Свиная Корнел Эндотелиальная модель органной культуры с использованием сплит-корневых кнопок

Резюме

Здесь представлен пошаговой протокол для приготовления и выращивания свиных роговицы. Поскольку эта органо-типично культивируемая модель культуры органов показывает показатели смертности клеток в течение 15 дней, сопоставимые с роговицами донора человека, она представляет собой первую модель, позволяющую долгосрочное культивирование нечеловеческих роговиц без добавления токсичных декрен.

Аннотация

Экспериментальные исследования эндотелиальных клеток роговицы связаны с несколькими трудностями. Роговицы донора человека являются скудными и редко доступны для экспериментальных исследований, поскольку они обычно необходимы для трансплантации. Эндотелиальные клеточные культуры часто не очень хорошо переводятся в ситуации in vivo. Из-за биоструктурных характеристик нечеловеческих роговиц, стромальный отек во время выращивания вызывает значительную потерю эндотелиальных клеток роговицы, что затрудняет культивирование в течение длительного периода времени. Для противодействия этому ответу используются деозавуированные агенты, такие как декек. Тем не менее, они также вызывают значительную потерю эндотелиальных клеток. Таким образом, была создана модель культуры культуры ex vivo, не требующая деотечных агентов. Свиньи глаза из местной скотобойни были использованы для подготовки раскол роговицы кнопки. После частичного трефинации роговицы внешние слои роговицы (эпителий, слой лукмана, части стромы) были удалены. Это значительно снижает потери эндотелиальных клеток роговицы, вызванные массивным стромальным отеком и мембраной Десцемета, складывающейся в течение более длительных периодов культивирования, и улучшает общее сохранение эндотелиального клеточного слоя. Последующее полное трифинирование роговицы последовало удаление раскол апогея кнопки из оставшейся луковицы глаза и выращивания. Плотность эндотелиальных клеток оценивалась в период ы наблюдения до 15 дней после приготовления (т.е. дней 1, 8, 15) с помощью световой микроскопии. Используемый метод подготовки позволяет лучше сохранить эндотелиальный слой клеток, включенный менее стромальным отеком тканей, что приводит к медленному и линейному снижению в сплит-кнопках роговицы, сопоставимых с роговицами донора человека. Поскольку эта стандартизированная органо-типично культивируемая исследовательская модель впервые позволяет стабильно культивироваться в течение по крайней мере двух недель, она является ценной альтернативой кукурузе донора человека для будущих исследований различных внешних факторов в отношении их оказывает влияние на эндотелий роговицы.

Введение

Процедуры трансплантации корневой трансплантации являются одними из наиболее часто выполняемых трансплантаций во всем мире¹. Как существует острая нехватка человеческих доноров роговицы, экспериментальные исследования решения роговицы эндотелиальных клеток в роговицы человека трудно выполнить¹. Однако внедрение оросительных растворов и других веществ, используемых в глазу, офтальмологических вязкоупругих устройств, а также хирургических инструментов и методов (например, инструменты и методы факоэмульсификации, ультразвуковая энергия) требует действительные и обширные исследования относительно их воздействия на эндотелий роговицы перед клиническим использованием.

Немногие альтернативы донорской роговицы человека существуют для исследований. Модели исследований на животных очень ценны, но в то же время очень ресурсоемкие и все более под сомнение этически. Основным недостатком культур клеток in vitro является их ограниченный перевод человеческому глазу. Результаты, полученные из клеточных культур может быть несовместимы с условиями in vivo, потому что клетки могут претерпеть эндотелиальный мезенхимальный переход (EMT), в результате чего фибробластоподобная морфология вызвана потерей клеточной полярности и изменениями в форме клеток и гене выражение².

