Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento simple de grupos específicos de células neuronales vivas que expresan proteína fluorescente verde de líneas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Este método permite una variedad de estudios ex vivo centrados en neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar las células para el cultivo a corto plazo.

Resumen

Durante el proceso de envejecimiento, muchas células acumulan altos niveles de daño que conducen a la disfunción celular, que subyace en muchas condiciones geriátricas y patológicas. Las neuronas postmitoticas representan un tipo de célula principal afectada por el envejecimiento. Aunque existen múltiples modelos de mamíferos de envejecimiento neuronal, son desafiantes y costosos de establecer. El gusano redondo Caenorhabditis elegans es un modelo potente para estudiar el envejecimiento neuronal, ya que estos animales tienen una vida útil corta, una caja de herramientas genética robusta disponible y un sistema nervioso bien catalogado. El método presentado aquí permite el aislamiento sin fisuras de células específicas basado en la expresión de una proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Las líneas animales transgénicas que expresan GFP bajo promotores distintos específicos del tipo de célula se digieren para eliminar la cutícula externa y se interrumpen mecánicamente para producir lodos que contienen varios tipos de células. Las células de interés se separan de las células no objetivo mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, o por cuentas magnéticas acopladas anti-GFP. Las células aisladas pueden ser cultivadas por un tiempo limitado o inmediatamente utilizadas para análisis ex vivo específicos de células, como el análisis transcripcional por PCR cuantitativo en tiempo real. Por lo tanto, este protocolo permite un análisis rápido y robusto de las respuestas específicas de las células dentro de diferentes poblaciones neuronales en C. elegans.

Introducción

Durante las últimas décadas, el organismo modelo metazoano Caenorhabditis elegans ha sido un tremendo activo en el estudio de las neuronas, los circuitos neuronales y su papel en las respuestas fisiológicas y conductuales, y el envejecimiento asociado Enfermedades. Una característica única de C. elegans es que los animales son transparentes, lo que permite mapear el linaje de todas las células somáticas adultas¹. C. elegans también alberga una cantidad manejable de neuronas, lo que lleva a la morfología y conectividad del sistema nervioso siendo bien entendido². El linaje celular invariable, la corta vida útil y la abundancia de herramientas genéticas de alto rendimiento disponibles para C. elegans lo convierten en un organismo modelo ideal para el estudio del envejecimiento dentro de diferentes poblaciones neuronales.

El envejecimiento de las neuronas y los trastornos neurodegenerativos son complejos, y cada trastorno tiene firmas patológicas únicas asociadas con él. Sin embargo, para muchos de estos trastornos, como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, una característica común es la carga progresiva de proteínas mal plegadas^3,4,5. En ambas enfermedades, las proteínas se multiplican en sí y se agregan dentro de la célula para causar toxicidad, lo que en última instancia conduce a la muerte celular^4,5. Para el envejecimiento adecuado de las neuronas, la homeostasis de las mitocondrias, más específicamente la proteica homeostasis, es importante, ya que las perturbaciones y la dishomeostasis pueden conducir a la neurodegeneración^6,7,8. Las células están equipadas con varios mecanismos para mantener la homeostasis proteica, una de las que se trata de la respuesta proteica desplegada (UPR), una vía clásica donde las señales del retículo endoplasmático (ER) activan cascadas de señal intracelular, lo que conduce a una transcripción respuesta⁹. Al igual que este EPU^ER, los metazoos muestran una respuesta similar a la pérdida de homeostasis de proteína mitocondrial, el llamado EPU mitocondrial (UPR^mt)7,8. C. elegans parece ser el organismo más basal para tener una vía^mt UPR confirmada y bien definida^7.

La función/disfunción de poblaciones neuronales específicas dentro de una red más grande puede ser difícil de evaluar debido a su conectividad intrínseca y complejidad³. Sin embargo, a menudo es necesario estudiar poblaciones neuronales distintas debido a enfermedades específicas del tipo celular con patologías complejas, como las asociadas con la homeostasis de proteínas celulares deterioradas. En C. elegans, poblaciones neuronales específicas pueden ser manipuladas genéticamente permitiendo la observación fácil in vivo. El sistema nervioso de C. elegans consiste principalmente en neuronas, con un pequeño porcentaje de células gliales. En los gusanos hermafroditas adultos, hay aproximadamente 302 neuronas, subdivididas en más de 100 clases diferentes^2,10. Las neuronas como las neuronas colinérgicas predominan en las uniones neuromusculares, mientras que las neuronas dopaminérgicas están implicadas principalmente en la sensación^10,11. Como tanto la actividad motora como las capacidades sensoriales disminuyen con la edad, es importante detallar los conocimientos mecanicistas sobre los defectos en estas neuronas individuales^11,12. Como tal, es necesario un método simple y robusto para aislar las células intactas de interés para estudios ex vivo posteriores.

