Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.

Resumo

Durante o processo de envelhecimento, muitas células acumulam altos níveis de danos que levam à disfunção celular, que está subjacente a muitas condições geriátricas e patológicas. Os neurônios pós-mitóticos representam um tipo de célula principal afetado pelo envelhecimento. Embora existam vários modelos de mamíferos de envelhecimento neuronal, eles são desafiadores e caros para estabelecer. O lombriga Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para estudar o envelhecimento neuronal, como estes animais têm tempo curto, uma caixa de ferramentas genética robusta disponível, e sistema nervoso bem catalogado. O método aqui apresentado permite a isolação sem emenda de pilhas específicas baseadas na expressão de uma proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Linhas de animais transgênicas expressando GFP distintos, os promotores específicos do tipo celular são digeridos para remover a cutícula externa e suavemente interrompidas mecanicamente para produzir chorume contendo vários tipos de células. As células de interesse são então separadas de células não-alvo através de triagem de células ativadas por fluorescência, ou por anti-GFP-acoplado contas magnéticas. As pilhas isoladas podem então ser cultivadas por um tempo limitado ou ser usadas imediatamente para análises ex vivo Cell-specific tais como a análise transcricional pelo PCR quantitativo do tempo real. Assim, este protocolo permite a análise rápida e robusta de respostas Cell-specific dentro das populações neuronal diferentes em C. elegans.

Introdução

Ao longo das últimas décadas, o modelo metazoários organismo Caenorhabditis elegans tem sido um trunfo tremendo no estudo de neurônios, circuitos neuronais e seu papel em respostas fisiológicas e comportamentais, e envelhecimento associado neurodegenerativa Doenças. Uma característica única de C. elegans é que os animais são transparentes, permitindo que a linhagem de todas as células somáticas adultas seja mapeada¹. C. elegans também abriga a quantidade gerenciável de neurônios, levando à morfologia e conectividade do sistema nervoso sendo bem compreendido². A linhagem de células invariantes, o tempo curto e a abundância de ferramentas genéticas de alta produtividade disponíveis para C. elegans fazem dele um organismo modelo ideal para o estudo do envelhecimento dentro de diferentes populações neuronais.

O envelhecimento dos neurônios e as desordens neurodegenerativas são complexos, e cada desordem tem as assinaturas patológicas originais associadas com ela. No entanto, para muitas dessas desordens, como a doença de Parkinson e de Alzheimer, uma característica comum é a carga progressiva de proteínas desdobradas^3,4,5. Em ambas as doenças, as proteínas dobram e agregam dentro da célula para causar toxicidade, levando, em última análise, à morte celular^4,5. Para o envelhecimento adequado dos neurônios, a homeostase das mitocôndrias, mais especificamente a homeostase proteica, é importante, pois as perturbações e a distonostase podem levar à neurodegeneração^6,7,8. As pilhas são equipadas com os vários mecanismos para manter a homeostase da proteína, uma que é a resposta desdobrado da proteína (UPR) ― uma via clássica onde os sinais do retículo endoplasmático (er) ativam cascatas intracelular do sinal, conduzindo a um transcricional a resposta⁹. Semelhante a este UPR^er, metazoários mostrar uma resposta semelhante à perda de homeostase da proteína mitocondrial, o chamado UPR mitocondrial (UPR^MT)^7,8. C. elegans parece ser o organismo mais basal para ter^{uma via de} elevação confirmada e bem definida do RCQ⁷.

A função/disfunção de populações neuronais específicas dentro de uma rede maior pode ser difícil de avaliar devido à sua conectividade intrínseca e complexidade³. No entanto, muitas vezes há a necessidade de estudar populações neuronais distintas devido a doenças específicas do tipo celular com patologias complexas, como as associadas à homeostase da proteína celular prejudicada. Em C. elegans, populações neuronais específicas podem ser geneticamente manipuladas permitindo a observação facile in vivo. O sistema nervoso de C. elegans consiste principalmente de neurônios, com uma pequena percentagem de células gliais. Em vermes hermafroditas adultos, existem aproximadamente 302 neurônios, subdivididos em mais de 100 classes diferentes^2,10. Neurônios como os neurônios colinérgicos predominam nas junções neuromusculares, enquanto os neurônios dopaminérgicos estão principalmente envolvidos na sensação^10,11. Como a atividade motora e as habilidades sensoriais diminuem com a idade, é importante detalhar insights mecanísticos sobre defeitos nesses neurônios individuais^11,12. Como tal, há uma necessidade para um método simples e robusto isolar pilhas intactas do interesse para estudos ex vivo subseqüentes.

Aqui, nós descrevemos um método eficaz aperfeiçoado para a isolação rápida de pilhas neuronal específicas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de isolamento pode ser realizado em larvas larvares, juvenis ou adultas. A isolação das pilhas dos sem-fins larval foi publicada previamente por Zhang et al.¹³ e não será discutida aqui. Uma nota importante aqui é que todos os vermes precisam estar no mesmo estágio de vida para evitar a digestão do animal ou a contaminação de animais em diferentes estágios de vida. Através do rompimento enzimático e mecânico da cutícula do nematódeo, um exoesqueleto alto em colágeno e outras proteínas estruturais, uma grande variedade de células pode ser isolada^13,14. As pilhas podem então ser isoladas através da citometria do fluxo ou dos grânulos magnéticos etiquetados anticorpo. Tipicamente, o RNA é isolado através de um método do isotiocianato do phenol e do guanidina para assegurar o enriquecimento da população desejada da pilha¹⁵. Com muito cuidado estas pilhas isoladas podem ser mantidas em um balão da cultura ou em um prato do multi-poço. Este método representa uma ferramenta única e poderosa no estudo de neurônios específicos e tem a capacidade de isolar células ao vivo e funcionais para uma maior cultura.

Protocolo

1. preparação e coleta de vermes envelhecidos para isolamento celular

Nota: explicado abaixo é o isolamento de neurônios colinérgicos da linhagem transgênica UNC-17:: GFP (OH13083) obtida do repositório de estirpe Caenorhabditis Genetics Center (CGC) na Universidade de Minnesota. É imperativo manter condições estéreis para evitar a contaminação de fungos ou bactérias.

1. Prepare e sincronize os vermes através do método de branqueamento conforme descrito por T. Stiernagle¹⁶. Para experimentos de envelhecimento, vermes de placa em placas de meio de crescimento de nematoides (NGM) contendo 25 μM de solução de água de fluorodeoxiuridina (FuDR) para reduzir a produção de ovos e prender a eclosão de ovos. Inspecione as placas de agar regularmente para evitar contaminação ou incubação de ovos, pois isso causará resultados não confiáveis.
   Nota: para as células UNC-17:: GFP, normalmente 3 100 mm x 15 mm ngm placas são utilizadas para isolar uma quantidade suficiente de células de juros¹⁶.
2. Colete worms e prepare buffers para isolamento de células.
   1. Colete vermes em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes da placa com 1,5 mL de tampão M9 (1 mM MgSO₄, 85 mm nacl, 42 mm na₂HPO₄· 7h₂O, 22 mm KH₂Po, pH 7,0) e centrifugador durante 5 min a 1.600 x g. Descarte o sobrenadante e lave os vermes com 1 mL de tampão M9. Repita a centrifugação e lave por um total de cinco vezes para remover tanto quanto possível a contaminação de e. coli .
      Nota: a adição de antibióticos (50 μg/mL), como a ampicilina, nesta etapa pode ajudar a reduzir a contaminação bacteriana.
   2. Para duas amostras, preparar 2 ml de sódio Dodecil sulfato-dithiothreitol (SDS-DTT) tampão de Lise: 200 mm DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mm HEPES (pH 8,0), e 3% (w/v) sacarose.
   3. Prepare 15 mL de tampão de isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mm MgCl₂, 25 mm hepes [pH 7,3]) e guarde-o no gelo.
      Observação: o buffer de Lise SDS-DTT e o buffer de isolamento devem ser feitos de novo antes de cada experimento.
3. Rompimento da cutícula e isolação da única pilha
   1. Centrifugar os animais recolhidos no passo 1.2.1 por 5 min a 1.600 x g. Remova todos os sobrenadantes e suspenda os vermes em 1 mL de mídia M9 e transfira para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Vermes da pelota com centrifugação em 1.600 x g por 5 min.
   3. Adicionar 200 μL de tampão de lise de SDS-DTT a vermes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Vermes devem parecer ser piscou ao longo do corpo, se visto um microscópio de luz.
      Nota: a exposição prolongada ao tampão de Lise SDS-DTT pode resultar na morte de vermes, que podem ser monitorados observando-se vermes. Vermes que estão mortos vai alongar e não vai enrolar.
   4. Adicione 800 μL de tampão de isolamento gelado e misture suavemente o tubo.
   5. Vermes de pellets por 1 min a 13.000 x g a 4 ° c, remover sobrenadante e lavar com 1 ml de tampão de isolamento.
   6. Repita o passo 1.3.5 para um total de cinco vezes, removendo cuidadosamente o buffer de isolamento de cada vez.
   7. Adicionar 100 μL de mistura de protease de Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabela de materiais) dissolvido em tampão de isolamento para o pellet e incubar por 10 − 15 min em RT.
      Nota: tal como com o tampão de Lise SDS-DTT, a digestão prolongada da protease pode resultar em uma clivagem excessiva de proteínas ao longo da membrana plasmática, impedindo a isolação da GFP exposta à superfície através de grânulos magnéticos.
   8. Durante a incubação com mistura de protease, aplique o rompimento mecânico introduzindo amostras de pipetagem acima e para baixo de encontro à parte inferior do tubo do microcentrifugador de 1,5 mL com uma ponta da micropipeta de 200 μL para ~ 60 − 70 vezes. Mantenha a ponta da pipeta contra a parede do tubo do microcentrifugador com pressão constante para desassociar corretamente pilhas.
   9. Para determinar o estágio da digestão, remova um volume pequeno (~ 1 − 5 μL) da mistura da digestão, deixe-o cair em uma corrediça de vidro e inspecione-o usando um microscópio da cultura do tecido. Após 5 − 7 min de incubação, os fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e uma pasta de células será prontamente visível.
   10. Reação de parada com 900 μL de meio L-15 de Leibovitz a frio disponível comercialmente suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) e penicilina-estreptomicina (concentração final em 50 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina).
   11. Fragmentos isolados de pellets e células por centrifugação por 5 min a 10.000 x g a 4 ° c. Lave as células peletizadas com 1 mL de mídia L-15-suplementada a frio duas vezes mais para garantir que o excesso de detritos e cutícula seja removido.
   12. Ressuscite células peletizadas em 1 mL de meios suplementados com L-15 e deixe no gelo por 30 min. Tome a camada superior, aproximadamente 700 − 800 μL, a um tubo do microcentrifugador. Esta camada contém células sem detritos celulares e será usada no isolamento subsequente de células de interesse.
   13. Seguindo as instruções do fabricante, use um contador de células automatizado ou hemocimetro para medir a densidade celular de 10 − 25 μL de células isoladas.

2. isolação de pilhas GFP-positivas através da citometria do fluxo ou dos grânulos magnéticos do anti-GFP

Nota: existem dois métodos que podem ser implementados para isolar tipos de células específicas. O primeiro método é usar a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), enquanto o segundo método usa grânulos magnéticos conjugados por anticorpos para as células da piscina expressando proteínas distintas localizadas na membrana plasmática. O último método exige a localização do GFP à membrana de plasma, estando assim disponível para a interação com o grânulo magnético anticorpo-acoplado.

1. Isolamento de células GFP-positivas por citometria de fluxo
   1. Da suspensão isolada da pilha coletada na etapa 1.3.12, as pilhas do centrifugador por 5 minutos em 10.000 x g em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e suspenda as células peletizadas em meio suplementado com L-15 a uma densidade celular não superior a 6 x 10⁶ células/ml para evitar sobrecarregar o citometro de fluxo.
   2. Classifique as células pela expressão GFP-positive usando um citometro de fluxo capaz de classificar amostras. As células GFP-negativas podem ser usadas como um controle para análise específica de tipo não celular.
      Nota: como mencionado acima, uma aproximação alternativa para isolar pilhas GFP-positivas pode ser usada se a proteína GFP-etiquetada do interesse é localizada à membrana de plasma das pilhas. Neste caso, o protocolo descrito na seção 2,2 pode ser empregado.
2. Isolação de pilhas GFP-positivas através dos grânulos magnéticos do anti-GFP
   1. Da suspensão isolada da pilha coletada na etapa 1.3.12, as pilhas do centrifugador por 5 minutos em 10.000 x g em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e suspenda as células em 485 μL de meio suplementado com L-15. Adicionar 15 μL de ddH₂o pre-lavado α-GFP anticorpo-acoplado grânulos magnéticos à solução.
   2. Incubar as células com o cordão magnético a 4 ° c durante 1 h com giro muito suave. O torneamento excessivo danificará as células.
   3. Após a incubação, centrifugue a amostra por 5 min a 10.000 x g a 4 ° c, depois lave a pelota 2x com 1 ml de meio suplementado com L-15 para remover células GFP-negativas.
3. Cultivo de células isoladas
   1. A placa isolou pilhas em uma placa multi-well estéril de 6 poços.
      Nota: estas placas podem ser revestidas com o lectina do amendoim para aumentar o acessório da pilha; no entanto, se as células devem ser usadas imediatamente, esta etapa pode ser ignorada.
   2. Coloque a placa em um recipiente plástico e incubar as células a 20 ° c com uma limpeza úmida ou papel de tecido mole (adicione 50 μg/mL de ampicilina a ddH₂o para garantir que não haja crescimento bacteriano na limpeza) para adicionar umidade às células. Não incubar em uma incubadora do CO₂ , porque os níveis elevados do co₂ podem danificar as pilhas.

3. imagem latente fluorescente de pilhas GFP-positivas isoladas

1. Gire sobre a ampola fluorescente de um microscópio invertido com acessório da fluorescência e permita que aqueça acima por aproximadamente 10 minutos.
2. Remova a cultura de pilha da incubadora e ajuste no estágio do microscópio invertido com acessório da florescência. Deslize o filtro GFP nas ranhuras o estágio do microscópio.
3. Exiba as células com uma ampliação de 50x. Células GFP-positivas isoladas com sucesso serão prontamente visíveis. Tire fotos usando o acessório da câmera no microscópio.

4. extração de RNA de células isoladas

Nota: a extração de RNA deve ser realizada imediatamente após o isolamento celular para garantir a alta qualidade do material. O RNA isolado pode ser usado para produzir o cDNA e a medida subseqüente de níveis do Transcript pelo PCR quantitativo (qPCR). Todos os tubos, pontas, e reagentes devem ser RNase-livres, e o espaço de trabalho deve ser etanol-lavado antes da extração do RNA.

1. A partir de células isoladas coletadas na etapa 2.1.2, as células centrífugas em um 1,5 ml estéril, RNase-Free microcentrífuga para 5 min em 10.000 x g a 4 ° c. Se as células são isoladas através de grânulos magnéticos, siga a coleção da pilha como indicado acima.
2. Usando uma micropipeta, remova o sobrenadante do tubo de microcentrífuga centrifugada e adicione 100 μL de meio M9 para lavar o meio suplementado com L-15. Centrifugue as células 5 min a 10.000 x g a 4 ° c e retire o sobrenadante. Para garantir que todos os meios são removidos, repita para um total de três lavas cuidadosamente removendo sobrenadante cada vez.
3. Adicionar 1 mL de fenol e solução de isotiocianato de guanidina (tabela de materiais) para as células e pipetar a suspensão para cima e para baixo com cuidado. Incubar a mistura em RT por 5 min.
4. Após a incubação, adicionar 250 fenol e solução de isotiocianato de guanidina
5. Centrifugue a solução durante 5 min a 10.000 x g a 25 ° c.
6. Remova cuidadosamente o máximo da camada aquosa superior com uma micropipeta possível, sem perturbar as camadas orgânicas inferiores, e transfira a camada inferior para um novo tubo de microcentrífuga 1,5 mL RNase livre. Para o novo tubo, adicione 500 μL de isopropanol e misture invertendo o tubo. Incubar esta solução em RT por 5 min.
7. Centrifugue o tubo a 14.000 x g durante 20 min a 25 ° c.
8. Mantendo as amostras no gelo, remova o máximo de isopropanol possível com uma micropipeta e adicione suavemente 1 mL de etanol a 70% (v/v) em ddH₂o RNase livre para o tubo. Certifique-se de não ejetar a solução diretamente na parte inferior do tubo; aplicar a mistura de etanol/água ao lado do tubo.
9. Centrifugador a 10.000 x g durante 5 min a 25 ° c.
10. Remova a maior parte do etanol e seque o ar no gelo por 3 − 5 min.
    Nota: o etanol deve ser removido após esta etapa; no entanto, a inspeção cuidadosa da parte inferior do tubo é importante para garantir que nenhum etanol seja deixado.
11. Depois que o tubo é ar secado, adicione 15 − 20 μL de ddH RNase-livre₂o e meça a concentração e a pureza do RNA usando um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nanômetro. A pureza da amostra deve ser medida como uma relação de 260 nm/280 nanômetro. Esta proporção deve ser de aproximadamente > 2.
    Nota: o RNA isolado pode ser congelado e armazenado a-20 ° c. É, no entanto, altamente preferencial para usar um kit de síntese de cDNA o mais rapidamente possível para garantir a produção de cDNA de alta qualidade. O PCR quantitativo pode seguir usando as instruções fornecidas pelo fabricante do termociclador usado no laboratório.

Resultados

O protocolo descrito aqui permite o isolamento específico de UNC-17:: neurónios colinérgicos positivos do GFP da lombriga C. elegans para estudos ex vivo subsequentes, tais como perfil de expressão gênica específica do tipo celular e eventual cultivo de curto prazo para medições de eletrofisiologia de patch-Clamp.

A Figura 1 mostra os neurônios colinérgicos UNC-17

Discussão

A lombriga C. elegans é um modelo bem estabelecido e poderoso para estudar a saúde neuronal e doença². Com amplas ferramentas genéticas para manipular esses animais e a quantidade gerenciável de vários tipos de neurônio mapeados precisamente, uma grande quantidade de dados pode ser coletada com uma quantia relativamente pequena de material. Aqui, Delineamos um método otimizado para isolar neurônios distintos de animais inteiros. Interrompendo as proteínas da cutícula externa do...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11