В то время как предыдущие модели ex vivo сообщили периоды выращивания до всего 120 ч, новый метод подготовки к созданию свиной роговицы эндотелиальной модели культуры органов путем культивирования свежей свиной роговицы, по крайней мере 15 дней был недавно введен^{3 ,4,5,6}. Если эпителий роговицы и части стромы удаляются (всего около 300 мкм) из роговицы до культивирования, отек стромы уменьшается в разделенных кнопках роговицы, что приводит к меньшей эндотелиальной потере клеток и ухоженной эндотелиальной клеточный слой после 15 дней, в то время как не расщепленные кнопки роговицы показывают значительную эндотелиальную потерю клеток из-за неравномерного стромального отека и образования складок Десцемета. Глаз банки обычно используют осмотические деоретные агенты, такие как декек, чтобы уменьшить отек роговицы до трансплантации. Тем не менее, эти агенты были показаны, чтобы вызвать увеличение эндотелиальной потери клеток^7,8,9.

Эта статья направлена на визуализацию этой стандартизированной модели исследования ex vivo в подробном пошаговом протоколе, чтобы позволить будущим следователям проводить исследования по эндотелию роговицы с помощью сплит-кнопок роговицы. Эта модель представляет собой простой метод для тестирования веществ и методов, используемых в глазу, таких как офтальмологические вязкоупругие устройства, оросительные растворы, и ультразвуковой энергии, или другие процедуры, где эндотелий роговицы представляет интерес.

протокол

Этот протокол соответствует этическим принципам нашего учреждения. В соответствии с уставом комитета по этике нашего учреждения до начала экспериментов не должно было быть получено никакого этического утверждения, так как все свиные роговицы были получены с местной скотобойни.