Aquí, describimos un método eficaz optimizado para el aislamiento rápido de células neuronales específicas que expresan proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de aislamiento se puede realizar en gusanos larvarios, juveniles o adultos. El aislamiento de las células de los gusanos larvarias fue publicado previamente por Zhang et al.¹³ y no se discutirá aquí. Una nota importante aquí es que todos los gusanos deben estar en la misma etapa de la vida para evitar la digestión excesiva del animal o la contaminación de los animales en diferentes etapas de la vida. A través de la interrupción enzimática y mecánica de la cutícula de nematodos, un exoesqueleto alto en colágeno y otras proteínas estructurales, una amplia variedad de células se puede aislar^13,14. Las células se pueden aislar a través de citometría de flujo o anticuerpos etiquetados como cuentas magnéticas. Típicamente, el ARN se aísla a través de un método de isotiocianato de fenol y guanidina para asegurar el enriquecimiento de la población celular deseada^15. Con mucho cuidado, estas células aisladas se pueden mantener en un matraz de cultivo o en un plato multipozo. Este método representa una herramienta única y poderosa en el estudio de neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar células vivas y funcionales para un cultivo posterior.

Protocolo

1. Preparación y recolección de gusanos envejecidos para el aislamiento celular

NOTA: A continuación se explica el aislamiento de las neuronas colinérgicas del repositorio transgénico unc-17::GFP (OH13083) obtenido del repositorio de cepas del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) de la Universidad de Minnesota. Es imperativo mantener las condiciones estériles para evitar la contaminación de hongos o bacterias.

1. Preparar y sincronizar gusanos a través del método de blanqueo descrito por T. Stiernagle¹⁶. Para los experimentos de envejecimiento, los gusanos de placas en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) que contienen una solución de agua de 25 M de fluorodeoxiuridina (FuDR) para reducir la producción de huevos y detener la incubación de óvulos. Inspeccione las placas de agar regularmente para evitar la contaminación o la eclosión de óvulos, ya que esto causará resultados poco fiables.
   NOTA: Para las células unc-17::GFP, normalmente se utilizan tres placas NGM de 100 mm x 15 mm para aislar una cantidad suficiente de células de interés¹⁶.
2. Recoja gusanos y prepare búferes para el aislamiento celular.
   1. Recoger gusanos en un tubo cónico de 15 ml. Lavar los gusanos de la placa con 1,5 mL de tampón M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO₄7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) y centrífuga durante 5 min a 1.600 x g. Deseche el sobrenadante y lave los gusanos con 1 ml de tampón M9. Repita la centrifugación y lávese durante un total de cinco veces para eliminar la mayor cantidad posible de contaminación por E. coli.
      NOTA: Añadir antibióticos (50 g/ml), como la ampicilina, en este paso puede ayudar a reducir la contaminación bacteriana.
   2. Para dos muestras, prepare 2 ml de dodecyl sulfato de sodio-ditiothreitol (SDS-DTT) tampón de lisis: 200 mM de TDT, 0,25% (p/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0) y 3% (p/v) sacarosa.
   3. Preparar 15 ml de tampón de aislamiento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) y almacenarlo en hielo.
      NOTA: Tanto el búfer de lisis SDS-DTT como el búfer de aislamiento deben estar actualizados antes de cada experimento.
3. Interrupción de la cutícula y aislamiento de una sola célula
   1. Animales centrífugos recogidos en el paso 1.2.1 para 5 min a 1.600 x g. Retire todos los gusanos sobrenadant es y suspenda en 1 ml de medios M9 y transfiera al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Gusanos de pellets con centrifugación a 1.600 x g durante 5 min.
   3. Añadir 200 l de tampón de lisis SDS-DTT a los gusanos e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Los gusanos deben parecer "guiñados" a lo largo del cuerpo si se ven bajo un microscopio de luz.
      NOTA: La exposición prolongada al tampón de lisis SDS-DTT puede provocar la muerte de gusanos, que pueden ser monitoreados observando gusanos. Los gusanos que están muertos se alargarán y no se curvarán.
   4. Agregue 800 ml de tampón de aislamiento helado y mezcle moviendo suavemente el tubo.
   5. Gusanos de pellets durante 1 min a 13.000 x g a 4oC, retire el sobrenadante y lave con 1 ml de tampón de aislamiento.
   6. Repita el paso 1.3.5 para un total de cinco veces, eliminando cuidadosamente el búfer de aislamiento cada vez.
   7. Añadir 100 l de mezcla de proteasa de Streptomyces griseus (15 mg/ml) (Tablade materiales) disuelto en tampón de aislamiento al pellet e incubar durante 10-15 min a RT.
      NOTA: Al igual que con el tampón de lisis SDS-DTT, la digestión prolongada de la proteasa puede dar lugar a una escisión excesiva de proteínas a lo largo de la membrana plasmática, evitando el aislamiento de la GFP expuesta a la superficie a través de perlas magnéticas.
   8. Durante la incubación con mezcla de proteasa, aplique la interrupción mecánica pipeteando las muestras hacia arriba y hacia abajo contra la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una punta de micropipeta de 200 ml durante 60 x 70 veces. Mantenga la punta de la pipeta contra la pared del tubo de microcentrífuga con presión constante para desasociar correctamente las células.
   9. Para determinar la etapa de la digestión, retire un pequeño volumen (-1-5 l) de la mezcla de digestión, suéltelo en un portacristales e inspeccione con un microscopio de cultivo de tejido. Después de 5-7 min de incubación, los fragmentos de gusano deben tener cutícula visiblemente reducida y una suspensión de células será fácilmente visible.
   10. Detenga la reacción con 900 ml del medio L-15 de Leibovitz en frío disponible en el uso comercial, complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y penicilina-estreptomicina (concentración final a 50 U/ml de penicilina y 50 g/ml de estreptomicina).
   11. Fragmentos y células aislados de pellets por centrifugación durante 5 min a 10.000 x g a 4oC. Lave las células peletizadas con 1 ml de medios fríos suplementados con L-15 dos veces más para asegurarse de que se elimina el exceso de residuos y la cutícula.
   12. Resuspenda las células peletizadas en 1 ml de medios suplementados con L-15 y déjelas en hielo durante 30 min. Lleve la capa superior, de aproximadamente 700 a 800 l, a un tubo de microcentrífuga. Esta capa contiene células sin residuos celulares y se utilizará en el aislamiento posterior de las células de interés.
   13. Siguiendo las instrucciones del fabricante, utilice un contador de células automatizado o un hemocitómetro para medir la densidad celular de 10 a 25 ml de células aisladas.

2. Aislamiento de células gFP positivas a través de citometría de flujo o perlas magnéticas anti-GFP

NOTA: Hay dos métodos que se pueden implementar para aislar tipos de celda específicos. El primer método consiste en utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), mientras que el segundo método utiliza perlas magnéticas conjugadas por anticuerpos para agrupar células que expresan proteínas localizadas por membrana plasmática distintas. Este último método requiere la localización de GFP a la membrana plasmática, por lo que está disponible para la interacción con el cordón magnético acoplado a anticuerpos.

1. Aislamiento de células gFP positivas por citometría de flujo
   1. A partir de la suspensión de células aisladas recogida en el paso 1.3.12, las células centrífugas durante 5 min a 10.000 x g a 4 oC. Deseche el sobrenadante y suspenda las células peletizadas en un medio suplementado con L-15 a una densidad celular de no más de 6 x 10⁶ células/ml para evitar sobrecargar el citómetro de flujo.
   2. Ordene las celdas por expresión GFP positiva utilizando un catómetro de flujo capaz de ordenar muestras. Las celdas gFP negativas se pueden utilizar como un control para el análisis específico de tipo no celular.
      NOTA: Como se mencionó anteriormente, se puede utilizar un enfoque alternativo para aislar las células gFP positivas si la proteína de interés etiquetada por GFP se localiza en la membrana plasmática de las células. En este caso, se puede emplear el protocolo descrito en la sección 2.2.
2. Aislamiento de células gFP positivas a través de perlas magnéticas anti-GFP
   1. A partir de la suspensión de células aisladas recogida en el paso 1.3.12, las células centrífugas durante 5 min a 10.000 x g a 4 oC. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en 485 ml de medio suplementado con L-15. Añadir a la solución, añadir 15 sl de ddH₂O prelavados con perlas magnéticas acopladas por anticuerpos -GFP.
   2. Incubar las células con la perla magnética a 4oC durante 1 h con un torneado muy suave. El torneado excesivo dañará las células.
   3. Después de la incubación, la muestra de centrífuga durante 5 min a 10.000 x g a 4 oC, luego lave el pellet 2veces con 1 ml de medio suplementado con L-15 para eliminar las células GFP negativas.
3. Cultivo de células aisladas
   1. Placa aisló las células en una placa estéril de 6 pocillos.
      NOTA: Estas placas pueden estar recubiertas con lectina de maní para aumentar la unión celular; sin embargo, si las células se van a utilizar inmediatamente, este paso puede ser ignorado.
   2. Colocar la placa en un recipiente de plástico e incubar las células a 20 oC con una toallita húmeda o papel de tejido blando (añadir 50 g/ml de ampicilina a ddH₂O para asegurar que no haya crecimiento bacteriano en la toallita) para agregar humedad a las células. No incubar en una incubadora de CO 2, ya que los niveles elevados de CO₂ pueden dañar las células.

3. Imágenes fluorescentes de células aisladas positivas en GFP

1. Encienda la bombilla fluorescente de un microscopio invertido con accesorio de fluorescencia y deje que se caliente durante unos 10 minutos.
2. Retire el cultivo celular de la incubadora y fije en el escenario del microscopio invertido con un accesorio de florescencia. Deslice el filtro GFP en las ranuras bajo la etapa del microscopio.
3. Vea las celdas con un aumento de 50x. Las células gAP-positivas aisladas con éxito serán fácilmente visibles. Tome fotos con el accesorio de la cámara del microscopio.

4. Extracción de ARN de células aisladas

NOTA: La extracción de ARN debe realizarse inmediatamente después del aislamiento celular para garantizar una alta calidad del material. El ARN aislado se puede utilizar para producir ADNc y la posterior medición de los niveles de transcripción por PCR cuantitativo (qPCR). Todos los tubos, puntas y reactivos deben estar libres de RNase, y el espacio de trabajo debe lavarse con etanol antes de la extracción de ARN.

1. A partir de células aisladas recogidas en el paso 2.1.2, células centrífugas en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, libre de RNase durante 5 min a 10.000 x g a 4 oC. Si las células se aíslan a través de cuentas magnéticas, siga la recolección de células como se indicó anteriormente.
2. Con un micropisero, retire el sobrenadante del tubo de microcentrífuga centrifugado y agregue 100 ml de medio M9 para lavar el medio suplementado con L-15. Células centrífugas 5 min a 10.000 x g a 4oC y elimina el sobrenadante. Para asegurarse de que se retiran todos los medios, repita durante un total de tres lavados retirando cuidadosamente el sobrenadante cada vez.
3. Añadir 1 ml de solución de isotiocianato de fenol y guanidina (Tablade materiales)a las células y pipetear la suspensión con cuidado. Incubar la mezcla a RT durante 5 min.
4. Después de la incubación, agregue 250 solución de isotiocianato de fenol y guanidina
5. Centrifugar la solución durante 5 min a 10.000 x g a 25oC.
6. Retire cuidadosamente la mayor parte de la capa acuosa superior con un micropita como sea posible, sin perturbar las capas orgánicas inferiores, y transfiera la capa inferior a un nuevo tubo de microcentrífuga libre de RNase de 1,5 ml. Al nuevo tubo, añadir 500 s de isopropanol y mezclar invirtiendo el tubo. Incubar esta solución a RT durante 5 min.
7. Centrifugar el tubo a 14.000 x g durante 20 min a 25oC.
8. Mientras mantiene las muestras sobre hielo, retire tanto isopropanol como sea posible con un micropipeta, y agregue suavemente 1 ml de etanol del 70% (v/v) en ddH₂O libre de RNase al tubo. Asegúrese de no expulsar la solución directamente en la parte inferior del tubo; aplique la mezcla de etanol/agua al lado del tubo.
9. Centrífuga a 10.000 x g durante 5 min a 25oC.
10. Retire la mayor parte del etanol y seque al aire sobre hielo durante 3 x 5 minutos.
    NOTA: El etanol debe eliminarse después de este paso; sin embargo, una inspección cuidadosa de la parte inferior del tubo es importante para asegurarse de que no quede etanol.
11. Después de que el tubo se seque al aire, agregue 15 x 20 l de ddH₂O libre de RNase y mida la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. La pureza de la muestra debe medirse como una relación de 260 nm/280 nm. Esta relación debe ser aproximadamente >2.
    NOTA: El ARN aislado se puede congelar y almacenar a -20 oC. Sin embargo, es muy preferencial utilizar un kit de síntesis de ADNc tan pronto como sea posible para garantizar una producción de ADNc de alta calidad. La PCR cuantitativa puede seguir las instrucciones proporcionadas por el fabricante del termociclador utilizado en el laboratorio.

Resultados

El protocolo descrito aquí permite el aislamiento específico de las neuronas colinérgicas unc-17::GFP-positivas de la tiña C. elegans para estudios ex vivo posteriores, como el perfil de expresión génica específico del tipo de célula y cultivo a corto plazo para mediciones de electrofisiología de abrazadera de parche.

Figura 1 muestra unc-17::GFP-neuronas colinér...

Discusión

El gusano redondo C. elegans es un modelo bien establecidoy potente para estudiar la salud neuronal y la enfermedad 2. Con amplias herramientas genéticas para manipular estos animales y una cantidad manejable de varios tipos de neuronas mapeadas con precisión, una gran cantidad de datos se pueden recopilar con una cantidad relativamente pequeña de material. Aquí, delineamos un método optimizado para aislar neuronas distintas de animales enteros. Al interrumpir las proteínas externas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11