Isolement des populations neuronales spécifiques de Roundworm Caenorhabditis elegans

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l'isolement simple des groupes spécifiques des cellules neuronales vivantes exprimant la protéine fluorescente verte des lignes transgéniques de Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet une variété d'études ex vivo axées sur des neurones spécifiques et a la capacité d'isoler les cellules pour la culture à court terme.

Résumé

Pendant le processus de vieillissement, beaucoup de cellules accumulent des niveaux élevés de dommages menant au dysfonctionnement cellulaire, qui sous-tend beaucoup de conditions gériatriques et pathologiques. Les neurones post-mitotiques représentent un type de cellule majeur affecté par le vieillissement. Bien que de multiples modèles mammifères du vieillissement neuronal existent, ils sont difficiles et coûteux à établir. Le ver rond Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour étudier le vieillissement neuronal, car ces animaux ont une courte durée de vie, une boîte à outils génétique robuste disponible, et un système nerveux bien catalogué. La méthode présentée ici permet un isolement sans faille de cellules spécifiques basées sur l'expression d'une protéine fluorescente verte transgénique (GFP). Les lignées animales transgéniques exprimant le PFG sous des promoteurs distincts, spécifiques au type cellulaire, sont digérées pour enlever la cuticule externe et délicatement perturbées mécaniquement pour produire de la boue contenant divers types de cellules. Les cellules d'intérêt sont ensuite séparées des cellules non ciblées par le tri des cellules activées par la fluorescence, ou par des perles magnétiques couplées à l'anti-GFP. Les cellules isolées peuvent ensuite être cultivées pour un temps limité ou immédiatement utilisées pour des analyses ex vivo spécifiques à des cellules telles que l'analyse transcriptionnelle par PCR quantitatif en temps réel. Ainsi, ce protocole permet une analyse rapide et robuste des réponses spécifiques aux cellules au sein de différentes populations neuronales chez C. elegans.

Introduction

Au cours des dernières décennies, l'organisme modèle métazoaire Caenorhabditis elegans a été un atout énorme dans l'étude des neurones, des circuits neuronaux et de son rôle dans les réponses physiologiques et comportementales, et les neurodégénératifs associés au vieillissement Maladies. Une caractéristique unique de C. elegans est que les animaux sont transparents, permettant à la lignée de toutes les cellules somatiques adultes d'être cartographié¹. C. elegans abrite également une quantité gérable de neurones, conduisant à la morphologie et la connectivité du système nerveux étant bien compris². La lignée cellulaire invariante, la courte durée de vie et l'abondance d'outils génétiques à haut débit disponibles pour C. elegans en font un organisme modèle idéal pour l'étude du vieillissement au sein de différentes populations neuronales.

Le vieillissement des neurones et des troubles neurodégénératifs est complexe, et chaque trouble a des signatures pathologiques uniques qui lui sont associées. Cependant, pour beaucoup de ces désordres, tels que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer, une caractéristique commune est la charge progressive des protéines mal repliées^3,4,5. Dans ces deux maladies, les protéines se dissemblent et s'agrégent à l'intérieur de la cellule pour causer une toxicité, conduisant finalement à la mort cellulaire^4,5. Pour le vieillissement approprié des neurones, l'homéostasie des mitochondries, plus particulièrement l'homéostasie protéique, est importante, car les perturbations et la dyshomeostasie peuvent mener à la neurodégénérescence^6,7,8. Les cellules sont équipées de divers mécanismes pour maintenir l'homéostasie des protéines, l'un étant la réponse des protéines dépliée (UPR) - une voie classique où les signaux du réticulum endoplasmique (ER) activent des cascades de signaux intracellulaires, conduisant à une transcription réponse⁹. Semblable à cette ER^UPR, métazoaires montrent une réponse similaire à la perte de l'homéostasie de protéine mitochondriale, le soi-disant mitochondrial UPR (UPR^mt)^7,8. C. elegans semble être l'organisme le plus basal à avoir une voie confirmée et bien définie UPR^{mt 7}.

