초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

요약

면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

초록

글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.

서문

인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형^1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다^2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다^3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암^4와관련이 있다.

감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모세관 겔 전기 영동등 은 높은 처리량 글리코믹에서 가장 널리 사용됩니다. esccence 검출 (xCGE-LIF), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS), 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석법 (LC-ESI-MS) . 이러한 방법은 낮은 유속, 불안정한 결과 및 불량 감도 특이성의 이전의^{단점을 극복했다5,6}.

UPLC는 IgG N-glycosylation 및 특정 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 널리 사용됩니다 (즉, 노화^7,비만^8,이상지질혈증^9,타입 II 당뇨병^10,고혈압^11,허혈성 뇌졸중^12,파킨슨 병^13). 위에서 언급한 다른 세 가지 방법에 비해 UPLC는^다음과같은 장점을 가지고^5,14. 첫째, 상대적 정량 분석 방법을 제공하고, 전체 면적 정규화를 수반하는 데이터 분석은 각 샘플의 비교성을 향상시킨다. 둘째, 장비 비용과 필요한 전문 지식이 상대적으로 적기 때문에 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야로 쉽게 구현하고 변환할 수 있습니다. 여기에 제시된 UPLC에 대한 소개이므로 더 널리 사용될 수 있습니다.

프로토콜

이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다^12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은.

1. IgG 격리

1. 결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십시오. 에탄올 + 20 mM 트리스 + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), 단백질 G용 세정 용액 : 0.1 M NaOH + 30 % 프로판 -2-올.
   참고: 이 프로토콜에서는 pH 수준이 매우 중요합니다. IgG의 용출은 매우 낮은 pH를 필요로하며, 산 가수 분해로 인한 시실산의 손실 위험이 있다. 따라서 용출은 몇 초 내에 발생하고 pH는 IgG 및 시실산의 무결성을 보존하여 중성으로 신속하게 복원됩니다.
2. 시료 를 준비 : 냉동 플라즈마 샘플을 해동 한 다음 10 분 동안 80 x g에서 원심 분리를 하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 단백질 G 모놀리식 플레이트와 상기 화학 물질을 둡니다.
3. 100 μL 샘플(첫 번째 실패를 방지하기 위해 2x를 검출하는 데 사용할 수 있음)을 2mL 수집 플레이트(총 6개의 표준 샘플, 1개의 제어 샘플 [초순수]) 및 89개의 플라즈마 샘플을 96개의 웰 플레이트에 대해 설계하고 무작위로 할당했습니다. 접시에)를 제공합니다.
4. 샘플을 1x PBS로 1:7(v/v)로 희석합니다.
5. 0.45 μm 친수성 폴리프로필렌(GHP) 필터 플레이트를 200 μL의 초순수(반복 2x)로 청소합니다.
6. 희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고 진공 펌프(266.6-399.9Pa에서 진공 압력 제어)를 사용하여 샘플을 수집 플레이트로 필터링합니다.
7. 단백질 G 모놀리식 플레이트의 제조
   1. 저장소 버퍼를 삭제합니다.
   2. 초순수 2mL, PBS 1mL 2mL, 0.1M 포름산 1mL, 10x PBS 2 mL, 1x PBS 2 mL(순차적으로) 모놀리식 플레이트를 청소하고 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
8. 여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트로 옮긴 다음, 1x PBS 2 mL로 모놀리식 플레이트를 세척합니다(청소 2x 반복).
9. 0.1 M 포르믹산 1 mL로 IgG를 호루라기 하고 진공 펌프로 샘플을 수집 플레이트에 걸러낸 다음 1M 암모늄 중탄산염 170 μL을 수집 플레이트에 추가합니다.
10. 흡수 분광광도계(최적 파장 = 280 nm)를 사용하여 IgG 농도를 검출합니다.
    1. 소프트웨어를 열고 단백질 CY3 모드를 선택합니다.
    2. 2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지우고(1x 반복).
    3. 초순수 2μL을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 초순수를 감지합니다.
    4. IgG 샘플 2 μL을 그려 서 화면에 로드 한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 샘플을 감지합니다.
    5. 2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지웁습니다.
    6. 소프트웨어를 닫습니다.
       참고: IgG 농도를 계산하는 공식은 다음과 같습니다.
       
