JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Иммуноглобулин G (IgG) N-гликанхарактеризуется с помощью гидрофильной взаимодействия хроматографии UPLC. Кроме того, структура IgG N-гликанчетко разделена. Представлено здесь введение в этот экспериментальный метод, так что он может быть широко использован в научно-исследовательских условиях.

Аннотация

Glycomics является новой подспециализацией в исследованиях системы омики, которая предлагает значительный потенциал в открытии биомаркеров следующего поколения для восприимчивости к болезням, открытия целевых лекарственных средств и точной медицины. Альтернативные IgG N-гликаны были зарегистрированы в нескольких распространенных хронических заболеваний и предложил иметь большой потенциал в клинических приложениях (т.е., биомаркеры для диагностики и прогнозирования заболеваний). IgG N-гликанов широко характеризуется с помощью метода гидрофильной взаимодействия хроматографии (HILIC) ультра-производительности жидкой хроматографии (UPLC). UPLC является стабильной технологией обнаружения с хорошей воспроизводимостью и высокой относительной количественной точностью. Кроме того, структура IgG N-гликанчетко разделена, а гликановский состав и относительное изобилие в плазме характеризуются.

Введение

N-гликозилирование человеческих белков является общей и важной посттрансляционной модификацией1 и может помочь предсказать возникновение и развитие заболеваний относительно точно. В связи со сложностью его структуры, ожидается, что Есть более чем 5000 гликановых структур, обеспечивая большой потенциал в качестве диагностических и прогностических биомаркеров для заболеваний2. N-гликанов, прикрепленных к иммуноглобулину G (IgG), как было показано, имеют важное значение для функции IgG, и IgG N-гликозилирование участвует в балансе между про- и противовоспалительными системами3. Дифференциальная IgG N-гликозилирование участвует в развитии и прогрессировании заболеваний, представляющих как предрасположенность, так и функциональный механизм, участвующий в патологии заболевания. Воспалительная роль IgG N-гликозилирования была связана со старением, воспалительными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и раком4.

С развитием технологии обнаружения, наиболее широко используются следующие методы в гликомиксах высокой пропускной способности: гидрофильные взаимодействия хроматографии (HILIC) ультрапроизводительной жидкой хроматографии с обнаружением флуоресценции (UPLC-FLR), мультиплексного капиллярного геля электрофорекса с лазерным индуцированным Обнаружение флуоресценции (xCGE-LIF), матричной лазерной дезорпации/ионизации времени полета масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) и жидкой хроматографии электроспрейной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS) . Эти методы преодолели предыдущие недостатки низкого потока, нестабильные результаты, и низкая чувствительность специфичность5,6.

UPLC широко используется для изучения связи между IgG N-гликозилирование и некоторые заболевания (т.е. старение7, ожирение8, дислипидемия9, диабет II типа10, гипертония11, ишемический инсульт12, и болезнь Паркинсона13). По сравнению с другими тремя вышеупомянутыми методами, UPLC имеет следующие преимущества5,14. Во-первых, он обеспечивает относительный метод количественного анализа, а анализ данных, который включает в себя полное нормализацию площади, улучшает сопоставимость каждой выборки. Во-вторых, стоимость оборудования и требуемых знаний относительно невелики, что облегчает внедрение и преобразование биомаркеров гликозилирования в клинические приложения. Представлено здесь введение в UPLC, чтобы он мог быть более широко используется.

протокол

Все предметы, включенные в протокол, были одобрены Комитетом по этике Столичного медицинского университета, Пекин, Китай12. Письменное информированное согласие было получено от каждого предмета в начале исследования.