La fonction/dysfonctionnement de populations neuronales spécifiques au sein d'un réseau plus vaste peut être difficile à évaluer en raison de leur connectivité intrinsèque et de leur complexité³. Cependant, il est souvent nécessaire d'étudier des populations neuronales distinctes en raison de maladies spécifiques au type cellulaire avec des pathologies complexes, telles que celles associées à l'homéostasie des protéines cellulaires altérées. Chez C. elegans, des populations neuronales spécifiques peuvent être manipulées génétiquement permettant une observation facile in vivo. Le système nerveux de C. elegans se compose principalement de neurones, avec un petit pourcentage de cellules gliales. Chez les vers hermaphrodite adultes, il y a environ 302 neurones, subdivisés en plus de 100 classes différentes^2,10. Les neurones tels que les neurones cholinergiques prédominent dans les jonctions neuromusculaires, tandis que les neurones dopaminergiques sont principalement impliqués dans la sensation^10,11. Comme l'activité motrice et les capacités sensorielles diminuent avec l'âge, il est important de détailler les idées mécanistes sur les défauts dans ces neurones individuels^11,12. En tant que tel, il est nécessaire d'avoir une méthode simple et robuste pour isoler les cellules intactes d'intérêt pour les études ex vivo ultérieures.

Ici, nous décrivons une méthode efficace optimisée pour l'isolement rapide des cellules neuronales spécifiques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) de C. elegans. Cette méthode d'isolement peut être pratiquée sur les vers larvaires, juvéniles ou adultes. L'isolement des cellules des vers larvaires a été précédemment édité par Zhang et autres¹³ et ne sera pas discuté ici. Une note importante ici est que tous les vers doivent être au même stade de vie pour empêcher la surdigestion de l'animal ou la contamination des animaux à différents stades de la vie. Grâce à la perturbation enzymatique et mécanique de la cuticule nématode, un exosquelette riche en collagène et d'autres protéines structurelles, une grande variété de cellules peut être isolée^13,14. Les cellules peuvent ensuite être isolées par cytométrie du débit ou anticorps étiquetés perles magnétiques. Typiquement, l'ARN est isolé par l'intermédiaire d'une méthode d'isothiocyanate de phénol et de guanidine pour assurer l'enrichissement de la population cellulaire désirée^15. Avec beaucoup de soin ces cellules isolées peuvent être maintenues dans un flacon de culture ou un plat multi-bien. Cette méthode représente un outil unique et puissant dans l'étude de neurones spécifiques et a la capacité d'isoler les cellules vivantes et fonctionnelles pour la culture ultérieure.

Protocole

1. Préparation et collecte de vers âgés pour l'isolement cellulaire

REMARQUE: Expliqué ci-dessous est l'isolement des neurones cholinergiques de la souche transgénique unc-17::GFP (OH13083) obtenu à partir du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) dépôt de souches à l'Université du Minnesota. Il est impératif de maintenir des conditions stériles pour prévenir la contamination par les champignons ou les bactéries.

