Un modelo de cultivo de órgano endotelial Corneal porcino usando botones de córnea divididos

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la preparación y el cultivo de botones corneales divididos porcinos. Como este modelo de cultivo de órganos típicamente cultivado organomuestra tasas de mortalidad celular en un plazo de 15 días, comparables a las córneas de donantes humanos, representa el primer modelo que permite el cultivo a largo plazo de córneas no humanas sin añadir dextran tóxico.

Resumen

La investigación experimental en células endoteliales corneales se asocia con varias dificultades. Las córneas de donantes humanos son escasas y rara vez están disponibles para investigaciones experimentales, ya que normalmente se necesitan para el trasplante. Los cultivos celulares endoteliales a menudo no se traducen bien a situaciones in vivo. Debido a las características bioestructurales de las córneas no humanas, la hinchazón estromal durante el cultivo induce una pérdida sustancial de células endoteliales corneales, lo que dificulta la realización del cultivo durante un largo período de tiempo. Los agentes de hinchazón, como el deextran, se utilizan para contrarrestar esta respuesta. Sin embargo, también causan pérdida significativa de células endoteliales. Por lo tanto, se estableció un modelo de cultivo de órganoex vivo que no requería agentes de salzados. Los ojos de cerdo de un matadero local se utilizaron para preparar botones de córnea divididos. Después de la trephinación corneal parcial, se eliminaron las capas externas de la córnea (epitelio, capa de arco, partes del estroma). Esto reduce significativamente la pérdida de células endoteliales corneales inducida por la hinchazón estromal masiva y el plegado de membrana de Descemet durante períodos de cultivo más largos y mejora la preservación general de la capa celular endotelial. La posterior trephinación corneal completa fue seguida por la eliminación del botón corneal dividido del bulbo ocular restante y el cultivo. La densidad de las células endoteliales se evaluó en momentos de seguimiento de hasta 15 días después de la preparación (es decir, los días 1, 8, 15) utilizando microscopía ligera. La técnica de preparación utilizada permite una mejor preservación de la capa celular endotelial habilitada por una menor hinchazón del tejido estromal, lo que resulta en tasas de disminución lentas y lineales en los botones de la córnea dividida comparables a las córneas de donantes humanos. Como este modelo de investigación organo-típicamente cultivado estandarizado por primera vez permite un cultivo estable durante al menos dos semanas, es una alternativa valiosa a las córneas de donantes humanos para futuras investigaciones de diversos factores externos con respecto a sus efectos sobre el endotelio corneal.

Introducción

Los procedimientos de trasplante de córnea se encuentran entre los trasplantes más comúnmente realizados en todo el mundo¹. Como hay una grave escasez de córneas de donantes humanos, la investigación experimental que aborda las células endoteliales corneales en las córneas humanas es difícil de realizar¹. Sin embargo, la introducción de soluciones de riego y otras sustancias utilizadas en el ojo, dispositivos viscoelásticos oftálmicos, así como instrumentos y técnicas quirúrgicas (por ejemplo, instrumentos y técnicas de facoemulsificación, energía de ultrasonido) requiere investigaciones válidas y extensas sobre sus efectos en el endotelio corneal antes del uso clínico.

Existen pocas alternativas a las córneas de donantes humanos para la investigación. Los modelos de investigación animal son muy valiosos, pero al mismo tiempo muy consumidos en los recursos y cada vez más cuestionados éticamente. Un inconveniente importante de los cultivos celulares in vitro es su traducción limitada al ojo humano. Los resultados obtenidos de los cultivos celulares pueden ser incongruentes a condiciones in vivo, porque las células pueden someterse a una transición mesenquimal endotelial (EMT), lo que resulta en morfología similar a un fibroblasto causado por la pérdida de polaridad celular y cambios en la forma celular y el gen expresión².

Mientras que los modelos ex vivo anteriores reportaron períodos de cultivo de hasta 120 h,^{recientemente} se ^{introdujo una novedosa técnica de preparación para establecer un modelo de cultivo de órganos endoteliales corneales porcinos mediante el cultivo de córneas frescas de cerdo durante al menos 15 días ,4,5,6}. Si el epitelio corneal y partes del estroma se retiran (aproximadamente 300 m en total) de la córnea antes del cultivo, la hinchazón del estroma se reduce en botones corneales divididos, lo que resulta en una menor pérdida de células endoteliales y una capa celular después de hasta 15 días, mientras que los botones corneales no divididos muestran una pérdida significativa de células endoteliales debido a la hinchazón estromal desigual y la formación de los pliegues de Descemet. Los bancos oculares generalmente usan agentes deshinchados osmóticos como la despolvación para reducir la hinchazón de las córneas antes del trasplante. Sin embargo, se demostró que estos agentes inducen un aumento de la pérdida de células endoteliales^7,8,9.

Este artículo tiene como objetivo visualizar este modelo de investigación ex vivo estandarizado en un protocolo detallado paso a paso con el fin de permitir a los futuros investigadores realizar investigaciones sobre el endotelio corneal utilizando botones de córnea divididos. Este modelo representa un método sencillo para probar sustancias y técnicas utilizadas dentro del ojo, como dispositivos viscoelásticos oftálmicos, soluciones de riego y energía de ultrasonido, u otros procedimientos donde el endotelio corneal es de interés.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas éticas de nuestra institución. De acuerdo con los estatutos del comité de revisión ética de nuestra institución no se tuvo que obtener ninguna aprobación ética antes de los experimentos, ya que todas las córneas porcinas se obtuvieron del matadero local.

1. Cultivo de órganos

1. Prepara los ojos de cerdo.
   1. Del matadero local, obtener ojos de cerdo que fueron retirados poco después de la autopsia, pero antes del tratamiento térmico. Transporte los ojos al laboratorio y procéselos en unas pocas horas. Durante el transporte, mantenga los ojos a temperatura ambiente (aproximadamente 21 oC) antes de su procesamiento.
   2. Retire todos los adnexes orbitales (músculos oculares, conjuntiva, tejido adiposo) antes de la desinfección utilizando tijeras oculares y fórceps colibri. Separe y deseche todos los ojos con traumatismos obvios, daños externos (por ejemplo, corte de cuchillo) o opacidades corneales visibles.
   3. Preparar una solución de yodo-PBS al 5% (1:20) en una taza estéril añadiendo 3 ml de yodo de povidona al 7,5% a 57 ml de una solución salina con búfer de fosfato (PBS). También prepare una taza estéril separada que contenga 60 ml de PBS puro.
      NOTA: La cantidad total de solución de yodo-PBS usada y el tamaño de la taza depende del número de córneas que se van a diseccionar. Cinco a seis ojos requieren aproximadamente 60 ml de la solución de 5%-yodo-PBS para ser desinfectado correctamente.
   4. Ponga de cinco a seis ojos en la solución de 5% yodo-PBS durante un total de 5 minutos para desinfectar correctamente la superficie de los ojos. Revuelva con cuidado cada minuto para asegurarse de que la superficie de los ojos esté completamente sumergida y desinfectada completamente en la solución de yodo.
   5. Después de 5 min, transfiera los ojos desinfectados a la taza preparada llena de PBS puro. Una vez más, revuelva cuidadosamente para asegurarse de que la solución de yodo-PBS se lave lejos de la superficie de los ojos.
      NOTA: Realice este paso en un banco limpio para evitar la contaminación de los ojos desinfectados.
2. Prepare placas de cultivo celular.
   NOTA: Realice los siguientes pasos en un banco limpio con flujo de aire laminar constante.
   1. Descongelar 2 ml de suero fetal de ternero (FCS). Llene una jeringa (5 ml) con el FCS usando una cánula contundente. Vacíe la jeringa a través de un filtro de jeringa (0,22 m) para evitar la posible contaminación bacteriana del FCS en 80 ml de medio de cultivo libre de descamas I (medio esencial mínimo [MEM] con sales de Earle, penicilina/estreptomicina, L-glutamina [200 mM], anfotericina B [250 g/ml], tampón hepes [1 M] [50x], NaHCO₃y agua destilada). Agitar la mezcla para asegurar una distribución uniforme del sustrato.
   2. Llene cada pocal de una placa de cultivo celular de 12 pocillos con 3 ml de la mezcla de sustrato.
3. Realizar disección e incubación.
   NOTA: Realice este paso en un banco limpio. No toque el endotelio corneal con ningún instrumento.
   1. Transfiera una bombilla ocular de la copa con PBS al soporte del bulbo ocular con la córnea hacia arriba y colóquela debajo de un microscopio quirúrgico oftalmológico. Utilice una jeringa llena de NaCl al 0,9% para aplicar ligeramente algo de succión al ojo sobre el soporte del bulbo ocular para fijar el ojo en posición de disección.
   2. Utilice un trephine (7,5 mm) que contenga una inserción estandarizada, que garantice que la profundidad trephined no excederá los 300 m, para cortar superficialmente en la córnea central(Figura 1A).
   3. Utilice fórceps colibri y un bisturí de un solo uso con una cuchilla triangular para cortar y eliminar la parte parcialmente trephined de la córnea horizontalmente a través del estroma. Deseche la parte corneal separada que consiste en el epitelio corneal, la capa de arco y una parte del estroma.
      NOTA: Mantenga estrictamente la dirección de corte horizontal para obtener un grosor uniforme del estroma restante.
   4. Coloque superficialmente una sutura 10-0 (10-0 poliamida 6) en el estroma para poder diferenciar el endotelial del lado estromal durante los experimentos(Figura 1B). Evitar la penetración del endotelio corneal. Deseche el bulbo ocular si se penetra el endotelio.
      NOTA: La penetración del endotelio corneal con la aguja sutura será visible, ya que el líquido de la cámara ocular anterior se filtrará a través del canal de sutura.
   5. Utilice la trephine sin la inserción para avanzar el corte trephined a profundidad completa hasta que se alcance la cámara ocular anterior(Figura 1C). Una caída distinta en la resistencia y la fuga de líquido de la cámara ocular anterior se puede percibir después de la penetración completa de la córnea.
      NOTA: Utilice un cuchillo de hockey si el botón de córnea dividido permanece unido en un lado del botón de córnea dividido después de la trephinación.
   6. Transferir el botón corneal dividido obtenido, que ahora consiste en una parte del estroma(Figura 2), la membrana del Descemet, y el endotelio corneal, en el medio de cultivo (medio de cultivo I + FCS, ver sección 1.2) en la placa de cultivo celular de 12 pocillos con el lado etiquetado mirando hacia abajo, de modo que el endotelio corneal está mirando hacia arriba.
      NOTA: Si el lado endotelial está mirando hacia abajo, el endotelio puede dañarse.
   7. Asigne un número individual a cada botón de córnea dividido para su identificación durante los seguimientos y etiquete los pozos en la placa de cultivo celular en consecuencia.
   8. Incubar las placas de cultivo celular rellenas en una incubadora en condiciones estándar a una temperatura de 37 oC, 5% CO₂ y una humedad relativa del aire del 95%. Cambiar el medio de cultivo (medio de cultivo I + FCS) el día 8 si se supera un período de incubación de 7 días.
      NOTA: El procedimiento de incubación mediante botones de córnea divididos se ha validado durante un máximo de 15 días.

Figura 1: Disección de la córnea porcina para obtener botones corneales divididos. (A) Después de la trephinación de la córnea utilizando un trephine con una inserción para cortar en una profundidad de 300 m y la extirpación del epitelio y partes del tejido estromal, (B) una sutura se coloca superficialmente en el estroma sin penetración de la córnea endotelio para la identificación posterior del lado estromal. (C) La trephinación completa de la córnea restante va seguida de (D) la eliminación del botón corneal dividido obtenido del bulbo ocular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Microscopía y examen del endotelio

1. Realizar un examen sin mancha.
   NOTA: El examen no manchado se puede realizar varias veces (por ejemplo, en seguimientos semanales los días 1, 8 y 15). Sin embargo, el conteo sin mancha solo permite la evaluación de la densidad de las células endoteliales, no de los parámetros morfológicos.
   1. Llenar 3 ml de solución salina equilibrada hipotónica (hBSS, ver composición en Tabla de Materiales)en cada pozo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Coloque cuidadosamente un solo botón corneal dividido en hBSS para inducir la hinchazón de las células endoteliales corneales y mejorar la visibilidad de las células para el recuento celular.
      NOTA: Asegúrese de que el lado endotelial esté orientado hacia la dirección del microscopio. Si se utiliza un microscopio de contraste de fase invertido, el lado endotelial debe estar orientado hacia abajo. Mientras esté en su lugar, la placa de cultivo no debe moverse para evitar daños en las células endoteliales.
   2. Deje que las células se hinchen durante 1-2 minutos antes de tomar una foto del endotelio con la cámara conectada al microscopio. Tomar al menos tres fotografías de al menos tres áreas diferentes para obtener una impresión representativa del estado real del endotelio corneal. Agregue una barra de escala con la longitud de escala verdadera a escala de 100 m para un análisis posterior de la densidad de células endoteliales corneales y los parámetros morfológicos.
   3. Para evitar daños osmóticos, retire el botón de córnea dividido del hBSS después de un máximo de 5 min y transfiéralo de nuevo al medio de cultivo³.
2. Realizar un examen manchado.
   NOTA: La tinción termina los experimentos, ya que las sustancias de tinción utilizadas son citotóxicas. Por lo tanto, la tinción sólo puede realizarse al final del período de observación para la evaluación de parámetros morfológicos (figuras de reforma, formaciones de roseta, células teñidas rojas de alizarina).
   1. Preparar una solución azul de trypan al 0,25% y una solución S de alizarina de alizarina al0,2% para el procedimiento de tinción.
      1. Para la solución de color azul trypan del 0,25%, diluya la solución azul trypan al 0,4% con una solución de NaCl al 0,9%.
         NOTA: Por ejemplo, para obtener 20 ml de una solución azul trypan al 0,25%, diluir 12,5 ml de la solución azul trypan al 0,4% con 7,5 ml de la solución NaCl al 0,9%. La solución azul trypan puede almacenarse a temperatura ambiente durante varias semanas o meses.
      2. Para obtener una solución S roja de alizarina del 0,2% disolver 100 mg del polvo rojo de alizarina S en 50 ml de una solución de NaCl al 0,9% bajo agitación y calentamiento constantes a 50 oC en una placa de agitación imán con función de calentamiento. Para eliminar posibles precipitados, filtre la solución obtenida. Ajustar el pH de la solución sión roja de alizarina S a pH 4.2 añadiendo hidróxido de sodio o ácido clorhídrico en consecuencia.
         NOTA: Antes de cada aplicación de la solución S roja de alizarin, asegúrese de que el pH se corrige a 4.2 y que no hay precipitados en la solución. La solución puede almacenarse a temperatura ambiente. No almacene la solución durante más de 4 semanas.
   2. Coloque los botones corneales divididos en los platos de Petri con el lado endotelial hacia arriba para manchar las células endoteliales. Utilice una pipeta para gotear lentamente la solución azul de trypan del 0,25% gota a gota sobre el endotelio corneal durante 90 s.
      NOTA: El azul Trypan permite identificar las células corneales dañadas con una membrana permeable porque mancha sus núcleos.
   3. Enjuague cuidadosamente el botón de córnea dividido 3veces en 0.9% NaCl en un vaso de precipitados pequeño. Una vez más, utilice una pipeta para gotear lentamente la solución S roja de alizarina del 0,2% gota a gota sobre el endotelio corneal durante 90 s.
      NOTA: Alizarin rojo S mancha la membrana del Descemet, que ayuda a resaltar los bordes celulares en células endoteliales corneales no dañadas y a resaltar las células destruidas cuando la membrana subyacente de Descemet se hace visible. Además, permite identificar fácilmente áreas destruidas más grandes.
   4. Para el examen del endotelio corneal manchado siga los pasos explicados para el recuento sin mancha en la sección 2.1.