       C_IgG = 흡광도 x 소멸 계수 (13.7) x 1,000 μg/mL
11. 추출된 IgG를 60°C에서 오븐에서 건조시키고 추출된 IgG(300 μL 추출된 IgG 4시간)를 보존한다.
    1. 농도가 1,000 μg/mL보다 큰 경우 추출된 IgG의 300 μL을 제거합니다.
    2. 농도가 500-1,000 μg/mL 인 경우 추출된 IgG의 350 μL을 제거합니다.
    3. 농도가 200-500 μg/mL 인 경우 추출 된 IgG의 400 μL을 제거하십시오.
    4. 농도가 200 μg/mL보다 작은 경우 추출된 IgG의 600 μL을 제거합니다.
       참고: IgG의 농도는 후속 검출을 위해 바람직하게는 >200 μg/mL이어야 합니다. IgG의 평균 양은 바람직하게는 >1,200 μg이어야하며, 첫 번째 테스트가 실패할 경우 2배 테스트할 수 있습니다.
12. 재사용을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트 청소
    1. 초순수 2mL, 0.1M NaOH 1 mL(침전된 단백질 제거용), 초순수 4mL, 1x PBS 4mL(순차적으로)로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
    2. 초순수 2mL, 프로판-2-ol 2mL(결합 소수성 단백질 제거용), 초순수 2mL, 1x PBS 4mL(순차적으로) 2mL로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
    3. 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl)으로 플레이트를 씻고 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 mm Tris + 0.1 M NaCl)을 접시에 추가한 다음 플레이트를 4 °C에서 둡니다.

2. 글리칸 방출

1. 건조 된 IgG를 준비하고 1.33 % SDS, 4 % Igepal (빛에서 멀리 저장) 및 RT에서 5 x PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다.
2. 250 U 효소를 250 μL의 초순수로 희석하여 PNGase F 효소를 준비합니다.
3. IgG의 변성
   1. 30 μL의 1.33% SDS를 넣고 소용돌이에 의해 혼합하고 샘플을 65 °C 오븐으로 10 분 동안 옮은 다음 오븐에서 제거한 다음 15 분 동안 놓습니다.
   2. 4% 이게팔 10 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
4. 글리칸 제거 및 방출
   1. 5x PBS 20 μL과 0.1 mol/L NaOH의 30-35 μL을 추가하여 8.0의 pH를 조절하고 소용돌이로 혼합합니다. PNGase F 효소 4 μL을 넣고 와르싱하여 섞습니다. 이어서, 37°C 수조에서 18-20시간 동안 배양한다.
   2. 방출된 글리칸을 2.5-3.0시간 동안 60°C에서 오븐에서 건조시다.
   3. 방출된 글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다.
      참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 글리칸 방출의 핵심은 PNGase F 효소의 활성을 개선하여 효율성을 극대화하는 것입니다.

3. 글리칸 라벨링 및 정제

1. 2-아미노벤자미드(2-AB) 라벨링 시약을 0.70 mg의 2-AB, 10.50 μL의 아세트산, 6 mg의 시아노보로하이드라이드 나트륨(NaBH₃CN), 그리고 24.50 μL의 디메틸 설산화물(DMSO) (총 부피 = 35μL)을 준비한다. 이어서, 아세트산, 2-AB 및 NaBH₃CN을 순서대로 DMSO에 첨가한다.
2. 2-AB 라벨 시약 35 μL을 사용하여 글리칸에 라벨을 붙인 후 5 분 동안 발진기로 옮기고 65 °C에서 3 시간 동안 오븐으로 옮은 다음 30 분 동안 RT로 옮김하십시오.
   참고: 전체 글리칸 라벨링 단계는 빛으로부터 보호하면서 수행해야 합니다.
3. 0.2 μm GHP 필터 플레이트를 70% 에탄올 200 μL, 초순수 200 μL, 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 처리한 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다.
4. 2-AB 표지 글리칸의 정화
   1. 2-AB 표지 글리칸에 100% 아세토니트릴 700 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터로 옮김을 옮김을 넣습니다.
   2. 134 x g에서 5 분 (4 °C)의 원심 분리기.
   3. 샘플을 0.2 μm GHP 필터 플레이트로 2분 동안 옮기고 진공 펌프를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.
5. 2-AB 표지 글리칸을 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 세척하고 진공 펌프5x-6x를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.
6. 100 μL의 초순수 3x로 2-AB 라벨이 붙은 글리칸.
7. 2-AB 라벨이 붙은 글리칸을 오븐에 옮겨 60°C에서 3.5시간 동안 건조시다.
8. 라벨이 붙은 N-글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다.

