אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

Summary

אימונוגלובולין G (IgG) N-גליקן מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור. המוצג כאן הוא מבוא לשיטה ניסיונית זו, כך שניתן להשתמש בה באופן נרחב בהגדרות מחקר.

Abstract

גלילקומיקס הוא התמחות משנה חדשה ב-omics מחקר מערכת המציעה פוטנציאל משמעותי בגילוי בסמנים הדור הבא עבור הרגישות למחלות, גילוי התרופה היעד, ואת התרופה דיוק. אלטרנטיבי IgG N-גליקנים דווחו במספר מחלות כרוניות נפוצות, הציע פוטנציאל גדול ביישומים קליניים (כלומר, ביוארקרס לאבחון וחיזוי של מחלות). IgG N-גליקנים מאופיינים באופן נרחב באמצעות שיטה של אינטראקציה הידרופיפילית (hilic) כרומטוגרפית נוזלית במיוחד. היחידה היא טכנולוגיית גילוי יציבה עם שגיאות מידע ודיוק כמותי קרוב יחסית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור, וניתן לאפיין את ההלחנה והשפע היחסי בפלזמה.

Introduction

N-הגליקוזילציה של חלבונים אנושיים הוא שינוי שכיח וחיוני לאחר השינוי¹ ועשוי לסייע לחזות את התרחשות ופיתוח של מחלות באופן יחסי יחסית. בשל המורכבות של המבנה שלה, הוא צפוי כי יש יותר מ 5,000 מבנים גליקן, מתן פוטנציאל גדול כמו ביואריטים אבחון חזוי עבור מחלות². N-גליקנים המחוברים למערכת החיסונית (igg) הוכחו כחיוניים לתפקוד igg, ו-Igg N-הגליסילציה משתתפת באיזון בין המערכות הפרו-דלקתיות³. IgG N-גליסיציה דיפרנציאלית מעורבת בפיתוח מחלות והתקדמות, המייצגים הן מנגנון נטייה ופונקציונלי המעורבים בפתולוגיה של מחלות. התפקיד הדלקתי של IgG N-הגליסיציה נקשר עם הזדקנות, מחלות דלקתיות, מחלות אוטואימוניות, סרטן⁴.

עם פיתוח של טכנולוגיית האיתור, השיטות הבאות נמצאות בשימוש נרחב ביותר גליקומיס תפוקה גבוהה: הידרופיפילית אינטראקציה כרומטוגרפיה (HILIC) כרומטוגרפיה נוזלית מאוד ביצועים עם גילוי של קרינה פלואורסצנטית (הייטק-FLR), אלקטרופורזה במגה-קרן עם ג'ל לייזר לגילוי קרינה בלייזר (xCGE-אבל), מטריקס בסיוע לייזר בעזרת מטריצות של זמן הטיסה המסה ספקטרומטריה (מאלדי-תוף-MS), וכרומטוגרפיה נוזלית ממסת המסה (LC-ESI-MS) . שיטות אלה התגברו על חסרונות קודמים של שטף נמוך, תוצאות לא יציבות, ורגישות ירודה ספציפיות^5,6.

האגודה משמשת רבות לחקר הקשר בין igg N-הגליקוציה ומחלות מסוימות (כלומר, הזדקנות⁷, השמנה⁸, דיסליפידמיה⁹, סוכרת type¹⁰, יתר לחץ דם¹¹, איסכמי שבץ¹², פרקינסון מחלה¹³). בהשוואה לשלושת השיטות הנ ל, היתרונות הבאים הם^5,14. ראשית, הוא מספק שיטת ניתוח כמותי יחסי, וניתוח הנתונים הכרוך בנרמול השטח הכולל משפר את יכולת ההשוואה של כל דוגמה. שנית, עלות הציוד והמומחיות הנדרשת נמוכה יחסית, מה שמקל על היישום וטרנספורמציה של ביוגליציה ליישומים קליניים. המוצג כאן הוא מבוא ל-, כדי שניתן יהיה להשתמש בו באופן נרחב יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנושאים הכלולים בפרוטוקול אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג, סין¹². הסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל נושא בתחילת המחקר.

