Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography

Riepilogo

ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.

Abstract

Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un'elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l'abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.

Introduzione

N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale¹ e può aiutare a prevedere l'insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie². N-glicani attaccati all'immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all'equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori³. La legatura IgG Ndifferenziale è coinvolta nello sviluppo e nella progressione della malattia, che rappresenta sia una predisposizione che un meccanismo funzionale coinvolto nella patologia della malattia. Il ruolo infiammatorio di IgG N-glycosylation è stato associato con l'invecchiamento, malattie infiammatorie, malattie autoimmuni, e cancro⁴.

Con lo sviluppo della tecnologia di rilevamento, i seguenti metodi sono più ampiamente utilizzati nei licoli ad alta produttività: cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione con rilevamento della fluorescenza (UPLC-FLR), elettroforesi gelpillara multiplalesa con fluorino indotto dal laser rilevamento dell'escenza (xCGE-LIF), spettrometria di massa di desorption/ionizzazione del tempo di ionizzazione del tempo di volo (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa elettrospray a matrice (LC-ESI-MS) . Questi metodi hanno superato le precedenti carenze di basso flusso, risultati instabili e scarsa specificità di sensibilità^5,6.

UPLC è ampiamente usato per esplorare l'associazione tra IgG N-glicosilazione e alcune malattie (ad esempio, invecchiamento⁷, obesità⁸, dislipidemia⁹, tipo II diabete¹⁰, ipertensione¹¹, ictus ischemico¹², e morbo di Parkinson¹³). Rispetto agli altri tre metodi di cui sopra, UPLC ha i seguenti vantaggi^5,14. In primo luogo, fornisce un metodo di analisi quantitativa relativa e l'analisi dei dati che comporta la normalizzazione totale delle aree migliora la comparabilità di ogni campione. In secondo luogo, il costo delle attrezzature e le competenze richieste sono relativamente bassi, il che rende più facile implementare e trasformare i biomarcatori della glicosilazione in applicazioni cliniche. Presentato qui è un'introduzione a UPLC in modo che possa essere più ampiamente utilizzato.

Protocollo

Tutti i soggetti inclusi nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico della Capital Medical University, Pechino, Cina¹². Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni materia all'inizio dello studio.

1. Isolamento IgG

1. Preparare le sostanze chimiche, tra cui il buffer di legatura (fosfato buffer saline, PBS): 1x PBS (pH - 7,4), neutralizzazione del buffer: 10x PBS (pH - 6,6-6,8), eluente: 0,1 M di acido formica (pH - 2,5), soluzione neutralizzante per eluente: 1 M di bicarbonato di ammonio, memorizzato nel buffer: 20% etanolo - 20 mM Tris - 0,1 M NaCl (pH - 7,4), soluzione di pulizia per la proteina G: 0,1 M NaOH - 30% propan-2-ol.
   NOTA: il livello di pH è fondamentale in questo protocollo. L'eluzione di IgG richiede un pH molto basso, e c'è il rischio di perdita di acidi sialici a causa dell'idrolisi acida. Pertanto, l'eluizione avviene in pochi secondi e il pH viene rapidamente ripristinato alla neutralità, preservando l'integrità di IgG e degli acidi sialici.
2. Preparare i campioni: scongelare il campione di plasma congelato, quindi centrifugare a 80 x g per 10 min, e lasciare la proteina G piastra monolitica e le sostanze chimiche di cui sopra per 30 min a temperatura ambiente (RT).
3. Trasferire un campione di 100 l (che può essere utilizzato per rilevare 2x per prevenire il primo guasto) in una piastra di raccolta da 2 mL (qui, un totale di sei campioni standard, un campione di controllo [acqua ultrapura] e 89 campioni di plasma sono stati progettati per 96 piastre di pozzo e assegnati in modo casuale al piatto).
4. Diluire i campioni con 1x PBS di 1:7 (v/v).
5. Pulire una piastra filtrante in polipropilene idrofilo (GHP) di 0,45 m con 200 l di acqua ultrapura (ripetere 2x).
6. Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrarli nella piastra di raccolta utilizzando una pompa a vuoto (pressione del vuoto di controllo a 266.6-399.9 Pa).
7. Preparazione delle piastre monolitiche proteiche G
   1. Eliminare il buffer di archiviazione.
   2. Pulire le piastre monolitiche con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL di 1x PBS, 1 mL di acido formica di 0,1 M, 2 mL di 10x PBS, 2 mL di 1x PBS (in sequenza) e rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
8. Trasferire i campioni filtrati nella proteina G piastra monolitica per il legame IgG e la pulizia, quindi pulire le piastre monolitiche con 2 mL di 1x PBS (ripetere la pulizia 2x).
9. Evitare L'IgG con 1 mL di acido formica da 0,1 M e filtrare i campioni nella piastra di raccolta con la pompa a vuoto, quindi aggiungere 170 l of 1 M di bicarbonato di ammonio nella piastra di raccolta.
10. Rilevare la concentrazione di IgG utilizzando uno spettrometro di assorbimento (lunghezza d'onda ottimale - 280 nm).
    1. Aprire il software e selezionare la modalità proteina-CY3.
    2. Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo (ripetere 1x).
    3. Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare l'acqua ultra-pura.
    4. Disegnare 2 l- di campione IgG e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare il campione.
    5. Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo.
    6. Chiudere il software.
       NOTA: La formula per calcolare la concentrazione di IgG è la seguente:
       
       C_IgG - coefficiente di assorbimento x estinzione (13,7) x 1.000 g/mL
11. Mettete l'IgG estratto ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi e conservate l'IgG estratto (300 gradi-L estratto IgG per 4 h).
    1. Rimuovere 300 l di IgG estratto se la concentrazione è maggiore di 1.000 g/mL.
    2. Rimuovere 350 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 500-1.000 g/mL.
    3. Rimuovere 400 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 200-500 g/mL.
    4. Rimuovere 600 l di IgG estratto se la concentrazione è inferiore a 200 g/mL.
       NOTA: La concentrazione di IgG dovrebbe essere preferibilmente >200 g/mL per il rilevamento successivo. La quantità media di IgG dovrebbe essere preferibilmente >1.200 g, che può essere testato 2x nel caso in cui il primo test non riesce.
12. Pulizia della proteina G piastra monolitica per il riutilizzo
    1. Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 1 mL di 0,1 M NaOH (per rimuovere le proteine precipitate), 4 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
    2. Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL del 30% propan-2-ol (per rimuovere le proteine idrofobiche legate), 2 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (in sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
    3. Lavare la piastra con 1 mL di tampone (20% etanolo , 20 Mm Tris e 0,1 M NaCl) e aggiungere la piastra di 1 mL di tampone (20% di etanolo , 20 Mm Tris , 0,1 M di NaCl) alla piastra, quindi lasciare la piastra a 4 gradi centigradi.

2. Rilascio di Glycan

1. Preparare l'IgG essiccato e conservare le sostanze chimiche tra cui 1.33% SDS, 4% Igepal (negozio lontano dalla luce), e 5x PBS a RT.
2. Preparare l'enzima PNGase F diluindo 250 U enzima con 250 l di acqua ultra-pura.
3. Denaturazione di IgG
   1. Aggiungere 30 - L di 1,33% SDS e mescolare vortice, trasferire il campione in un forno a 65 gradi per 10 min, quindi toglierlo dal forno e lasciare riposare per 15 min.
   2. Aggiungere 10 L del 4% Igepal e posizionarlo sull'incubatrice agitazione per 5 min.
4. Rimozione e rilascio di glicani
   1. Aggiungete 20 l di 5x PBS e 30-35 l l di 0,1 mol/L NaOH per regolare un pH di 8,0 e mescolate mediante vortice. Aggiungere 4 L di Enzima PNGase F e mescolare vortice. Quindi, incubare per 18-20 h in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
   2. Mettete i glitrali rilasciati ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi per 2,5-3,0 h.
   3. Salvare i glicani rilasciati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.
      NOTA: questo passaggio è fondamentale. La chiave per il rilascio di glicani è migliorare l'attività dell'enzima PNGase F per massimizzarne l'efficienza.

3. Etichettatura e purificazione del glicano

1. Preparare il reagente di etichettatura 2-aminobenzamide (2-AB) con 0,70 mg di 2-AB, 10,50 l di acido acetico, 6 mg di cianoboboidride di sodio (NaBH₃CN) e 24,50 - L di dimetilfossido di dimetilluso (DMSO) (volume totale 35 . Quindi, aggiungere acido acetico, 2-AB, e NaBH₃CN nel DMSO in ordine.
2. Etichettare i glicani utilizzando 35 gradi l di reagente di etichettatura 2-AB, trasferire i glicani etichettati all'oscillatore per 5 min, trasferire al forno per 3 h a 65 gradi centigradi, quindi trasferire a RT per 30 min.
   NOTA: l'intero passaggio di etichettatura glican deve essere eseguito mentre è protetto dalla luce.
3. Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 m con 200 gradi l di 70% di etanolo, 200 l di acqua ultrapura e 200 luna del 96% acetonitrile (4 gradi), quindi rimuovere i rifiuti con una pompa a vuoto.
4. Purificazione del glicano etichettato 2-AB
   1. Aggiungere 700 loffi del 100% di acetonitrile al glicano etichettato 2-AB e trasferirlo in un'incubatrice tremante per 5 min.
   2. Centrifuga a 134 x g per 5 min (4 gradi centigradi).
   3. Trasferire il campione su una piastra filtrante GHP di 0,2 m per 2 min e rimuovere il filtrato (liquido che scorre) utilizzando una pompa a vuoto.
5. Lavare il glicano etichettato 2-AB con 200 -L of 96% acetonitrile (4 ) e rimuovere il filtrante (liquido scorrevole) utilizzando una pompa a vuoto 5x-6x.
6. Glicano etichettato 2-AB eluito con 100 litri di acqua ultrapura 3x.
7. Trasferire il glicano con etichetta 2-AB in forno ad asciugare a 60 gradi centigradi per 3,5 h.
8. Salvare gli N-glicani con l'etichetta a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.

4. Cromatografia e analisi dell'interazione idrofila

1. Condizionamento degli strumenti UPLC e preparazione delle fasi mobili
   1. Preparare fasi mobili, tra cui solvente A: 100 mM di formato di ammonio (pH - 4,4), solvente B: acetonitrile 100%, solvente C: 90% acqua ultra-pura (10% metanolo) e solvente D: 50% metanolo (acqua ultra-pura).
   2. Aprire il software per controllare le fasi mobili.
   3. Lavare gli strumenti UPLC a una portata di 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) bilanciato per 30 min, quindi ad una velocità di flusso di 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) bilanciamento per 20 min, quindi una velocità di flusso di 0,4 mL/ bilanciamento.
2. Sciogliere i n-glicani etichettati con 25 gradi di una miscela di acetonitrile 100% e acqua ultra-pura ad un rapporto 2:1 (v/v). Quindi, centrifugare a 134 g per 5 min (4 gradi centigradi) e caricare 10 -L degli strumenti N-glicani etichettati negli strumenti UPLC.
3. Separare i valori etichettati N-glicani alla portata di 0,4 mL/min con una pendenza lineare del 75% al 62% di acetonitrile per 25 min. Quindi, eseguire una corsa analitica da dextran calibrazione colonna / colonna di glicopeptide su un UPLC a 60 gradi centigradi (qui, i campioni sono stati tenuti a 4 gradi centigradi prima dell'iniezione).
4. Rileva la fluorescenza N-glican a lunghezze di eccitazione ed emissione di 330 e 420 nm, rispettivamente.
5. Integrare i glicani in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.
6. Calcolare il valore relativo di ogni picco di Glycan (GP)/ tutti i picchi di Glycan (GP) (percentuale, %) come segue: GP1: GP1/GP-100, GP2: GP2/GP-100, GP3: GP3/GP-100, ecc.

Risultati

Come illustrato nella Figura 1, IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. Le strutture N-glicani sono disponibili attraverso il rilevamento della spettrometria di massa secondo uno studio precedente (Tabella 1)¹⁵. Per garantire che i risultati fossero comparabili, è stata applicata la normalizzazione totale dell...

Discussione

UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa^5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell'area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-aminobenzamide, 2-AB	Sigma, China
96-well collection plate	AXYGEN
96-well filter plate	Pol	0.45 um GHP
96-well monolithic plate	BIA Separations
96-well plate rotor	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Acetic acid	Sigma, China
Acetonitrile	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate	Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker	Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China	ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column	Watts technology Co., Ltd, China	BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma, China
Disodium phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens	Tester instruments Co., Ltd	202-2AB
Empower 3.0	Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid	Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit	Sigma, China
HCl	Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany	5430
Igepal	Sigma, China
Low temperature centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator	Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate	Watts technology Co., Ltd, China	186001831
Methanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter	Millipore Co., Ltd, America	Advantage A10
NaOH	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester	Sartorius Co., Ltd, Germany	PB-10
Phosphate buffered saline, PBS	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette	Eppendorf Co., Ltd, Germany	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme	Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS	Sigma, China
Sodium chloride	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma, China
Spectrophotometer	Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd	B-500
Transfer liquid gun	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China	4672100
Tris	Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator	Thermo Co., Ltd, America	MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography	Watts technology Co., Ltd, China	Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump	Watts technology Co., Ltd, China	725000604
Volatilizing machine/Dryer	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Vortex	Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China	NP-30S
Water-bath	Tester instruments Co., Ltd	DK-98-IIA
Weighing balance	Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.	MP200B