4. 친수성 상호 작용 크로마토그래피 및 글리칸 분석

1. UPLC 계측기의 컨디셔닝 및 이월 상 준비
   1. 용매 A: 100 mM 암모늄 포메이트 (pH = 4.4), 용매 B : 100 % 아세토니트릴, 용매 C : 90 % 초순수 (10 % 메탄올), 및 용매 D : 50 % 메탄올 (초순수)을 포함한 이상을 준비합니다.
   2. 소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.
   3. UPLC 계측기는 0.2 mL/min(50% 용매 B 및 50% 용매 C)의 유량으로 30분 동안 밸런싱한 다음 0.2 mL/min(25% 용매 A 및 75% 용매 B)의 유량속도로 20분 동안 밸런싱한 다음 0.4 mL/min 밸런싱의 유량으로 세척합니다.
2. 라벨이 붙은 N-글리칸을 100% 아세토니트릴과 초순수의 혼합물25 μL로 2:1 비율(v/v)으로 용해시다. 이어서, 134×g에서 5분(4°C)의 원심분리기를 UPLC 계측기에 라벨이 붙은 N-글리칸의 10 μL을 적재한다.
3. 25 분 동안 75 % ~ 62 %의 아세토니트릴의 선형 구배와 0.4 mL / min의 유량으로 라벨이 붙은 N-글리칸을 분리하십시오. 이어서, 60°C에서 UPLC상에서 덱스트란 교정 사다리/글리코펩타이드 컬럼에 의한 분석 실행을 수행하였다(여기서, 시료는 주입 전에 4°C에서 보관하였다).
4. N-글리칸 형광을 각각 330 nm 및 420 nm의 여기 및 방출 파장에서 검출합니다.
5. 피크 위치 및 유지 시간에 따라 글리칸을 통합합니다.
6. 각 글리칸 피크(GP)/모든 글리칸 피크(GP)의 상대값 계산(백분율, %) 다음과 같이: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GP*100, 기타

결과

도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)^15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적...

토론

UPLC는 상대정량분석방법^5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-aminobenzamide, 2-AB	Sigma, China
96-well collection plate	AXYGEN
96-well filter plate	Pol	0.45 um GHP
96-well monolithic plate	BIA Separations
96-well plate rotor	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Acetic acid	Sigma, China
Acetonitrile	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate	Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker	Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China	ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column	Watts technology Co., Ltd, China	BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma, China
Disodium phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens	Tester instruments Co., Ltd	202-2AB
Empower 3.0	Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid	Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit	Sigma, China
HCl	Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany	5430
Igepal	Sigma, China
Low temperature centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator	Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate	Watts technology Co., Ltd, China	186001831
Methanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter	Millipore Co., Ltd, America	Advantage A10
NaOH	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester	Sartorius Co., Ltd, Germany	PB-10
Phosphate buffered saline, PBS	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette	Eppendorf Co., Ltd, Germany	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme	Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS	Sigma, China
Sodium chloride	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma, China
Spectrophotometer	Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd	B-500
Transfer liquid gun	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China	4672100
Tris	Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator	Thermo Co., Ltd, America	MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography	Watts technology Co., Ltd, China	Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump	Watts technology Co., Ltd, China	725000604
Volatilizing machine/Dryer	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Vortex	Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China	NP-30S
Water-bath	Tester instruments Co., Ltd	DK-98-IIA
Weighing balance	Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.	MP200B