1. Изоляция IgG

  1. Подготовка химических веществ, включая связывающий буфер (фосфат буферный солен, PBS): 1x PBS (pH 7.4), нейтрализующий буфер: 10x PBS (pH 6.6-6.8), eluent: 0.1 M formic кислота (pH q 2.5), нейтрализуя разрешение для eluent: 1 M ammonium bicarbonat, буфер: 20% этанол 20 мм Трис 0,1 М NaCl (pH 7.4), очищающий раствор для белка G: 0,1 М НаОХ и 30% пропан-2-ol.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень рН имеет решающее значение в этом протоколе. Elution IgG требует очень низкого рН, и есть риск потери сиаливных кислот из-за кислотного гидролизов. Таким образом, elution происходит в течение нескольких секунд, и рН быстро восстанавливается в нейтральном статусе, сохраняя целостность IgG и сиаливных кислот.
  2. Подготовьте образцы: разморозьте замороженный образец плазмы, затем центрифугу на уровне 80 х г в течение 10 мин, и оставьте белок G монолитной пластины и вышеупомянутые химические вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
  3. Передача 100 л образца (который может быть использован для обнаружения 2x для предотвращения первого отказа) в 2 мл коллекции пластины (здесь, в общей сложности шесть стандартных образцов, один контрольный образец »ультра-чистая вода» и 89 образцов плазмы были разработаны для 96 хорошо пластин и случайным образом назначены к тарелке).
  4. Разбавить образцы 1x PBS на 1:7 (v/v).
  5. Очистите фильтровальную пластину 0,45 мкм гидрофильной полипропилена (GHP) с 200 л ультра-чистой воды (повторите 2x).
  6. Перенесите разбавленные образцы в фильтровальную пластину и процедите образцы в коллекционную пластину с помощью вакуумного насоса (контроль вакуумного давления на уровне 266,6-399,9 па).
  7. Приготовление белка G монолитных пластин
    1. Откажитесь от буфера хранения.
    2. Очистите монолитные пластины с 2 мл ультра-чистой воды, 2 мл 1x PBS, 1 мл 0,1 М formic кислоты, 2 мл 10x PBS, 2 мл 1x PBS (последовательно), и удалить текущую жидкость с помощью вакуумного насоса.
  8. Перенесите отфильтрованные образцы в монолитную пластину белка G для связывания и очистки IgG, затем очистите монолитные пластины 2 мл 1x PBS (повторите очистку 2x).
  9. Elute IgG с 1 мл 0,1 М фомиевой кислоты и фильтровать образцы в пластину сбора с помощью вакуумного насоса, а затем добавить 170 л 1 М бикарбонат аммония в коллекции пластины.
  10. Обнаружение концентрации IgG с помощью спектрофотометра поглощения (оптимальная длина волны - 280 нм).
    1. Откройте программное обеспечение и выберите режим белка-CY3.
    2. Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите его в экран, затем нажмите Бланк в программном обеспечении, чтобы очистить экран (повторить 1x).
    3. Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите ее в экран, затем нажмите Образец в программном обеспечении для обнаружения ультра-чистой воды.
    4. Нарисуйте 2 ЗЛ образца IgG и загрузите его в экран, а затем нажмите Образец в программном обеспечении, чтобы обнаружить образец.
    5. Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите его в экран, затем нажмите Бланк в программном обеспечении, чтобы очистить экран.
    6. Закройте программное обеспечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула для расчета концентрации IgG заключается в следующем:

      Коэффициент поглощения CIgG и вымирания (13,7) x 1000 мкг/мл
  11. Положите извлеченный IgG высохнуть в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию и сохранить извлеченные IgG (300 л извлеченных IgG в течение 4 ч).
    1. Удалите 300 л извлеченных IgG, если концентрация превышает 1000 мкг/мл.
    2. Удалите 350 л извлеченных IgG, если концентрация составляет от 500 до 1000 мкг/мл.
    3. Удалите 400 л извлеченных IgG, если концентрация составляет от 200-500 мкг/мл.
    4. Удалите 600 л извлеченных IgG, если концентрация меньше 200 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация IgG должна быть предпочтительно йgt;200 мкг/мл для последующего обнаружения. Среднее количество IgG должно быть предпочтительно йgt;1,200 мкг, которые могут быть проверены 2x в случае первого теста не удается.
  12. Очистка белка G монолитной пластины для повторного использования
    1. Вымойте тарелку 2 мл ультрачистой воды, 1 мл 0,1 МН НаОХ (для удаления осажденных белков), 4 мл сверхчистой воды и 4 мл 1x PBS (последовательно), затем удалить протекающую жидкость с помощью вакуумного насоса.
    2. Вымойте тарелку 2 мл ультрачистой воды, 2 мл 30% пропан-2-ol (для удаления связанных гидрофобных белков), 2 мл сверхчистой воды и 4 мл 1x PBS (последовательно), затем удалить протекающую жидкость с помощью вакуумного насоса.
    3. Вымойте тарелку с 1 мл буфера (20% этанола 20 Мм Трис 0,1 М NaCl) и добавить 1 мл буфера (20% этанола 20 Мм Трис 0,1 М NaCl) к пластине, а затем оставить пластину при 4 градусах по Цельсию.

