בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.

Abstract

במהלך תהליך ההזדקנות, תאים רבים מצטברים רמות גבוהות של נזק המוביל לתפקוד לקוי של הסלולר, אשר ביסוד הרבה מצבים גריאטרי ופתולוגי. הנוירונים פוסט-mitotic מייצגים סוג תא ראשי המושפע על ידי הזדקנות. למרות שדגמים מרובים של הזדקנות עצבית קיימים, הם מאתגרים ויקרים להקמת. האלגיה העגולה של התולעים העגולות היא מודל רב-עוצמה לחקר הזדקנות עצבית, מאחר שלחיות אלה יש תוחלת חיים קצרה, כתיבת כלים גנטית חזקה ומערכת עצבים מקוטלקת היטב. השיטה המוצגת בזאת מאפשרת בידוד חלק של תאים ספציפיים בהתבסס על הביטוי של חלבון פלורסנט ירוק טרנסגניים (GFP). קווי בעלי חיים טרנסגניים המבטא GFP תחת נבדל, סוג תא ספציפי היזמים מתעכלים כדי להסיר את הקוטיקולה החיצונית בעדינות שיבש מכני כדי לייצר שובלים המכילים סוגי תאים שונים. תאי העניין מופרדים לאחר מכן מתאים שאינם יעד באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות פלואורסצנטית, או באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-GFP בשילוב. התאים המבודדים לאחר מכן יכול להיות מתורבת לזמן מוגבל או באופן מיידי משמש לניתוח ספציפי לתא לשעבר vivo כגון ניתוח ההמרה על ידי PCR בזמן אמת כמותי. לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר ויציב של תגובות לתאים ספציפיים בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות בג.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, האורגניזם המודל החדש Caenorהאבודיטיס מודל היה נכס עצום בחקר הנוירונים, המעגלים העצביים ותפקידה בתגובות פיסיולוגיים והתנהגותיים, והזדקנות הקשורים נוירוניווניות חלות. התכונה הייחודית של הג היא שבעלי החיים שקופים, ומאפשרים שושלת היוחסין של כל התאים הסומאטיים הבוגרים להיות ממופים¹. ג. אלגיה מקיימת גם כמות של נוירונים, המובילה לתחום המבנה והקישוריות של מערכת העצבים שהבינה היטב². השושלת הקבועה של התאים, תוחלת החיים הקצרה והשפע של כלים גנטיים בתפוקה גבוהה הזמינות עבור C. אלגיה הופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההזדקנות בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות.

הזדקנות הנוירונים והפרעות ניווניות הן מורכבות, וכל הפרעה יש חתימות פתולוגיים ייחודי הקשורים בו. עם זאת, עבור רבים מהפרעות אלה, כגון מחלת פרקינסון ואלצהיימר, תכונה נפוצה היא העומס הפרוגרסיבי של חלבונים misfolded^3,4,5. בשתי מחלות אלה, חלבונים misfold לצבור בתוך התא כדי לגרום לרעילות, בסופו של דבר המוביל למוות התאים^4,5. עבור הזדקנות נאותה של נוירונים, הומאוסטזיס של המיטומטר, יותר במיוחד הומאוסטזיס חלבון, חשוב, כמו רטבאליות ו dyshomeoאוסטזיס יכול להוביל נוירוניוון^6,7,8. תאים מצוידים מנגנונים שונים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון, אחד להיות תגובת חלבון שפרש (upr) – מסלול קלאסי שבו אותות מן הרשתית רשתית פלזמית (ER) להפעיל אות תאיים מפלי, המוביל להמרה . תשובה^{9 לאור}זה, מטזואים להציג תגובה דומה אובדן של הומאוסטזיס חלבון מיטוכונדריאלי, המכונה כביכול upr (upr^mt)^7,8. ג. אלגיה נראה האורגניזם הבזלי ביותר להיות מאומת ומוגדר היטב מסלול^{הר 7}.

פונקציה/תפקוד של אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות בתוך רשת גדולה יותר יכול להיות קשה להעריך בשל הקישוריות הפנימית שלהם ואת המורכבות³. עם זאת, יש לעיתים קרובות צורך ללמוד אוכלוסיות עצביים נפרדות בשל סוג תא מחלות ספציפיות עם פתווגיות מורכבות, כמו אלה הקשורים עם לקויי חלבון הומאוסטזיס הסלולר. בתוך C. אלאנים, אוכלוסיות נוירואליות מסוימות יכולות להיות מניפולציות גנטית המאפשרות התבוננות נתיישב בvivo. מערכת העצבים של C. אלגיה מורכבת בעיקר מנוירונים, עם אחוז קטן של תאים גליאל. ב תולעים דו-מיניים למבוגרים, ישנם כ 302 נוירונים, מחולק למעל 100 כיתות שונות^2,10. נוירונים כגון cholinergic נוירונים להשתלט על הצמתים נוירוסקולריות, בעוד נוירונים דואמנרגיים מעורבים בעיקר תחושה^10,11. כאשר הן פעילות מוטורית והן יכולות חישה לירידה עם הגיל, חשוב לפרט תובנות מכניסטיות על פגמים בנוירונים בודדים אלה^11,12. ככזה, יש צורך בשיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד תאים שלמים של עניין למחקרים הבאים vivo ex.

כאן, אנו מתארים שיטה יעילה ממוטבת לבידוד מהיר של תאים עצביים ספציפיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מ -C. אלגיה. ניתן לבצע שיטת בידוד זו על תולעים, לקטינים או למבוגרים. בידוד של תאים מתולעי זחל פורסם בעבר על ידי ג'אנג ואח '¹³ ולא יידונו כאן. הערה חשובה כאן היא שכל התולעים צריכות להיות באותו שלב של החיים כדי למנוע העיכול של בעל החיים או זיהום מבעלי חיים בשלבי חיים שונים. באמצעות שיבושים אנזימטי ומכני של הקוטיקולה נמטודות, הגבוהה שלד חיצוני קולגן וחלבונים מבניים אחרים, מגוון רחב של תאים יכול להיות מבודד^13,14. תאים לאחר מכן יכול להיות מבודד באמצעות cy, הזרמת לנסות או נוגדנים המסומנים חרוזים מגנטיים. בדרך כלל, רנ א מבודד באמצעות פנול ו guanidine isothiyanate שיטה כדי להבטיח את העשרת האוכלוסיה הרצויה של התאים¹⁵. עם טיפול הרבה תאים אלה מבודדים ניתן לשמור בבקבוקון תרבות או מרובת היטב צלחת. שיטה זו מייצגת כלי ייחודי ורב עוצמה במחקר של נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים חיים פונקציונלי עבור culturing נוספת.

Protocol

1. הכנה ואיסוף של תולעים בגילאי לבידוד תאים

הערה: הסבר להלן הוא הבידוד של נוירונים cholinergic מן הטרנסגניים unc-17:: מאמץ GFP (OH13083) שהתקבלו מן המרכז הגנטי caenorהאבודיטיס (cgc) מאגר המתח באוניברסיטת מינסוטה. זה הכרחי לשמור על התנאים סטרילי כדי למנוע זיהום של פטריות או חיידקים.

1. הכינו וסנכרן תולעים דרך שיטת הלבנת כמתואר על ידי T. Stiernagle¹⁶. עבור ניסויים הזדקנות, לוחית תולעים על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות המכילות 25 μm פתרון מים של פלואורודיט (fudr) כדי להפחית את ייצור ביצים לעצור בקיעה ביצה. בדוק צלחות אגר באופן קבוע כדי למנוע זיהום או הבקיעה ביצה כמו זה יגרום תוצאות לא אמינות.
   הערה: עבור unc-17:: תאים gfp, בדרך כלל 3 100 mm x 15 מ"מ לוחות ngm משמשים כדי לבודד כמות מספקת של תאים של ריבית¹⁶.
2. איסוף תולעים והכנת מאגרים לבידוד תאים.
   1. לאסוף תולעים בצינור 15 מ ל חרוט. לשטוף תולעים מלוחית עם 1.5 mL של M9 מאגר (1 מ"מ MgSO₄, 85 Mm הנאקל, 42 mm Na₂hpo₄· 7H₂O, 22 מ"מ KH₂PO, pH 7.0) ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,600 x g. להיפטר supernatant ולשטוף תולעים עם 1 mL של מאגר M9. חזור על צנטריפוגה ולשטוף סך של חמש פעמים כדי להסיר את הזיהום E. coli ככל האפשר.
      הערה: הוספת אנטיביוטיקה (50 μg/mL), כגון אמפיצילין, בשלב זה יכול לעזור להפחית זיהום חיידקי.
   2. עבור שני דגימות, להכין 2 מ ל נתרן dodecyl סולפט dithiopol (SDS-DTT) מאגר לליזה: 200 mM DTT, 0.25% (w/v) SDS, 20 מ"מ HEPES (pH 8.0), ו 3% (w/v) סוכרוז.
   3. הכינו 15 מ ל של מאגר בידוד (118 מ"מ, 48 mM KCl, 2 מ"מ CaCl₂, 2 מ"מ MgCl₂, 25 מ"מ hepes [pH 7.3]) ולאחסן אותו על הקרח.
      הערה: מאגר הפירוק ומאגר הבידוד של ה-SDS-DTT חייבים להיות טריים לפני כל ניסוי.
3. הפרעה לקוטיקולה ובידוד תא בודד
   1. בעלי חיים צנטריפוגה שנאספו בשלב 1.2.1 עבור 5 דקות ב 1,600 x g. הסר את כל supernatant ולהשעות תולעים ב 1 מ ל של M9 מדיה ולהעביר לצינור 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
   2. כדור גלולה תולעים עם צנטריפוגה ב 1,600 x g עבור 5 דקות.
   3. הוסף 200 μL של מאגר הליזה SDS-DTT לתולעים ו-דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תולעים צריך להיראות "winkled" לאורך הגוף אם מוצג תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: חשיפה ממושכת למאגר הליזה SDS-DTT עלולה לגרום למותם של תולעים, שניתן לנטר על-ידי התבוננות בתולעים. תולעים כי הם מתים יהיה האריך ולא תלתל.
   4. הוסף 800 μL של מאגר בידוד קר קרח ולערבב על ידי בעדינות מצליף צינור.
   5. התולעים גלולה עבור 1 דקות ב 13,000 x g ב 4 ° c, להסיר supernatant ולשטוף עם 1 מ ל של מאגר בידוד.
   6. חזור על שלב 1.3.5 למשך חמש פעמים, והסיר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם.
   7. הוסף 100 μL של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus (15 מ"ג/mL) (טבלה של חומרים) הומס בידוד לתוך הגלולה ואת הדגירה עבור 10 עד 15 דקות ב RT.
      הערה: כמו עם מאגר הליזה SDS-DTT, עיכול הפרוטאז המורחבת עלול לגרום למחשוף מוגזם של חלבונים לאורך קרום הפלזמה, מניעת בידוד של פני השטח החשופים של GFP באמצעות חרוזים מגנטיים.
   8. במהלך הדגירה עם תערובת פרוטאז, להחיל שיבוש מכני על ידי ליטוף דגימות למעלה ולמטה נגד החלק התחתון של שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL עם טיפ 200 μL מיקרופיפטה עבור ~ 60 ל-70 פעמים. שמור את העצה הפיפטה נגד הקיר של שפופרת המיקרוצנטריפוגה עם לחץ תמידי כדי לנתק כראוי את התאים.
   9. כדי לקבוע את השלב של עיכול, להסיר נפח קטן (~ 1-5 μL) של תערובת העיכול, לזרוק אותו על שקופית זכוכית ולבדוק את זה באמצעות מיקרוסקופ תרבות רקמה. אחרי 5-7 דקות של דגירה, שברי התולעת צריך להפחית את הקוטיקולה בעליל ואת שאיפה של תאים יהיה גלוי בקלות.
   10. לעצור את התגובה עם 900 μL של מסחרית זמין L-15 בינוני ליבוביץ ' s בתוספת 10% העובר סרום (FBS) ו פניצילין-סטרפטומיצין (הריכוז הסופי ב-50 U/mL פניצילין 50 μg/mL סטרפטומיצין).
   11. גלולה חלקים מבודדים ותאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. לשטוף את התאים מפלטד עם 1 מ ל של מדיה קר L-15-בתוספת יותר פעמיים כדי להבטיח כי פסולת עודף וקוטיקולה יוסר.
   12. השהה מחדש תאים מסוימים ב-1 מ ל של L-15-מדיה שיושלם ולעזוב על הקרח 30 דקות. קח את השכבה העליונה, כ 700-כ 800 μL, לצינור מיקרוצנטריפוגה. שכבה זו מכילה תאים ללא פסולת תא וישמשו בבידוד של תאים מעניינים בהמשך.
   13. לאחר הוראות היצרן, השתמש במונה תאים אוטומטיים או בהימוציטומטר כדי למדוד את צפיפות התא של 10 עד 25 μL של תאים מבודדים.

2. בידוד תאים של GFP-חיוביים באמצעות הזרמת cy, או חרוזים מגנטיים anti-GFP

הערה: קיימות שתי שיטות שניתן לפרוס כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים. השיטה הראשונה היא להשתמש במיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS), בעוד השיטה השנייה משתמשת נוגדן מעלה חרוזים מגנטיים לתאי הבריכה ביטוי בונה פלזמה קרום מקומי החלבונים. השיטה האחרונה מחייבת את הלוקליזציה של GFP על קרום פלזמה, ובכך להיות זמין לאינטראקציה עם הנוגדן מצמידים חרוז מגנטי.

1. בידוד של תאים של GFP-חיוביים על ידי הזרמת cy,
   1. מתוך השעיית תא מבודד שנאסף בשלב 1.3.12, תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות תאים מסוימים ב-L-15-בינוני בינונית לצפיפות התא של לא יותר מ 6 x 10⁶ תאים/mL כדי למנוע העמסת יתר של הזרימה cytometer.
   2. מיין תאים על-ידי ביטוי של GFP-חיוביים באמצעות cytometer זרימה המסוגל למיין דגימות. ניתן להשתמש בתאים GFP-שליליים כפקד עבור ניתוח ספציפי של סוג שאינו של תא.
      הערה: כפי שהוזכר לעיל, גישה חלופית לבידוד תאים GFP-חיוביים ניתן להשתמש אם החלבון GFP-מתויג של עניין מקומי לקרום פלזמה של התאים. במקרה זה, הפרוטוקול המתואר בסעיף 2.2 יכול להיות מועסק.
2. בידוד תאים של GFP-חיוביים באמצעות חרוזי אנטי-GFP מגנטיים
   1. מתוך השעיית תא מבודד שנאסף בשלב 1.3.12, תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. למחוק supernatant ולהשעות תאים ב 485 μL של L-15-בינוני מדיום. הוסף 15 μL של ddH₂O שטוף מראש α-gfp נוגדן מצמידים חרוזים מגנטיים לפתרון.
   2. התאים המגנטית עם החרוז מגנטי להשתהות ב 4 ° צ' עבור 1 h עם מפנה עדין מאוד . הפעלה מוגזמת תגרום נזק לתאים.
   3. לאחר דגירה, מדגם צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c, ולאחר מכן לשטוף את הגלולה 2x עם 1 מ ל של L-15-בינוני כדי להסיר תאים gfp-שליליים.
3. הדים של תאים מבודדים
   1. הצלחת תאים מבודדים לתוך לוחית סטרילית 6-היטב מולטי.
      הערה: לוחיות אלה עשויות להיות מצופות באמצעות בוטנים לקטין כדי להגדיל את הקובץ המצורף לתא; עם זאת, אם יש להשתמש בתאים באופן מיידי, שלב זה עשוי להיות התעלמו.
   2. מניחים את הצלחת לתוך מיכל פלסטיק ותאי דגירה ב 20 ° c עם מחיקה לח או נייר רקמה רכה (להוסיף 50 μg/mL אמפיצילין כדי ddH₂O כדי להבטיח שום גידול חיידקי על לנגב) כדי להוסיף לחות לתאים. אין להרוס בחממה₂ שכונתיות, כמו co₂ רמות מוגבה עלול לפגוע בתאים.

3. הדמיה פלואורסצנט של תאים מבודדים של GFP-חיוביים

1. הפעל את הנורה פלורסנט של מיקרוסקופ הפוך עם החזקה הפלואורסצנטית ולאפשר לו להתחמם במשך כ 10 דקות.
2. הסרת תרבות התא מהאינקובטור והגדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך עם החזקה מלאה. החלק את המסנן GFP לתוך החריצים מתחת לשלב המיקרוסקופ.
3. הצג את התאים בהגדלה של 50x. תאים מבודדים בהצלחה GFP-חיוביים יהיה גלוי בקלות. צלם תמונות באמצעות המצלמה המצורפים למיקרוסקופ.

4. הפקת רנ א מתאים מבודדים

הערה: החילוץ של RNA צריך להתבצע מיד לאחר בידוד התא כדי להבטיח איכות גבוהה של חומר. בודד RNA ניתן להשתמש כדי לייצר cDNA והמדידה הבאה של רמות תעתיק על ידי PCR כמותי (qPCR). כל הצינורות, טיפים, וריאגנטים צריך להיות RNase-חינם, ומרחב העבודה צריך להיות אתנול משטף לפני החילוץ RNA.

1. מתאים מבודדים שנאספו בשלב 2.1.2, בתאי צנטריפוגה ב 1.5 mL סטרילי, RNase-מיקרוצנטריפוגה חינם tubefor 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. אם התאים מבודדים באמצעות חרוזים מגנטיים, עקוב אחר אוסף התאים כאמור לעיל.
2. באמצעות מיקרופיפטה, להסיר supernatant מצינור centrifuged מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 100 μL של M9 בינונית כדי לשטוף את L-15-בינוני. התאים צנטריפוגה 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c ולהסיר supernatant. כדי להבטיח את כל המדיה יוסרו, חזור על סך של שלוש שוטף בזהירות הסרת supernatant בכל פעם.
3. הוסף 1 מ ל של פנול ו guanidine isothiocyanate פתרון (לוח חומרים) לתאים ופיפטה ההשעיה מעלה ומטה בזהירות. מודקון את התערובת ב RT עבור 5 דקות.
4. לאחר הדגירה, להוסיף 250 פנול ו guanidine isothiyanate פתרון
5. צנטריפוגה את הפתרון עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב -25 ° c.
6. בזהירות להסיר את החלק העליון של השכבה מימית עם מיקרופיפטה ככל האפשר, מבלי להפריע השכבות האורגניות התחתונות, ולהעביר את השכבה התחתונה לצינור חדש 1.5 mL RNase-מיקרוצנטריפוגה חינם. לצינור החדש, להוסיף 500 μL של איזופנול ולערבב על ידי היפוך הצינור. דגירה הפתרון הזה ב RT עבור 5 דקות.
7. צנטריפוגה את הצינור ב 14,000 x g עבור 20 דקות ב 25 ° c.
8. בעוד שמירה על הדגימות על קרח, להסיר כמו הרבה יותר איזופנול ככל האפשר עם מיקרופיפטה, ולהוסיף בעדינות 1 mL של 70% (v/v) אתנול ב RNase-חינם ddH₂O לתוך השפופרת. הקפד לא להוציא את הפתרון ישירות על החלק התחתון של הצינור; להחיל תערובת אתנול/מים לצד הצינור.
9. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ב 25 ° c.
10. להסיר את רוב האתנול והאוויר יבש על הקרח עבור 3-5 דקות.
    הערה: יש להסיר את האתנול לאחר שלב זה; עם זאת, בדיקה זהירה של התחתון של הצינור חשוב כדי להבטיח שום אתנול לא נשאר.
11. לאחר הצינור הוא מיובש באוויר, להוסיף 15 של20 μL של RNase-חינם ddH₂O ולמדוד ריכוז RNA וטוהר באמצעות ספקטרוסקופיה ב 260 ננומטר גל. את טוהר המדגם יש למדוד כיחס 260 ננומטר/280 ננומטר. יחס זה אמור להיות בקירוב > 2.
    הערה: RNA מבודד יכול להיות קפוא ומאוחסן ב-20 ° c. זה, עם זאת, מועדף מאוד להשתמש ערכת סינתזה cDNA בהקדם האפשרי כדי להבטיח ייצור cDNA באיכות גבוהה. ה-PCR הכמותי יכול לעקוב אחר הוראות שסופקו על ידי יצרן הציקלהטרטרנר המשמש במעבדה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בידוד ספציפי של unc-17:: gfp-חיוביות cholinergic הנוירונים מתוך C. אלגיה עבור מחקרים עתידיים לשעבר vivo כגון סוג תא ספציפי ביטוי גנים פרופיל ובסופו של דבר למידה קצרת-טווח למדידות מהדק-אלקטרופיזיולוגיה.

...

Discussion

מודל התולעים העגולות הוא דגם מבוסס ועוצמתי לחקר בריאות ומחלות עצביים². עם כלים גנטיים בשפע כדי לתמרן בעלי חיים אלה וכמות לניהול של סוגים שונים של נוירונים ממופה בדיוק, מידע רב ניתן לאסוף עם כמות קטנה יחסית של חומר. כאן, אנו מתווה שיטה ממוטבת כדי לבודד נוירונים שונים מחיות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11