回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

要約

ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex vivo研究を可能にし、さらに短期的な培養のために細胞を分離する能力を有する。

要約

老化プロセスの間に, 多くの細胞は、細胞機能障害につながる損傷の高レベルを蓄積します, 多くの老人および病理学的状態の下に.有人性後ニューロンは、加齢の影響を受ける主要な細胞型を表します。神経老化の複数の哺乳類モデルが存在するが、それらは確立するために挑戦的で高価である。回虫のカエモルハブ炎エレガンスは、これらの動物は短い寿命、利用可能な堅牢な遺伝的ツールボックス、およびよくカタログ化された神経系を持っているので、神経老化を研究するための強力なモデルです。本明細書に提示される方法は、トランスジェニック緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいて特定の細胞をシームレスに単離することを可能にする。異なる、細胞型特異的プロモーターの下でGFPを発現するトランスジェニック動物株は、外側のキューティクルを除去するために消化され、様々な細胞タイプを含むスラリーを生成するために穏やかに機械的に破壊される。その後、目的の細胞は、蛍光活性化細胞選別、または抗GFP結合磁気ビーズによって非標的細胞から分離されます。その後、単離された細胞を限られた時間で培養するか、リアルタイム定量PCRによる転写分析などの細胞特異的な生体内分析に直ちに使用することができます。したがって、このプロトコルは、C.エレガンスの異なるニューロン集団内の細胞特異的応答の迅速かつ堅牢な分析を可能にする。

概要

過去数十年にわたり、メタゾンモデル生物のカエオルハブ炎エレガンスは、ニューロン、ニューロン回路、生理的および行動的応答におけるその役割、および老化関連神経変性の研究において、多大な財産となっています。病気。C.エレガンスのユニークな特徴は、動物が透明であり、すべての成人体細胞の系統をマッピングできるようにすること^{です 1}.C. エレガンスはまた、神経細胞の管理可能な量を収容し、神経系の形態と接続性がよく理解されている2.C.エレガンスで利用可能な不変細胞系統、短い寿命、および豊富なハイスループット遺伝的ツールは、異なる神経集団内の老化の研究のための理想的なモデル生物を作る。

ニューロンの老化と神経変性疾患は複雑であり、各疾患はそれに関連するユニークな病理学的特徴を有する。しかし、パーキンソン病やアルツハイマー病などのこれらの疾患の多くでは、一般的な特徴は、誤ったたんぱく質3、4、5の進行性負荷である。これらの疾患の両方において、タンパク質は細胞内で誤って折り畳まれ、凝集して毒性を引き起こし、最終的には細胞死4、5につながる。ニューロンの適切な老化のために、ミトコンドリアの恒常性、より具体的にはタンパク質恒常性は、摂動および嚥下障害が^神経変性6、7、8を引き起こす可能性があるとして重要である。細胞はタンパク質恒常性を維持するための様々なメカニズムを備え、1つは展開されたタンパク質応答(UPR)である-小球網膜(ER)からのシグナルが細胞内シグナルカスケードを活性化し、転写につながる古典的な経路である。応答⁹.このUPR^ERに似て、メタゾンはミトコンドリアタンパク質恒常性の喪失に対して同様の応答を示し、いわゆるミトコンドリアUPR(UPRmt)7,8である。C. エレガンスは、確認され、明確に定義されたUPR^mt経路7を持っている最も基底生物であるように見えます.

大規模なネットワーク内の特定のニューロン集団の機能/機能不全は、その本質的な接続性と複雑さ³を評価するのが難しい場合があります。しかし、細胞性タンパク質恒常性障害に関連するものなど、複雑な病理を有する細胞型特異的疾患のために、異なる神経集団を研究する必要が生じることが多い。C.エレガンスでは、特定の神経集団を遺伝的に操作し、生体内での顔の観察を可能にする。C.エレガンスの神経系は、主に神経細胞で構成され、グリア細胞の割合は小さい。成人のヘルマクロダイトワームでは、約302のニューロンがあり、100以上の異なるクラス2、10に細分化されている。コリン作動性ニューロンなどのニューロンは神経筋接会で優勢であり、ドーパミン作動性ニューロンは主に感覚10,11に関与する。運動活動と感覚能力の両方が年齢とともに低下するにつれて、これらの個々のニューロンの欠陥に関する機械的洞察を詳細に述べる必要があります^11,12.そのため、その後のex vivo研究のために目的とする無傷の細胞を単離するシンプルで堅牢な方法が必要である。

ここでは、C.エレガンスから緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する特定の神経細胞を迅速に単離するための最適化された有効な方法について説明する。この分離方法は、幼虫、若年性または成人のワームに対して行うことができる。幼虫ワームからの細胞の分離は、以前にZhang et al. al.¹³によって発表され、ここでは議論されません。ここで重要な注意事項は、すべてのワームが異なるライフステージで動物の過剰消化や動物からの汚染を防ぐために同じライフステージにある必要があることです。線虫キューティクルの酵素および機械的破壊の両方を通じて、コラーゲンおよび他の構造タンパク質の高い外骨格は、多種多様な細胞を単離することができる13、14。細胞は、その後、フローサイトメトリーまたは抗体標識磁気ビーズを介して単離することができる。典型的には、RNAは、所望の細胞^集団15の濃縮を確実にするためにフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離される。多くの注意を払って、これらの単離された細胞は、培養フラスコまたはマルチウェル皿で維持することができる。この方法は、特定のニューロンの研究におけるユニークで強力なツールを表し、さらなる培養のための生細胞および機能細胞を分離する能力を有する。

プロトコル

1. 細胞分離のための老化したワームの準備と収集

注:以下に説明すると、ミネソタ大学のカエノルハブティス遺伝学センター(CGC)株リポジトリから得られたトランスジェニックunc-17::GFP株(OH13083)からのコリン作動性ニューロンの単離です。 真菌や細菌からの汚染を防ぐために、滅菌条件を維持することが不可欠です。

1. T. Stiernagle¹⁶で説明されているように、漂白方法を介してワームを準備し、同期します。老化実験では、フルオロデオキウリジン(FuDR)の25μM水溶液を含む線虫成長培地(NGM)プレート上にプレートワームを取り出し、卵の産生を減らし、卵の孵化を阻止する。寒天プレートを定期的に検査し、汚染や卵の孵化を防ぐため、信頼性の低い結果を引き起こします。
   注:unc-17::GFP細胞の場合、通常3つの100mm x 15 mm NGMプレートを使用して、目的の十分な量の細胞を単離^する16。
2. ワームを収集し、セルの分離用にバッファーを準備します。
   1. 15 mLの円錐形の管でワームを集める。M9バッファーの1.5 mL(1 mM MgSO 4、85 mM NaCl、42 mM Na₂HPO₄·7H₂O、22 mM KH₂PO、pH 7.0)と遠心分離機を1,600 x gで5分間洗浄します。上清を捨て、M9バッファーの1 mLでワームを洗います。遠心分離を繰り返し、合計5回洗浄し、できるだけ多くの大腸菌汚染を除去します。
      注:このステップでアンピシリンなどの抗生物質(50 μg/mL)を添加すると、細菌汚染を減らすことができます。
   2. 2つのサンプルの場合は、2mLのドデシル硫酸ジチオスレイトール(SDS-DTT)リシスバッファーを調製します:200 mM DTT、0.25%(w/v)SDS、20 mM HEPES(pH 8.0)、および3%(w/v)サッ糖。
   3. 15 mLの絶縁バッファー(118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl 2、25 mM HEPES [pH 7.3]))を準備し、氷の上に保管します。
      注: SDS-DTT リシス バッファーと分離バッファーの両方を、各実験の前に新たにする必要があります。
3. キューティクル破壊と単一細胞分離
   1. 1,600 x gで5分間ステップ1.2.1で収集された遠心分離動物。M9培体の1mLで上清とサスペンドワームをすべて取り除き、1.5mLマイクロ遠心管に移します。
   2. 遠心分離を持つペレットワームを1,600 x gで5分間使用します。
   3. ワームに200 μLのSDS-DTTリシスバッファーを追加し、室温(RT)で5分間インキュベートします。虫は、光顕微鏡で見ると、体に沿って「ウィンクル」しているように見えるはずです。
      注:SDS-DTTリシスバッファーへの長時間の暴露は、ワームを観察することによって監視することができるワームの死をもたらす可能性があります。死んだワームは伸び、カールしません。
   4. 800 μLの氷冷絶縁バッファーを追加し、チューブを軽くフリックして混ぜます。
   5. ペレットワームを4°Cで13,000 x gで1分間、上清を除去し、1mLの単離バッファーで洗浄する。
   6. ステップ 1.3.5 を合計 5 回繰り返し、毎回分離バッファーを慎重に削除します。
   7. ストレプトマイセスグリセス(15mg/mL)(材料表)からプロテアーゼ混合物の100 μLをペレットに溶解し、RTで10-15分間インキュベートします。
      注:SDS-DTTリシスバッファーと同様に、拡張プロテアーゼ消化は、プラズマ膜に沿ってタンパク質の過剰な切断をもたらし、磁気ビーズを介して表面露出GFPの単離を防ぐ可能性があります。
   8. プロテアーゼ混合物によるインキュベーション中に、200μLマイクロピペットチップを使用して1.5mLマイクロ遠心分離管の底部に対してピペッティングサンプルを約60-70回使用して機械的破壊を行います。細胞を適切に切り離すために一定の圧力でマイクロ遠心管の壁に対してピペットの先端を保ちます。
   9. 消化の段階を決定するには、消化混合物の少量(〜1〜5 μL)を取り除き、ガラススライドに落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。インキュベーションの5−7分後、ワームの断片は目に見えてキューティクルを減少させ、細胞のスラリーが容易に見えるようにする必要があります。
   10. 市販の冷たいライボヴィッツのL-15培地の900 μLとの反応を停止し、10%の胎児ウシ血清(FBS)およびペニシリン連鎖マイシン(50 Μg/mLペニシリンおよび50 μg/mLストレプトマイシンの最終濃度)を補充した。
   11. ペレットは4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離により断片および細胞を単離した。余分な破片やキューティクルが除去されることを確認するために、冷たいL-15補充培温の1 mLでペレット化した細胞をもう2回洗浄します。
   12. L-15補充培養物の1mLでペレット化した細胞を再中断し、30分間氷の上に放置する。最上層(約700~800μL)をマイクロ遠心管に取ります。この層は、細胞の破片のない細胞を含み、目的の細胞のその後の単離に使用されます。
   13. メーカーの指示に従って、自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用して、単離された細胞の10−25 μLの細胞密度を測定します。

2. フローサイトメトリーまたは抗GFP磁気ビーズによるGFP陽性細胞の単離

注: 特定のセル・タイプを分離するためにデプロイできる方法は 2 つあります。第1の方法は蛍光活性化細胞選別(FACS)を用い、2番目の方法は抗体共役磁気ビーズを用して、異なる血漿膜局在タンパク質を発現する細胞をプールする。後者の方法は、GFPを血漿膜に局在化させる必要があり、したがって、抗体結合磁気ビーズとの相互作用のために利用できる。

1. フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞の単離
   1. ステップ1.3.12で採取した単離細胞懸濁液から、4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離細胞を採取した。流れ細胞計の過負荷を避けるために、L-15補充培地で上清細胞を廃棄し、6 x 10⁶細胞/mL以下の細胞密度に懸濁します。
   2. サンプルをソートできるフローサイトメーターを用いてGFP陽性発現で細胞をソートする。GFP陰性細胞は、非細胞型特異的分析の制御として使用することができる。
      注:前述のように、GFPタグ付きタンパク質が細胞の血漿膜に局在する場合、GFP陽性細胞を単離する代替アプローチを使用することができる。この場合、セクション2.2で説明するプロトコルを採用することができます。
2. 抗GFP磁気ビーズによるGFP陽性細胞の単離
   1. ステップ1.3.12で採取した単離細胞懸濁液から、4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離細胞を採取した。上清を廃棄し、L-15補充培地の485μLで細胞を懸濁させる。溶液にddH₂O予洗浄されたα-GFP抗体結合磁気ビーズの15 μLを添加する。
   2. 非常に穏やかな回転で1時間4°Cで磁気ビーズスラリーで細胞をインキュベートします。過度の回転は細胞に損傷を与えます。
   3. インキュベーション後、4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離液を洗浄し、次いでL-15補充培地の1mLでペレット2xを洗浄し、GFP陰性細胞を除去する。
3. 単離細胞の培養
   1. 無菌6ウェルマルチウェルプレートに分離した細胞をプレート化する。
      注:これらのプレートは、細胞の付着を増加させるためにピーナッツレクチンでコーティングすることができます;ただし、セルをすぐに使用する場合は、この手順を無視する可能性があります。
   2. プレートをプラスチック容器に入れ、湿った拭き取り紙または軟部組織紙で20°Cの細胞をインキュベートします(50 μg/mLアンピシリンをddH₂Oに加えて、拭き取りに細菌の増殖を防ぎます)。上昇したCO2レベルが細胞に損傷を与える可能性があるため、CO2インキュベーターでインキュベートしないでください。

3. 単離GFP陽性細胞の蛍光イメージング

1. 蛍光付着付きの反転顕微鏡の蛍光球根をオンにし、約10分間ウォームアップします。
2. インキュベーターから細胞培養物を取り出し、蛍花付着を持つ反転顕微鏡のステージに設定します。GFPフィルターを顕微鏡の段階の下の溝にスライドさせます。
3. 50倍の倍率でセルを表示します。正常に単離されたGFP陽性細胞は容易に見える。顕微鏡のカメラアタッチメントを使用して写真を撮ります。

4. 単離細胞からのRNAの抽出

注:RNAの抽出は、材料の高品質を確保するために、細胞単離直後に行われるべきです。単離されたRNAは、定量的PCR(qPCR)による転写レベルのcDNAおよびその後の測定に使用することができる。すべてのチューブ、チップ、試薬はRNaseフリーで、ワークスペースはRNA抽出の前にエタノール洗浄する必要があります。

1. ステップ2.1.2で採取した単離細胞から、1.5mL無菌中の遠心分離細胞、4°Cで10,000 x gで5分間RNaseフリーマイクロ遠心管チューブ。細胞が磁気ビーズを介して単離される場合は、上記のように細胞採取に従ってください。
2. マイクロピペットを使用して、遠心分離管から上清を取り出し、L-15補充培地を洗い流すためにM9培地の100 μLを追加します。遠心分離細胞は4°Cで10,000 x gで5分、上清を除去する。すべてのメディアを確実に取り除くために、毎回慎重に上清を取り除く合計3回の洗い流しを繰り返します。
3. フェノールとグアニジンイソチオシアネート溶液(材料の表)の1 mLを細胞に加え、懸濁液を慎重に上下にピペットします。RTで混合物を5分間インキュベートします。
4. インキュベーション後、250フェノールとグアニジンイソチオシアネート溶液を添加する
5. 25 °Cで10,000 x gで5分間溶液を遠心分離します。
6. 最下層の有機層を邪魔することなく、マイクロピペットでトップ水層をできるだけ慎重に取り除き、下層を新しい1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心管に移します。新しいチューブに、イソプロパノールの500 μLを追加し、チューブを反転して混合します。この溶液をRTで5分間インキュベートします。
7. 25 °Cで20分間14,000 x gでチューブを遠心分離します。
8. サンプルを氷の上に保ちながら、マイクロピペットでできるだけ多くのイソプロパノールを取り出し、RNaseフリーddH₂Oに70%(v/v)エタノールの1 mLをチューブに静かに加えます。溶液をチューブの底に直接排出しないようにしてください。チューブの側面にエタノール/水の混合物を適用します。
9. 遠心分離機 10,000 x gで 25 °C で 5 分間。
10. エタノールの大部分を取り除き、氷の上で空気乾燥を3-5分間取り除きます。
    注: エタノールは、この手順の後に削除する必要があります。しかし、エタノールが残らないように、チューブの底部を注意深く検査することが重要です。
11. チューブを空気乾燥させた後、RNaseフリーddH 2Oの15−20μLを追加し、260nm波長の分光光度計を使用してRNA濃度と純度を測定します。サンプルの純度は260 nm/280 nm比として測定する必要があります。この比率は約 >2 である必要があります。
    注:絶縁されたRNAは-20°Cで凍結および貯蔵することができる。しかし、cDNA合成キットをできるだけ早く使用して、高品質のcDNA生産を確保することは非常に優遇されています。定量的なPCRは実験室で使用される熱サイクラーの製造業者によって提供される指示を使用して従うことができる。

結果

ここで説明するプロトコルは、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングおよび最終的な結果のような後続のex vivo研究のための回虫C.エレガンスからのunc-17::GFP陽性コリン作動性ニューロンの特異的な単離を可能にするパッチクランプ電気生理学測定のための短期培養。

図1は、unc-17<...

ディスカッション

回虫C.エレガンスは、神経の健康と病気2を研究するための確立された強力なモデル^です。これらの動物を操作するための十分な遺伝的ツールと正確にマッピングされた様々なニューロンタイプの管理可能な量を使用すると、比較的少量の材料で大量のデータを収集することができます。ここでは、動物全体から異なるニューロンを分離するための最適化された方法を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11