1. Préparer et synchroniser les vers par la méthode de blanchiment décrite par T. Stiernagle¹⁶. Pour les expériences sur le vieillissement, les vers de plaque sur les plaques du milieu de croissance des nématodes (NGM) contenant une solution d'eau de 25 millions de fluorodeoxyuridine (FuDR) pour réduire la production d'œufs et arrêter l'éclosion des œufs. Inspectez régulièrement les plaques d'agar pour éviter la contamination ou l'éclosion des œufs, car cela ne donnera pas de résultats fiables.
   REMARQUE : Pour les cellules unc-17::GFP, généralement trois plaques NGM de 100 mm x 15 mm sont utilisées pour isoler une quantité suffisante de cellules d'intérêt¹⁶.
2. Recueillir les vers et préparer des tampons pour l'isolement cellulaire.
   1. Recueillir les vers dans un tube conique de 15 ml. Laver les vers de l'assiette avec 1,5 mL de tampon M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO₄7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7,0) et centrifugeuse pendant 5 min à 1 600 x g. Jeter le supernatant et laver les vers avec 1 ml de tampon M9. Répéter la centrifugation et laver pendant un total de cinq fois pour éliminer autant de contamination par E. coli que possible.
      REMARQUE : L'ajout d'antibiotiques (50 g/mL), comme l'ampicilline, à cette étape peut aider à réduire la contamination bactérienne.
   2. Pour deux échantillons, préparer 2 mL de sulfate-dithiothreitol au dodecyl de sodium (SDS-DTT) tampon de lyse : 200 mM DTT, 0,25 % (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) et 3 % (w/v) sucrose.
   3. Préparer 15 ml de tampon d'isolement (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) et le stocker sur glace.
      REMARQUE : Le tampon de lyse SDS-DTT et le tampon d'isolement doivent être frais avant chaque expérience.
3. Perturbation des cuticules et isolement d'une seule cellule
   1. Centrifugeuses récoltées à l'étape 1,2,1 pendant 5 min à 1 600 x g. Retirer tous les supernatants et suspendre les vers dans 1 ml de m9 et transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
   2. Vers de pellet avec centrifugation à 1 600 x g pendant 5 min.
   3. Ajouter 200 l de tampon de lyse SDS-DTT aux vers et incuber pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Les vers doivent sembler être « clindi » le long du corps s'ils sont vus sous un microscope léger.
      REMARQUE : Une exposition prolongée à la lyse SDS-DTT peut entraîner la mort de vers, qui peuvent être surveillés en observant les vers. Les vers morts s'allongeront et ne s'enrouleront pas.
   4. Ajouter 800 l de tampon d'isolement glacé et mélanger en faisant glisser doucement le tube.
   5. Pellet vers pendant 1 min à 13.000 x g à 4 oC, enlever supernatant et laver avec 1 ml de tampon d'isolement.
   6. Répétez l'étape 1.3.5 pour un total de cinq fois, en supprimant soigneusement le tampon d'isolement à chaque fois.
   7. Ajouter 100 l de mélange de protéase de Streptomyces griseus (15 mg/mL) (Tableaudes matériaux)dissous dans un tampon d'isolement à la pastille et incuber pendant 10 à 15 min à RT.
      REMARQUE : Comme avec le tampon de lyse de SDS-DTT, la digestion prolongée de protéase peut avoir comme conséquence le clivage excessif des protéines le long de la membrane de plasma, empêchant l'isolement du GFP exposé à la surface par l'intermédiaire des perles magnétiques.
   8. Pendant l'incubation avec le mélange de protéase, appliquer la perturbation mécanique en tapotant des échantillons de haut en bas contre le fond du tube microcentrifuge de 1,5 ml avec une pointe de micropipette de 200 l pour 60 à 70 fois. Gardez la pointe de pipette contre la paroi du tube de microcentrifuge avec une pression constante pour dissocier correctement les cellules.
   9. Pour déterminer le stade de la digestion, retirez un petit volume (1 à 5 l) du mélange de digestion, déposez-le sur une lame de verre et inspectez-le à l'aide d'un microscope à culture tissulaire. Après 5 à 7 min d'incubation, les fragments de ver devraient avoir une cuticule visiblement réduite et une boue de cellules sera facilement visible.
   10. Halte à la réaction avec 900 ll de la pénicilline L-15 de Leibovitz disponible dans le commerce, complétée par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et de pénicilline-streptomycine (concentration finale à 50 U/mL de pénicilline et 50 og/mL de streptomycine).
   11. Pellet fragments et cellules isolés par centrifugation pendant 5 min à 10 000 x g à 4 oC. Laver les cellules granulées avec 1 ml de froid L-15-supplémenté de médias deux fois plus pour s'assurer que l'excès de débris et de cuticule est enlevé.
   12. Resuspendre les cellules granulées dans 1 ml de l'avant-né ltifié par L-15 et laisser sur la glace pendant 30 min. Aprendre la couche supérieure, d'environ 700 à 800 l, à un tube de microcentrifuge. Cette couche contient des cellules sans débris cellulaires et sera utilisée dans l'isolement ultérieur des cellules d'intérêt.
   13. En suivant les instructions du fabricant, utilisez un compteur cellulaire automatisé ou un hémocytomètre pour mesurer la densité cellulaire de 10 à 25 l l de cellules isolées.