2. Гликан релиз

  1. Подготовка сушеных IgG и хранить химические вещества, включая 1,33% SDS, 4% Igepal (хранить вдали от света), и 5x PBS на RT.
  2. Приготовьте фермент PNGase F, разбавив фермент 250 U с 250 л ультра-чистой воды.
  3. Денатурация IgG
    1. Добавьте 30 кл. 1,33% SDS и перемешайте путем вихря, перенесите образец в духовку 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем выньте его из духовки и дайте отдохнуть в течение 15 мин.
    2. Добавьте 10 qL 4% Igepal и поместите его на встряхивая инкубатор в течение 5 минут.
  4. Удаление и высвобождение гликанов
    1. Добавьте 20 кЛ 5x PBS и 30-35 Л 0,1 моль/L NaOH, чтобы регулировать рН 8,0, и смешивать путем вихря. Добавьте 4 qL фермента PNGase F и смешайте путем вихря. Затем, инкубировать 18-20 ч в водяной бане 37 градусов.
    2. Положите выпущенные гликаны высохнуть в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию на 2,5-3,0 ч.
    3. Сохранить освобожденных гликанов при -80 градусов до дальнейшего измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение. Ключом к высвобождению гликанов является повышение активности фермента PNGase F для максимизации его эффективности.

3. Гликанная маркировка и очистка

  1. Приготовьте 2-аминобензамид (2-АБ) с маркировкой реагента 0,70 мг 2-AB, 10,50 л уксусной кислоты, 6 мг цианоборогидрида натрия (NaBH3CN) и 24,50 л диметилового сульфоксида (DMSO) (общий объем 35 мл). Затем добавьте уксусную кислоту, 2-AB, и NaBH3CN в DMSO в порядке.
  2. Пометьте гликанов с помощью 35 злител 2-AB маркировки реагента, передать помеченные гликаны на осциллятор в течение 5 минут, передача в духовку в течение 3 ч при 65 градусов по Цельсию, затем передать на RT в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь шаг маркировки гликанов должен быть выполнен в то время как защищены от света.
  3. Предварительно пролечить фильтровальную пластину 0,2 мкм GHP с 200 йл 70% этанола, 200 л ультра-чистой воды и 200 л 96% ацетонитрила (4 кВ), затем удалить отходы с помощью вакуумного насоса.
  4. Очистка 2-AB помечены гликан
    1. Добавьте 700 л 100% ацетонитрила в 2-AB помечены гликан и передачи в встряхивая инкубатор в течение 5 минут.
    2. Центрифуга при 134 х г в течение 5 мин (4 кВ).
    3. Перенесите образец на фильтровальную пластину 0,2 мкм GHP в течение 2 мин и удалите фильтр (текущую жидкость) с помощью вакуумного насоса.
  5. Вымойте 2-AB помечены гликан с 200 зл 96% ацетонитрила (4 кВ) и удалить фильтрата (текущая жидкость) с помощью вакуумного насоса 5x-6x.
  6. Elute 2-AB помечены гликан с 100 зл и глот ультра-чистой воды 3x.
  7. Перенесите 2-AB помечены гликан в духовку, чтобы высохнуть при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 3,5 ч.
  8. Сохраните помеченные N-гликаны при -80 градусах По Цельсию до дальнейшего измерения.

4. Гидрофильные взаимодействия хроматографии и анализа гликанов

  1. Кондиционирование приборов UPLC и подготовка мобильных фаз
    1. Подготовка мобильных фаз, включая растворитель A: 100 мМ аммония formate (рН No 4,4), растворитель B: 100% ацетонитрил, растворитель C: 90% ультра-чистой воды (10% метанола), и растворитель D: 50% метанола (ультра-чистая вода).
    2. Откройте программное обеспечение для управления мобильными фазами.
    3. Вымойте приборы UPLC при скорости потока 0,2 мл/мин (50% растворителя В и 50% растворителя С), балансируя 30 мин, затем при скорости потока 0,2 мл/мин (25% растворителя А и 75% растворителя В) балансируя 20 мин, затем скорость потока 0,4 мл/мин балансировки.
  2. Растворите помеченные N-гликаны с 25 зл смеси 100% ацетонитрила и ультра-чистой воды в соотношении 2:1 (v/v). Затем центрифугу на 134 г в течение 5 мин (4 кВ) и загрузите 10 qL помеченных N-гликанов в инструменты UPLC.
  3. Отделите помеченные N-гликаны со скоростью потока 0,4 мл/мин с линейным градиентом от 75% до 62% ацетонитрила в течение 25 мин. Затем выполните аналитическую выползует dextran калибровочной лестницей/гликопептидной колонкой на UPLC при 60 градусах Цельсия (здесь образцы хранились при 4 градусах Цельсия до инъекции).
  4. Обнаружить N-гликанфлуоресценции при возбуждении и длины волны выбросов 330 нм и 420 нм, соответственно.
  5. Интегрируйте гликаны на основе пикового положения и времени удержания.
  6. Рассчитайте относительную стоимость каждого гликанского пика (GP)/ все гликанские пики (GPs) (в процентах, %) следующим образом: GP1: GP1/GPs-100, GP2: GP2/GPs-100, GP3: GP3/GPs-100 и т.д.

Результаты

Как показано на рисунке 1, IgG N-гликанов были проанализированы в 24 первоначальных Пиков IgG гликанов (GPs) на основе пикового положения и времени удержания. N-гликан структуры доступны через обнаружение масс-спектрометрии в соответствии с предыду?...

Обсуждение

UPLC служит в качестве метода относительного количественного анализа5,15. Полученные результаты свидетельствуют о том, что UPLC является стабильной технологией обнаружения с хорошей воспроизводимостью и относительной количественной точностью. Количество ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81673247 и 81872682) и Австралийско-китайский совместный грант (NH и MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-aminobenzamide, 2-ABSigma, China
96-well collection plateAXYGEN
96-well filter platePol0.45 um GHP
96-well monolithic plateBIA Separations
96-well plate rotorEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
Acetic acidSigma, China
AcetonitrileHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonateShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formateBeijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rockerZhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, ChinaZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide columnWatts technology Co., Ltd, ChinaBEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma, China
Disodium phosphateShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovensTester instruments Co., Ltd202-2AB
Empower 3.0Waters technology Co., Ltd, America
EthanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acidSigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kitSigma, China
HClJunrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifugeEppendorf Co., Ltd, Germany5430
IgepalSigma, China
Low temperature centrifugeEppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigeratorQingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plateWatts technology Co., Ltd, China186001831
MethanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meterMillipore Co., Ltd, AmericaAdvantage A10
NaOHShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH testerSartorius Co., Ltd, GermanyPB-10
Phosphate buffered saline, PBSShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PipetteEppendorf Co., Ltd, Germany4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzymeSigma, China
Potassium dihydrogen phosphateShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-olHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDSSigma, China
Sodium chlorideShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)Sigma, China
SpectrophotometerShanghai Yuanxi instrument Co., LtdB-500
Transfer liquid gunSmer Fell Science and Technology Co., Ltd, China4672100
TrisAmresco, America
Ultra-low temperature refrigeratorThermo Co., Ltd, AmericaMLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatographyWatts technology Co., Ltd, ChinaAcquity MLtraPerformance LC
Vacuum PumpWatts technology Co., Ltd, China725000604
Volatilizing machine/DryerEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
VortexChangzhou Enpei instrument Co., Ltd, ChinaNP-30S
Water-bathTester instruments Co., LtdDK-98-IIA
Weighing balanceShanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.MP200B

Ссылки

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155GN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены