Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

Résumé

Immunoglobulin G (IgG) N-glycanest caractérisé en utilisant la chromatographie d'interaction hydrophile UPLC. En outre, la structure de IgG N-glycan est clairement séparée. Présenté ici est une introduction à cette méthode expérimentale afin qu'il puisse être largement utilisé dans les milieux de recherche.

Résumé

Glycomics est une nouvelle sous-spécialité dans la recherche sur les systèmes d'omiques qui offre un potentiel significatif dans la découverte de biomarqueurs de prochaine génération pour la susceptibilité aux maladies, la découverte de cibles médicamenteuses et la médecine de précision. D'autres IgG N-glycans ont été rapportés dans plusieurs maladies chroniques communes et suggérés pour avoir le grand potentiel dans des applications cliniques (c.-à-d., biomarqueurs pour le diagnostic et la prévision des maladies). IgG N-glycans sont largement caractérisés en utilisant la méthode de chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) chromatographie liquide ultra-performance (UPLC). UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative élevée. En outre, la structure de L'IgG N-glycan est clairement séparée, et la composition de glycane et l'abondance relative dans le plasma sont caractérisées.

Introduction

N-glycosylation des protéines humaines est une^modification post-traduction n 1 commune et essentielle et peut aider à prédire l'occurrence et le développement des maladies de façon relativement précise. En raison de la complexité de sa structure, on s'attend à ce qu'il y ait plus de 5 000 structures de glycane, offrant un grand potentiel en tant que biomarqueurs diagnostiques et prédictifs pour les maladies². N-glycansattachés à l'immunoglobuline G (IgG) se sont avérés essentiels pour la fonction d'IgG, et IgG N-glycosylation participe à l'équilibre entre les systèmes pro- et anti-inflammatoires³. L'IgG N-glycosylation différentielle est impliquée dans le développement et la progression de la maladie, représentant à la fois une prédisposition et un mécanisme fonctionnel impliqué dans la pathologie de la maladie. Le rôle inflammatoire de L'IgG N-glycosylation a été associé au vieillissement, aux maladies inflammatoires, aux maladies auto-immunes et au cancer⁴.

Avec le développement de la technologie de détection, les méthodes suivantes sont les plus largement utilisées dans les glycomics à haut débit : chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) chromatographie liquide ultra-performante avec détection de fluorescence (UPLC-FLR), électrophoresis de gel capillaire multiplex avec fluorescence induite par laser détection (xCGE-LIF), spectrométrie de masse laser assistée par matrice /ionisation (MALDI-TOF-MS) et spectrométrie de masse électrospray de chromatographie liquide (LC-ESI-MS) . Ces méthodes ont surmonté les lacunes précédentes de faible flux, des résultats instables, et une faible spécificité de sensibilité^5,6.

UPLC est largement utilisé pour explorer l'association entre IgG N-glycosylation et certaines maladies (c.-à-d., vieillissement⁷, obésité⁸, dyslipidémie⁹, diabète de type II¹⁰, hypertension¹¹, accident vasculaire cérébral ischémique¹², et la maladie de Parkinson¹³). Par rapport aux trois autres méthodes mentionnées ci-dessus, UPLC a les avantages suivants^5,14. Tout d'abord, il fournit une méthode relative d'analyse quantitative, et l'analyse des données qui implique la normalisation totale de la zone améliore la comparabilité de chaque échantillon. Deuxièmement, le coût de l'équipement et l'expertise requise sont relativement faibles, ce qui facilite la mise en œuvre et la transformation des biomarqueurs de glycosylation en applications cliniques. Présenté ici est une introduction à UPLC afin qu'il puisse être plus largement utilisé.

Protocole

Tous les sujets inclus dans le protocole ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'Université médicale de la capitale, Beijing, Chine¹². Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque sujet au début de l'étude.

1. IgG isolement

1. Préparer les produits chimiques, y compris le tampon de liaison (saline tamponnée de phosphate, PBS) : 1x PBS (pH à 7,4), tampon neutralisant : 10x PBS (pH à 6,6-6,8), eluent : 0,1 M d'acide formique (pH à 2,5), solution neutralisante pour l'éluence : 1 M de bicarbonate d'ammonium, tampon stocké : 20 % éthanol 20 mM Tris 0,1 M NaCl (pH 7,4), solution de nettoyage pour la protéine G : 0,1 M NaOH - 30 % propan-2-ol.
   REMARQUE : Le niveau de pH est critique dans ce protocole. L'élution d'IgG nécessite un pH très faible, et il ya un risque de perte d'acides sialiques dus à l'hydrolyse acide. Par conséquent, l'élution se produit en quelques secondes, et le pH est rapidement restauré à la neutralité, préservant l'intégrité de l'IgG et les acides sialiques.
2. Préparer les échantillons : décongeler l'échantillon de plasma congelé puis centrifuger à 80 x g pendant 10 min, et laisser la plaque monolithique de protéine G et les produits chimiques mentionnés ci-dessus pendant 30 min à température ambiante (RT).
3. Transférer un échantillon de 100 L (qui peut être utilisé pour détecter 2x pour prévenir la première défaillance) dans une plaque de collecte de 2 ml (ici, un total de six échantillons standard, un échantillon témoin [eau ultra-pure], et 89 échantillons de plasma ont été conçus pour 96 plaques de puits et assignés au hasard à l'assiette).
4. Diluer les échantillons avec 1x PBS par 1:7 (v/v).
5. Nettoyer une plaque de filtre en polypropylène hydrophile (GHP) de 0,45 m avec 200 ll d'eau ultra-pure (répéter 2x).
6. Transférer les échantillons dilués dans la plaque filtrage et filtrer les échantillons dans la plaque de collecte à l'aide d'une pompe à vide (contrôlez la pression du vide à 266,6-399,9 Pa).
7. Préparation des plaques monolithiques protéiques G
   1. Jetez le tampon de stockage.
   2. Nettoyer les plaques monolithiques avec 2 ml d'eau ultra-pure, 2 ml de 1x PBS, 1 ml d'acide formique de 0,1 M, 2 ml de 10 x PBS, 2 ml de 1x PBS (séquentiellement), et retirer le liquide qui coule à l'aide d'une pompe à vide.
8. Transférer les échantillons filtrés dans la plaque monolithique de la protéine G pour la liaison IgG et le nettoyage, puis nettoyer les plaques monolithiques avec 2 ml de 1x PBS (répéter le nettoyage 2x).
9. Elute IgG avec 1 ml d'acide formique de 0,1 M et filtrer les échantillons dans la plaque de collecte par pompe à vide, puis ajouter 170 l de 1 M de bicarbonate d'ammonium dans la plaque de collecte.
10. Détecter la concentration d'IgG à l'aide d'un spectrophotomètre d'absorption (longueur d'onde optimale de 280 nm).
    1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez le mode protéine-CY3.
    2. Dessinez 2 l'eau ultra-pure et chargez-la dans l'écran, puis cliquez sur Blank dans le logiciel pour effacer l'écran (répéter 1x).
    3. Dessinez 2 l'eau ultra-pure et chargez-la dans l'écran, puis cliquez sur Échantillon dans le logiciel pour détecter l'eau ultra-pure.
    4. Dessinez 2 L d'échantillon IgG et chargez-le dans l'écran, puis cliquez sur Échantillon dans le logiciel pour détecter l'échantillon.
    5. Dessinez 2 l'eau ultra-pure et chargez-la dans l'écran, puis cliquez sur Blank dans le logiciel pour effacer l'écran.
    6. Fermez le logiciel.
       REMARQUE : La formule de calcul de la concentration d'IgG est la suivante :
       
       C_IgG - coefficient d'absorption x extinction (13,7) x 1 000 g/mL
11. Mettre l'IgG extrait à sécher dans un four à 60 oC et conserver l'IgG extrait (300 l'IgG extrait pendant 4 h).
    1. Enlever 300 L d'IgG extrait si la concentration est supérieure à 1 000 g/mL.
    2. Enlever 350 L d'IgG extrait si la concentration se situe entre 500 et 1 000 g/mL.
    3. Enlever 400 L d'IgG extrait si la concentration se situe entre 200 et 500 g/mL.
    4. Enlever 600 L d'IgG extrait si la concentration est inférieure à 200 g/mL.
       REMARQUE : La concentration d'IgG devrait être de préférence de préférence 200 g/mL pour une détection ultérieure. La quantité moyenne d'IgG devrait être de préférence de préférence 1 200 g, ce qui peut être testé 2x en cas d'échec du premier test.
12. Nettoyage de la plaque monolithique de protéine G pour la réutilisation
    1. Laver la plaque avec 2 ml d'eau ultra-pure, 1 ml de 0,1 M NaOH (pour enlever les protéines précipitées), 4 ml d'eau ultra-pure, et 4 ml de 1x PBS (séquentiellement), puis retirer le liquide qui coule à l'aide d'une pompe à vide.
    2. Laver la plaque avec 2 ml d'eau ultra-pure, 2 ml de propan-2-ol 30 % (pour enlever les protéines hydrophobes liées), 2 ml d'eau ultra-pure et 4 ml de 1 x PBS (séquentiellement), puis retirer le liquide qui coule à l'aide d'une pompe à vide.
    3. Laver l'assiette avec 1 ml de tampon (20 % d'éthanol et 20 mm Tris et 0,1 M NaCl) et ajouter 1 ml de tampon (20 % d'éthanol et 20 mm Tris et 0,1 M NaCl) à l'assiette, puis laisser la plaque à 4 oC.

2. Libération de Glycan

1. Préparer l'IgG séché et stocker les produits chimiques, y compris 1,33% SDS, 4% Igepal (magasin loin de la lumière), et 5x PBS à RT.
2. Préparer l'enzyme PNGase F en diluant 250 U enzyme avec 250 L d'eau ultra-pure.
3. Dénaturation d'IgG
   1. Ajouter 30 oL de SDS à 1,33 % et mélanger par vortex, transférer l'échantillon dans un four à 65 oC pendant 10 min, puis le retirer du four et laisser reposer pendant 15 min.
   2. Ajouter 10 l de 4% igepal et le placer sur l'incubateur secouant pendant 5 min.
4. Enlèvement et libération de glycanes
   1. Ajouter 20 oL de 5x PBS et 30-35 'L de 0.1 mol/L NaOH pour réguler un pH de 8.0, et mélanger par vortexing. Ajouter 4 oL d'enzyme PNGase F et mélanger par vortex. Ensuite, incuber de 18 à 20 h dans un bain d'eau de 37 oC.
   2. Mettre les glycanes libérés à sécher dans un four à 60 oC pendant 2,5 à 3,0 h.
   3. Enregistrer les glycanes libérés à -80 oC jusqu'à ce que la mesure soit plus poussée.
      REMARQUE : Cette étape est cruciale. La clé de la libération de glycane est d'améliorer l'activité de l'enzyme PNGase F pour maximiser son efficacité.

3. Étiquetage et purification de glycan

1. Préparer le réactif d'étiquetage 2-aminobenzamide (2-AB) avec 0,70 mg de 2-AB, 10,50 l d'acide acétique, 6 mg de cyanoborohydride de sodium (NaBH₃CN), et 24,50 l de sulfoxure de diméthyle (DMSO) (volume total de 35 l). Ensuite, ajoutez de l'acide acétique, 2-AB, et NaBH₃CN dans l'ordre DMSO.
2. Étiqueter les glycanes à l'aide de 35 oL de réactif d'étiquetage 2-AB, transférer les glycanes étiquetés à l'oscillateur pendant 5 min, transférer au four pendant 3 h à 65 oC, puis transférer à RT pendant 30 min.
   REMARQUE : L'étape entière d'étiquetage de glycan doit être exécutée tout en se protéger de la lumière.
3. Pretreat une plaque de filtre GHP de 0,2 m avec 200 l d'éthanol à 70 %, 200 l d'eau ultra-pure et 200 l d'acétonitrile à 96 % (4 oC), puis retirer les déchets à l'aide d'une pompe à vide.
4. Purification du glycan étiqueté 2-AB
   1. Ajouter 700 l de 100 % d'acétonitrile à l'acétonitrile étiqueté 2-AB et transférer dans un incubateur secouant pendant 5 min.
   2. Centrifugeuse à 134 x g pendant 5 min (4 oC).
   3. Transférer l'échantillon dans une plaque de filtre GHP de 0,2 m pendant 2 min et retirer le filtrate (liquide qui coule) à l'aide d'une pompe à vide.
5. Laver le glycane étiqueté 2-AB à l'aide de 200 l d'acétonitrile à 96 % (4 oC) et retirer le filtrate (liquide qui coule) à l'aide d'une pompe à vide 5x-6x.
6. Elute 2-AB étiqueté glycane avec 100 L d'eau ultra-pure 3x.
7. Transférer le glycane étiqueté 2-AB dans un four pour sécher à 60 oC pendant 3,5 h.
8. Enregistrer les N-glycansétiquetés à -80 oC jusqu'à ce que la mesure soit plus poussée.

4. Chromatographie d'interaction hydrophile et analyse des glycanes

1. Conditionnement des instruments UPLC et préparation des phases mobiles
   1. Préparer des phases mobiles incluant le solvant A : 100 mM d'ammonium formate (pH 4,4), solvant B : 100 % d'acétonitrile, solvant C : 90 % d'eau ultra-pure (10 % de méthanol) et solvant D : 50 % de méthanol (eau ultra-pure).
   2. Ouvrez le logiciel pour contrôler les phases mobiles.
   3. Laver les instruments UPLC à un débit de 0,2 mL/min (50 % solvant B et 50 % solvant C) en équilibre pendant 30 min, puis à un débit de 0,2 ml/min (25 % solvant A et 75 % solvant B) équilibrant pendant 20 min, puis un débit de 0,4 ml/min d'équilibrage.
2. Dissoudre les n-glycans étiquetés avec 25 l d'un mélange d'acétonitrile à 100 % et d'eau ultra-pure à un ratio de 2:1 (v/v). Ensuite, la centrifugeuse à 134 g pendant 5 min (4 oC) et la charge de 10 l des n-glycansétiquetés dans les instruments UPLC.
3. Séparez les n-glycans étiquetés à un débit de 0,4 ml/min avec un gradient linéaire de 75 % à 62 % d'acétonitrile pendant 25 min. Ensuite, effectuez une analyse par échelle d'étalon dextran/colonne de glycopeptide sur un UPLC à 60 oC (ici, les échantillons ont été conservés à 4 oC avant l'injection).
4. Détecter la fluorescence N-glycane à des longueurs d'ondes d'excitation et d'émission de 330 nm et 420 nm, respectivement.
5. Intégrez les glycanes en fonction de la position de pointe et du temps de rétention.
6. Calculer la valeur relative de chaque pic de Glycan (GP)/ tous les pics de Glycan (GP) (pourcentage, %) comme suit: GP1: GP1/GPP 100, GP2: GP2/GPs 100, GP3: GP3/GPs10, etc.

Résultats

Comme le montre la figure 1, IgG N-glycansont été analysés en 24 pics initiaux de glycane IgG (GP) basés sur la position de pointe et le temps de rétention. Les structures N-glycansont disponibles par la détection de spectrométrie de masse selon une étude précédente ( tableau1)¹⁵. Pour s'assurer que les résultats étaient comparables, la normalisation totale de la superficie a été appliqu...

Discussion

L'UPLC sert de méthode d'analyse quantitative relative^5,15. Les résultats indiquent que l'UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative. La quantité de glycanes dans chaque pic est exprimée en pourcentage de la superficie totale intégrée à l'aide de l'UPLC, qui est la valeur relative. La quantification relative améliore la comparabilité des échantillons d'essai. En outre, 96 plaque...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-aminobenzamide, 2-AB	Sigma, China
96-well collection plate	AXYGEN
96-well filter plate	Pol	0.45 um GHP
96-well monolithic plate	BIA Separations
96-well plate rotor	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Acetic acid	Sigma, China
Acetonitrile	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate	Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker	Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China	ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column	Watts technology Co., Ltd, China	BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma, China
Disodium phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens	Tester instruments Co., Ltd	202-2AB
Empower 3.0	Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid	Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit	Sigma, China
HCl	Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany	5430
Igepal	Sigma, China
Low temperature centrifuge	Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator	Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate	Watts technology Co., Ltd, China	186001831
Methanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter	Millipore Co., Ltd, America	Advantage A10
NaOH	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester	Sartorius Co., Ltd, Germany	PB-10
Phosphate buffered saline, PBS	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette	Eppendorf Co., Ltd, Germany	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme	Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS	Sigma, China
Sodium chloride	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma, China
Spectrophotometer	Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd	B-500
Transfer liquid gun	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China	4672100
Tris	Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator	Thermo Co., Ltd, America	MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography	Watts technology Co., Ltd, China	Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump	Watts technology Co., Ltd, China	725000604
Volatilizing machine/Dryer	Eppendorf Co., Ltd, Germany	T_1087461900
Vortex	Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China	NP-30S
Water-bath	Tester instruments Co., Ltd	DK-98-IIA
Weighing balance	Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.	MP200B