2. Isolement des cellules GFP-positives par cytométrie d'écoulement ou perles magnétiques anti-GFP

REMARQUE : Il existe deux méthodes qui peuvent être déployées pour isoler des types de cellules spécifiques. La première méthode consiste à utiliser le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS), tandis que la deuxième méthode utilise des perles magnétiques conjuguées par anticorps pour mettre en commun les cellules exprimant des protéines localisées par membrane plasmatique distinctes. Cette dernière méthode nécessite la localisation du GFP à la membrane plasmatique, étant ainsi disponible pour l'interaction avec la perle magnétique couplée à l'anticorps.

1. Isolement des cellules GFP-positives par cytométrie de flux
   1. De la suspension cellulaire isolée recueillie à l'étape 1.3.12, les cellules centrifugeuses pendant 5 min à 10.000 x g à 4 oC. Jetez les supernatants et suspendez les cellules granulées dans le milieu complété par L-15 à une densité cellulaire d'au plus 6 x 10⁶ cellules/mL pour éviter de surcharger le cytomètre d'écoulement.
   2. Trier les cellules par expression GFP-positive à l'aide d'un cytomètre de flux capable de trier les échantillons. Les cellules gFP-négatives peuvent être utilisées comme contrôle pour l'analyse spécifique de type non cellulaire.
      REMARQUE : Comme mentionné ci-dessus, une approche alternative pour isoler les cellules GFP-positives peut être employée si la protéine GFP-étiquetée d'intérêt est localisée à la membrane plasmatique des cellules. Dans ce cas, le protocole décrit à la section 2.2 peut être utilisé.
2. Isolement des cellules GFP-positives par l'intermédiaire des perles magnétiques anti-GFP
   1. De la suspension cellulaire isolée recueillie à l'étape 1.3.12, les cellules centrifugeuses pendant 5 min à 10.000 x g à 4 oC. Jeter les supernatants et suspendre les cellules dans 485 lL de milieu complété par L-15. Ajouter 15 l de perles magnétiques ddH₂O prélavées à la solution.
   2. Incuber les cellules avec la boue de perles magnétiques à 4 oC pendant 1 h avec un virage très doux. Un retournement excessif endommagera les cellules.
   3. Après l'incubation, l'échantillon de centrifugeuse pendant 5 min à 10 000 x g à 4 oC, puis laver les granulés 2x avec 1 ml de milieu complété par L-15 pour enlever les cellules GFP-négatives.
3. La culture de cellules isolées
   1. Plaquer les cellules isolées dans une plaque stérile de 6 puits multi-puits.
      REMARQUE : Ces plaques peuvent être enduites de lectine d'arachide pour augmenter l'attachement de cellules ; cependant, si les cellules doivent être utilisées immédiatement, cette étape peut être ignorée.
   2. Placer la plaque dans un récipient en plastique et incuber les cellules à 20 oC avec une lingette humide ou du papier de soie mou (ajouter une ampicilline de 50 g/mL à la ddH₂O pour s'assurer qu'il n'y a pas de croissance bactérienne sur l'essuie-glace) pour ajouter de l'humidité aux cellules. Ne pas couver dans un incubateur de CO 2, car des niveaux élevés de CO₂ peuvent endommager les cellules.

3. Imagerie fluorescente de cellules gFP-positives isolées

1. Allumez l'ampoule fluorescente d'un microscope inversé avec l'attachement de fluorescence et laissez-la se réchauffer pendant environ 10 min.
2. Retirez la culture cellulaire de l'incubateur et installez-la sur scène du microscope inversé avec fixation de florescence. Faites glisser le filtre GFP dans les rainures sous le stade du microscope.
3. Voir les cellules avec un grossissement de 50x. Les cellules GFP-positives isolées avec succès seront facilement visibles. Prenez des photos à l'aide de la pièce jointe de l'appareil photo au microscope.

4. Extraction d'ARN à partir de cellules isolées

REMARQUE : L'extraction de l'ARN doit être effectuée immédiatement après l'isolement cellulaire afin d'assurer une qualité élevée du matériau. L'ARN isolé peut être utilisé pour produire l'ADNc et la mesure subséquente des niveaux de transcription par PCR quantitatif (qPCR). Tous les tubes, bouts et réactifs doivent être exempts de RNase, et l'espace de travail doit être lavé à l'éthanol avant l'extraction de l'ARN.

1. À partir de cellules isolées recueillies à l'étape 2.1.2, les cellules centrifugeuses dans un tube de microcentrifuge stérile de 1,5 ml et sans RNase pendant 5 min à 10 000 x g à 4 oC. Si les cellules sont isolées par des perles magnétiques, suivez la collecte cellulaire comme indiqué ci-dessus.
2. À l'aide d'une micropipette, retirer le supernatant du tube de microcentrifugement centrifugé et ajouter 100 l de m. M9 moyen pour laver le milieu complété par L-15. Centrifugeuses cellules 5 min à 10 000 x g à 4 oC et enlever le supernatant. Pour s'assurer que tous les supports sont enlevés, répétez pour un total de trois lavages soigneusement enlever supernatant à chaque fois.
3. Ajouter 1 mL de phénol et de guanidine solution isothiocyanate (Tableau des matériaux) aux cellules et pipette la suspension de haut en bas avec soin. Incuber le mélange à RT pendant 5 min.
4. Après l'incubation, ajouter 250 phénol et guanidine isothiocyanate solution
5. Centrifuger la solution pendant 5 min à 10 000 x g à 25 oC.
6. Retirez soigneusement autant de la couche aqueuse supérieure avec une micropipette que possible, sans déranger les couches organiques inférieures, et transférez la couche inférieure à un nouveau tube de microcentrifuge sans RNase de 1,5 mL. Dans le nouveau tube, ajouter 500 oL d'isopropanol et mélanger en inversant le tube. Incuber cette solution à RT pendant 5 min.
7. Centrifuger le tube à 14 000 x g pendant 20 min à 25 oC.
8. Tout en gardant les échantillons sur la glace, retirer autant d'isopropanol que possible avec une micropipette, et ajouter doucement 1 ml de 70% (v/v) d'éthanol dans le ddH₂O sans RNase dans le tube. Assurez-vous de ne pas éjecter la solution directement sur le fond du tube; appliquer du mélange d'éthanol/eau sur le côté du tube.
9. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min à 25 oC.
10. Retirer la majeure partie de l'éthanol et sécher à l'air sur la glace pendant 3 à 5 min.
    REMARQUE : L'éthanol doit être retiré après cette étape; cependant, une inspection minutieuse du fond du tube est importante pour s'assurer qu'il ne reste plus d'éthanol.
11. Une fois que le tube est séché à l'air, ajouter 15 à 20 l de ddH₂O sans RNase et mesurer la concentration et la pureté de l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm longueur d'onde. La pureté de l'échantillon doit être mesurée en un rapport de 260 nm/280 nm. Ce ratio devrait être d'environ 2 euros.
    REMARQUE : L'ARN isolé peut être congelé et stocké à -20 oC. Il est cependant très préférentiel d'utiliser un kit de synthèse de l'ADNc dès que possible pour assurer une production d'ADNc de haute qualité. Le PCR quantitatif peut suivre en utilisant les instructions fournies par le fabricant du thermocycleur utilisé en laboratoire.

Résultats

Le protocole décrit ici permet l'isolement spécifique des neurones cholinergiques unc-17::GFP-positifs du ver rond C. elegans pour des études ex vivo ultérieures telles que le profilage d'expression génique de type de cellule-spécifique et la culture à court terme pour les mesures d'électrophysiologie de patch-clamp.

La figure 1 montre des neurones cholinergiques non-17...

Discussion

Le ver rond C. elegans est un modèle bien établi et puissant pour étudier la santé neuronale et la maladie². Avec de nombreux outils génétiques pour manipuler ces animaux et une quantité gérable de différents types de neurones, beaucoup de données peuvent être recueillies avec une quantité relativement faible de matériel. Ici, nous dénoncons une méthode optimisée pour isoler les neurones distincts des animaux entiers. En perturbant les protéines cuticules externes du ver,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11