1. בידוד IgG

1. הכן את הכימיקלים כולל מאגר מחייב (מתמיסת מלח מאוחסן באגירה, PBS): 1x pbs (ph = 7.4), לנטרל מאגר: 10x pbs (ph = 6.6-6.8), הללויה: 0.1 m החומצה פורמית (ph = 2.5), נטרול פתרון להתחמק: 1 M אמוניום ביקרבונט, מאגר מאוחסן: 20% אתנול + 20 מ"מ טריס + 0.1 M הנאל (pH = 7.4), ניקוי פתרון עבור חלבון G: 0.1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
   הערה: רמת ה-pH היא קריטית בפרוטוקול זה. הנשירה של IgG דורש pH נמוך מאוד, ויש סיכון של אובדן של חומצות סיליות בשל הידרוליזה חומצה. לכן, הימנעות מתרחשת בתוך שניות, ו-pH שוחזר במהירות לנייטרליות, שמירה על שלמות IgG ו חומצות הסילית.
2. להכין את הדגימות: להפשיר את מדגם פלזמה קפוא ואז צנטריפוגה ב 80 x g עבור 10 דקות, ולהשאיר את הצלחת g מונוליתית חלבון וכימיקלים הנ ל 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. העבר מדגם μL 100 (שניתן להשתמש בו כדי לזהות את 2x כדי למנוע את הכשל הראשון) לתוך צלחת אוסף של 2 מ"ל (כאן, סך של שישה דוגמאות סטנדרטיות, דגימת בקרה אחת [מים אולטרה טהורים], ו 89 דגימות פלזמה תוכננו עבור 96 היטב לוחיות והוקצו באופן אקראי לצלחת).
4. לדלל את הדגימות עם 1x PBS ידי 1:7 (v/v).
5. נקה 0.45 יקרומטר הידרופילי פוליפרופילן (ghp) מסנן צלחת עם 200 μl של מים אולטרה טהור (לחזור על 2x).
6. להעביר את הדגימות מדולל לתוך לוחית הסינון ולסנן את הדגימות לתוך צלחת האוסף באמצעות משאבת ואקום (בקרת לחץ ואקום ב-266.6-399.9 Pa).
7. הכנת לוחות מונוליטיים של חלבון G
   1. מחק את מאגר האחסון.
   2. נקו את לוחות מונוליטיים עם 2 מ ל של מים אולטרה טהורים, 2 מ ל של 1x pbs, 1 מ ל של 0.1 M החומצה פורמית, 2 מ ל של 10x pbs, 2 מ ל של 1x pbs (ברציפות), ולהסיר נוזל זורם באמצעות משאבת ואקום.
8. העבר את הדגימות מסוננים כדי חלבון G מונוליטי לוחית עבור כריכת IgG וניקוי, ואז לנקות את לוחות מונוליטיים עם 2 מ ל של 1x PBS (לחזור על ניקוי 2x).
9. Elute igg עם 1 מ ל של 0.1 החומצה פורמית ולסנן את הדגימות לתוך צלחת האוסף על ידי משאבת ואקום, לאחר מכן להוסיף 170 μl של 1 M אמוניום ביקרבונט לתוך צלחת האוסף.
10. זיהוי הריכוז IgG באמצעות ספקטרוסקופיה ספיגת (אורך הגל האופטימלי = 280 nm).
    1. פתח את התוכנה ובחר במצב חלבון-CY3.
    2. לצייר 2 μL של מים אולטרה טהורים ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על ריק בתוכנה כדי לנקות את המסך (לחזור על 1x).
    3. לצייר 2 μL של מים אולטרה טהורים ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על לדוגמה בתוכנה כדי לזהות את המים אולטרה טהורים.
    4. לצייר 2 μL של המדגם IgG ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על לדוגמה בתוכנה כדי לזהות את המדגם.
    5. צייר 2 μL של מים אולטרה טהורים ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על ריק בתוכנה כדי לנקות את המסך.
    6. סגור את התוכנה.
       הערה: הנוסחה לחישוב ריכוז IgG היא כדלקמן:
       