3. Análisis de la densidad de células endoteliales corneales y parámetros morfológicos

1. El recuento de proyectos se cuadra en las imágenes utilizando un software de edición de gráficos(Tabla de materiales).
   1. Abra el software y abra una imagen del endotelio corneal seleccionando Archivo . Abiertos ? Seleccione.
   2. Proyecte un cuadrado con una longitud lateral verdadera a la escala de 100 m en la imagen.
      NOTA: Los siguientes pasos de la sección 3.1.2 pueden ignorarse si el software de visualización permite proyectar los cuadrados de conteo en la imagen. La longitud lateral del cuadrado depende de la resolución de las imágenes tomadas con la cámara del microscopio y se puede calcular con la barra de escala.
      1. Recortar la barra de escala de la fotografía tomada con el microscopio: seleccione la Herramienta Marco Rectangular en la barra de herramientas o presione M, luego bordee la barra de escala, luego seleccione Editar . Recortar o pulse Ctrl + X.
      2. Haga clic en Archivo (File) ? Nuevo (o pulse Ctrl + N). En la próxima ventana, seleccione Portapapeles en la lista desplegable Tipo de documento. El número de píxeles que se muestra nales es la longitud lateral del cuadrado de recuento. Anote los píxeles correspondientes para las otras imágenes y haga clic en Aceptar.
      3. Seleccione Archivo (File) ) Nuevo (o Ctrl + N). Inserte el ancho y la longitud (en píxeles) del cuadrado de recuento en la próxima ventana según la longitud de la barra de escala. Seleccione el color de fondo Blancoy, a continuación, pulse OK.
      4. Haga clic en Seleccionar (Seleccionar) Seleccione todo (o Ctrl + A). Seleccione Editar (Editar) Copiar (o Ctrl + C).
      5. Seleccione la imagen del endotelio corneal abierto en el paso 3.1.1. Seleccione Editar (Editar) Pegue (o Ctrl + V) para insertar el cuadrado en la foto del endotelio corneal.
      6. Seleccione la capa del cuadrado y ajuste la transparencia. Seleccione Capa (Capa) Estilo de capa ? Opciones de Fusión (Blending Options) Establezca Opacidad en 30% OK.
      7. Guarde la imagen con el cuadrado proyectado con una longitud lateral verdadera a la escala de 100 m. Repita con las otras imágenes necesarias para el análisis.
2. Evaluar la densidad celular endotelial y los parámetros morfológicos.
   1. Abra las imágenes con los cuadrados proyectados en ImageJ (Versión 1.50i) y utilice el complemento CellCounter para contar las celdas dentro del cuadrado. Abra ImageJ, seleccione Archivo ? Abrir (o Ctrl + O) ? Seleccione Imagen.
      NOTA: ImageJ y el complemento CellCounter son freeware disponibles para su descarga en línea.
   2. Seleccione Plugins (Plugins) Cell_Counter (Contador de celdas) Contador de celdas ? Inicializar. Cuente las células endoteliales y registre el resultado. En dos lados del cuadrado, cuente las celdas que se cortan por el borde del cuadrado. No cuente las células cortadas en los otros dos lados.
   3. Analizar al menos seis cuadrados por córnea de diferentes áreas (por ejemplo, tres imágenes, dos cuadrados por imagen) y determinar la densidad media de células endoteliales corneales por cuadrado (100 m²). Extrapolar la densidad celular endotelial por 100 m² a 1 mm² multiplicando por 100.
3. Para la evaluación de los cambios morfológicos, cuente las cifras de reforma (reunión conjunta de células de 4 celdas/bordes celulares en lugar de tres), formaciones de rosetas (apariencia característica en forma de roseta, cinco o más células dispuestas radialmente que rodean una célula destruida ), o áreas rojas de alizarina (células destruidas) en los cuadrados proyectados.
   NOTA: Alternativamente, puede ser útil utilizar cuadrados más grandes (por ejemplo, 200 x 200 m²) para el análisis morfológico en muestras bien conservadas para obtener resultados más representativos.

Resultados

La técnica de disección presentada implica la eliminación parcial del tejido estromal, lo que resulta en una muestra de córnea más delgada y, por lo tanto, menos hinchazón estromal(Figura 1 y Figura 2). Menos hinchazón estromas induce menos fuerzas de cizallamiento y pellizcar que tienen un impacto negativo en el endotelio corneal, causando así menores tasas de pérdida de células endoteliales⁶. L...

Discusión

Este protocolo proporciona un método para la preparación de botones corneales divididos porcinos, que representa un modelo de cultivo de órgano sendotial endotelial endotelial ex vivo estandarizado y de bajo costo para fines de investigación^6. Los botones corneales divididos porcinos mostraron una disminución de la densidad celular endotelial comparable a las pérdidas de células endoteliales observadas en córneas de donantes humanos cultivadas en bancos oculares durante un período de dos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland