Ltd, China4672100
TrisAmresco, America
Ultra-low temperature refrigeratorThermo Co., Ltd, AmericaMLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatographyWatts technology Co., Ltd, ChinaAcquity MLtraPerformance LC
Vacuum PumpWatts technology Co., Ltd, China725000604
Volatilizing machine/DryerEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
VortexChangzhou Enpei instrument Co., Ltd, ChinaNP-30S
Water-bathTester instruments Co., LtdDK-98-IIA
Weighing balanceShanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.MP200B

Referencias

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