       C_Igg = מקדם הכחדה x (13.7) x 1,000 μg/mL
11. לשים את IgG שחולצו להתייבש בתנור ב 60 ° צ' ולשמר את IgG המחולצים (300 μL שחולצו IgG עבור 4 h).
    1. הסר 300 μL של חילוץ IgG אם הריכוז גדול מ-1,000 μg/mL.
    2. הסר 350 μL של חילוץ IgG אם הריכוז הוא בין 500-1000 μg/mL.
    3. הסר 400 μL של חילוץ IgG אם הריכוז הוא בין 200-500 μg/mL.
    4. הסר 600 μL של חילוץ IgG אם הריכוז קטן מ 200 μg/mL.
       הערה: ריכוז IgG צריך להיות רצוי > 200 μg/mL לאיתור הבאים. הסכום הממוצע של IgG צריך להיות רצוי > 1200 μg, אשר ניתן נבדק 2x במקרה הבדיקה הראשונה נכשלת.
12. ניקוי לוחית מונוליתית בחלבון G לשימוש חוזר
    1. שטוף את הצלחת עם 2 מ ל של מים אולטרה טהור, 1 מ ל 0.1 M NaOH (להסרת החלבונים של זירז), 4 מ ל של מים אולטרה טהור, ו 4 מ ל של 1x PBS (ברציפות), ואז להסיר נוזל זורם באמצעות משאבת ואקום.
    2. לשטוף את הצלחת עם 2 מ ל של מים אולטרה טהור, 2 מ ל 30% propan-2-ol (להסרת חלבונים הידרופובי מאוגד), 2 מ ל של מים אולטרה טהורים, ו 4 מ ל של 1x PBS (ברציפות), ואז להסיר נוזל זורם באמצעות משאבת ואקום.
    3. לשטוף את הצלחת עם 1 מ ל של מאגר (20% אתנול + 20 מ"מ טריס + 0.1 M הנאל) ולהוסיף 1 מ ל של מאגר (20% אתנול + 20 מ"מ טריס + 0.1 M הנאל) לצלחת, ואז לעזוב את הצלחת ב 4 ° c.

2. גליקן לשחרר

1. הכן את IgG יבשים ולאחסן את הכימיקלים כולל 1.33% SDS, 4% Igepal (החנות הרחק מן האור), ו 5x PBS ב RT.
2. הכנת האנזים PNGase F על ידי דילול 250 U אנזים עם 250 μL של מים אולטרה טהורים.
3. דנטורציה של IgG
   1. הוסף 30 μL של 1.33% SDS ולערבב על ידי vortexing, להעביר את המדגם לתוך 65 תנור ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן להסיר אותו מהתנור ולתת לנוח 15 דקות.
   2. הוסף 10 μL של 4% Igepal ומניחים אותו על האינקובטור רועד עבור 5 דקות.
4. הסרה ושחרור של גליקנים
   1. הוסף 20 μL של 5x PBS ו 30-35 μL של 0.1 מול/L NaOH כדי לווסת pH של 8.0, ולערבב על ידי vortexing. הוסף 4 μL של האנזים של PNGase F ומערבבים על ידי vortexing. לאחר מכן, מודטה עבור 18-20 h באמבט מים 37 ° c.
   2. מכניסים את הגליקנים המשוחררים לייבוש בתנור ב-60 ° c עבור 2.5-3.0 h.
   3. שמרו את הגליקנים המשוחררים ב-80 ° c עד למדידה נוספת.
      הערה: שלב זה הוא קריטי. המפתח כדי גליקן לשחרר הוא שיפור הפעילות של האנזים PNGase F כדי למקסם את היעילות שלה.

3. גליקן מתייג ומאפשר טיהור

1. הכן את 2-האמינאמיד (2-AB) תיוג מגיב עם 0.70 מ"ג של 2-AB, 10.50 μL של חומצה אצטית, 6 מ ג של נתרן cyanoboroהידריד (NaBH₃CN), ו 24.50 μl של diמתיל סולפוקסיד (dmso) (נפח כולל = 35 μl). לאחר מכן, להוסיף חומצה אצטית, 2-AB, ו NaBH₃CN לתוך dmso בסדר.
2. לתייג את הגליקנים באמצעות 35 μL של 2-AB תיוג מגיב, להעביר את הגליקנים המסומנים ל-מתנד עבור 5 דקות, העברה לתנור עבור 3 h ב 65 ° c, לאחר מכן העברה RT עבור 30 דקות.
   הערה: יש לבצע את השלבים הניתנים לתיוג כולו תוך הגנה מפני אור.
3. לטיפול pretreat 0.2 יקרומטר מסנן לוחית עם 200 μl של 70% אתנול, 200 μl של מים אולטרה טהורים, ו-200 μl של 96% acetonitrile (4 ° c), ולאחר מכן להסיר פסולת באמצעות משאבת ואקום.
4. טיהור של 2-AB מתויג גליקן
   1. הוסף 700 μL של 100% aceton, לתוך 2-AB המסומן גליקן והעבר לאינקובטור רועד עבור 5 דקות.
   2. צנטריפוגה ב 134 x g עבור 5 דקות (4 ° c).
   3. העבר את המדגם לצלחת מסנן 0.2 יקרומטר ghp עבור 2 דקות ולהסיר את פילטרט (נוזל זורם) באמצעות משאבת ואקום.
5. לשטוף 2-AB התווית גליקן עם 200 μl של 96% acetonitrile (4 ° c) ולהסיר את פילטרט (נוזל זורם) באמצעות משאבת ואקום 5x-6x.
6. לאליוט 2-AB התווית גליקן עם 100 μL של מים אולטרה טהורים 3x.
7. להעביר את הגליל 2-AB המסומן לתוך תנור להתייבש ב 60 ° c עבור 3.5 h.
8. שמרו את ה- N-גליפחיות המסומנות ב-80 ° c עד למדידה נוספת.

4. הידרופילי-כרומטוגרפיה וניתוח של גליקנים

1. מיזוג מכשירי הכנת שלבים ניידים
   1. הכנת שלבים ניידים כולל ממס A: 100 mM אמוניום (pH = 4.4), ממס B: 100% acetonitrile, ממס C: 90% אולטרה טהור מים (10% מתנול), ומס D: 50% מתנול (אולטרה טהור מים).
   2. פתח את התוכנה כדי לשלוט בשלבים הניידים.
   3. לשטוף את הכלים של ה-, הזרמת מכשירים בקצב הזרימה של 0.2 mL/min (50% מממס B ו50%) איזון עבור 30 דקות, ולאחר מכן בקצב זרימה של 0.2 mL/min (25% ממס A ו-75% מומס B) איזון עבור 20 דקות, אז קצב הזרימה של 0.4 mL/min איזון.
2. מפזר את התווית N-גליקנים עם 25 μl של תערובת של 100% acetonitrile ומים אולטרה טהורים ביחס 2:1 (v/v). לאחר מכן, צנטריפוגה ב 134 × g עבור 5 דקות (4 ° c) וטען 10 μl של N-גליקות מתויג לתוך כלי המכשירים.
3. הפרד את התוויות N-גליקות בקצב הזרימה של 0.4 mL/min עם מעבר הדרגתי ליניארי של 75% עד 62% acetonitrile עבור 25 דקות. לאחר מכן, בצע ניתוח אנליטי על-ידי סולם כיול תוספי/העמודה גליקואפיד ב-60 ° צ' (כאן, שמרו דגימות ב -4 ° צ' לפני ההזרקה).
4. לזהות N-גליניתן זריחה ב עירור ו גל פליטה אורכי של 330 ננומטר ו 420 nm, בהתאמה.
5. שילוב הגליקנים המבוססים על מיקום שיא וזמן שמירה.
6. לחשב את הערך היחסי של כל גליקן שיא (GP)/כל גליקן פיקס (באחוזים,%) כדלקמן: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, וכו '.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 1, מנתחים Igg N-גליקנים לתוך 24 הראשונים igg גליקן הפסגות (GPs) מבוסס על מיקום שיא וזמן השמירה. מבני N-גליקן זמינים דרך זיהוי ספקטרומטר המסה לפי מחקר קודם (שולחן 1)¹⁵. כדי להבטיח כי התוצאות היו דומות, החלה נורמליזציה בש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הוא משמש כשיטה לניתוח יחסי כמותי^5,15. התוצאות מצביעות על כך שהוא טכנולוגיית גילוי יציבה עם השגות ודיוק כמותי יחסית. כמות הגליקנים בכל שיא מתבטאת כאחוז של השטח המשולב הכולל באמצעות ה-, המהווה את הערך היחסי. הקוונפיקציה היחסית משפרת את יכולת ההשוואה של דגימות ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-aminobenzamide, 2-AB	Sigma, China
96-well collection plate	AXYGEN
96-well filter plate	Pol	0.45 um GHP
96-well monolithic plate	BIA Separations
96-well plate rotor	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Acetic acid	Sigma, China
Acetonitrile	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate	Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker	Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China	ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column	Watts technology Co., Ltd, China	BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma, China
Disodium phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens	Tester instruments Co., Ltd	202-2AB
Empower 3.0	Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid	Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit	Sigma, China
HCl	Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany	5430
Igepal	Sigma, China
Low temperature centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator	Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate	Watts technology Co., Ltd, China	186001831
Methanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter	Millipore Co., Ltd, America	Advantage A10
NaOH	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester	Sartorius Co., Ltd, Germany	PB-10
Phosphate buffered saline, PBS	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette	Eppendorf Co., Ltd, Germany	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme	Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS	Sigma, China
Sodium chloride	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma, China
Spectrophotometer	Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd	B-500
Transfer liquid gun	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China	4672100
Tris	Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator	Thermo Co., Ltd, America	MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography	Watts technology Co., Ltd, China	Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump	Watts technology Co., Ltd, China	725000604
Volatilizing machine/Dryer	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Vortex	Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China	NP-30S
Water-bath	Tester instruments Co., Ltd	DK-98-IIA
Weighing balance	Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.	MP200B