1. Органная культура

1. Приготовьте свиные глаза.
   1. С местной скотобойни, получить свиньи глаза, которые были удалены вскоре посмертно, но до термической обработки. Транспорт глаза в лабораторию и обрабатывать их в течение нескольких часов. Во время транспортировки держите глаза при комнатной температуре (примерно 21 градусов по Цельсию) перед обработкой.
   2. Удалите все орбитальные прижима (глазные мышцы, конъюнктива, жировую ткань) до дезинфекции с помощью ножниц для глаз и щипцы колибри. Отделить и отбросить все глаза с очевидной травмой, внешним иронизом (например, разрез ножом) или видимой непрозрачностью роговицы.
   3. Подготовьте 5% йод-PBS-раствор (1:20) в стерильной чашке, добавив 3 мл 7,5% повидона йода до 57 мл фосфатного буферного солей (PBS). Также приготовьте отдельную стерильную чашку, содержащую 60 мл чистого PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество использованного йода-PBS-решения и размер чашки зависит от количества роговицы, которые должны быть вскрыты. От пяти до шести глаз требуется примерно 60 мл 5%-йод-PBS-решение, чтобы быть дезинфицированы должным образом.
   4. Положите пять-шесть глаз в 5%-йод-PBS раствор в общей сложности 5 мин, чтобы правильно дезинфицировать поверхность глаза. Тщательно перемешать каждую минуту, чтобы убедиться, что поверхность глаза полностью погружена в воду и полностью дезинфицируется в растворе йода.
   5. После 5 минут, передача дезинфицированных глаз в подготовленную чашку заполнены чистым PBS. Опять же, тщательно перемешать, чтобы обеспечить йод-PBS-раствор смывается с поверхности глаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг на чистой скамейке, чтобы предотвратить загрязнение дезинфицированных глаз.
2. Подготовка пластин клеточной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги на чистой скамейке с постоянным ламинарным потоком воздуха.
   1. Оттепель 2 мл сыворотки плода теленка (FCS). Заполните шприц (5 мл) с FCS с помощью тупой канюли. Опорожните шприц через фильтр шприца (0.22 мкм) для предотвращения возможного бактериального загрязнения FCS в 80 мл декрен-свободной среды культуры I (минимальная необходимая среда «MEM» с солями Эрла, пенициллин/стрептомицин, L-глутамамин (200 мМ), амфотерицин B (250 мкг/мл), буфер hepes (1 М) (50x), NaHCO₃и дистиллированная вода). Агитировать смесь, чтобы обеспечить равномерное распределение субстрата.
   2. Заполните каждый колодец 12 хорошо пластины культуры клеток с 3 мл субстратной смеси.
3. Выполните вскрытие и инкубацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг на чистой скамейке. Не прикасайтесь к эндотелию роговицы с помощью каких-либо инструментов.
   1. Передача глазной луковицы из чашки с PBS в держатель луковицы для глаз с роговицы вверх и поместите его под офтальмологический хирургический микроскоп. Используйте шприц заполнены 0,9% NaCl слегка применить некоторые всасывания в глаза над держателем луковицы для глаз, чтобы зафиксировать глаз в положении для вскрытия.
   2. Используйте трефин (7,5 мм), содержащий стандартизированную инкрустированную, которая гарантирует, что глубина трефином не превысит 300 мкм, чтобы нарезать поверхностно центральную роговицу(рисунок 1А).
   3. Используйте щипцы колибри и одноразовый скальпель с треугольным лезвием, чтобы вырезать и удалить частично тройной части роговицы горизонтально через стромы. Откажитесь от разделенной части роговицы, состоящей из эпителия роговицы, слоя лукмана и части стромы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Строго поддерживать горизонтальное направление резки, чтобы получить ровную толщину оставшейся стромы.
   4. Поверхностно поместите 10-0 шов (10-0 полиамид 6) в стромы, чтобы иметь возможность дифференцировать эндотелиал от стромальной стороны во время экспериментов (Рисунок 1B). Предотвратить проникновение эндотелия роговицы. Откажитесь от глазной лампы, если эндотелий проник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проникновение роговицы эндотелия с швов ойильной иглой будет видно, как жидкость из передней глазной камеры будет просачиваться через шовный канал.
   5. Используйте трефин без инкрустировки для продвижения трефинированного разреза на полную глубину до тех пор, пока не будет достигнута передняя глазная камера(рисунок 1C). Отчетливое падение сопротивления и утечки жидкости из передней глазной камеры может быть воспринято после полного проникновения роговицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте хоккейный нож, если кнопка раскола роговицы остается прикрепленной на одной стороне кнопки раскола роговицы после трефинации.
   6. Передача полученных раскол роговицы кнопку, в настоящее время состоящий из части стромы (Рисунок 2), мембраны Descemet, и роговицы эндотелия, в среде культуры (культура среднего I И FCS, см. раздел 1.2) в 12 хорошо пластины культуры клеток с помечены стороны вниз, так что роговицы эндотелий лицом вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эндотелиальная сторона обращена вниз, эндотелий может получить повреждения.
   7. Назначьте индивидуальный номер каждой кнопке разделенной роговицы для идентификации во время последующих взлетов и пометьте колодцы на пластине клеточной культуры соответственно.
   8. Инкубировать заполненные пластины культуры клеток в инкубаторе при стандартных условиях при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ и относительной влажности воздуха 95%. Измените среду культуры (культурная среда I и FCS) на 8-й день, если инкубационный период составляет 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура инкубации с использованием сплит-кнопок роговицы была проверена на срок до 15 дней.

Рисунок 1: Рассечение свиной роговицы для получения сплит-кнопок роговицы. ( )После трефинации роговицы с помощью трефина с инкрусом, чтобы разрезать на глубину 300 мкм и удаление эпителия и частей стромальной ткани, (B) шов помещается поверхностно в строму без проникновения роговицы эндотелий для последующей идентификации стромальной стороны. (C) Полное трефинирование оставшейся роговицы сопровождается (D) удаление полученной кнопки раскол роговицы из глазной луковицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Микроскопия и исследование эндотелия

1. Выполните незапятнанное обследование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неокрашенные экзамены могут быть выполнены несколько раз (например, на еженедельных последующих исследующих на день 1, 8 и 15). Однако неокрашенный подсчет позволяет только оценивать плотность эндотелиальных клеток, а не морфологические параметры.
   1. Заполните 3 мл гипотонического сбалансированного солевого раствора (hBSS, см. композицию в таблице материалов) в каждом колодце 12 хорошо пластины культуры клеток. Тщательно поместите одну кнопку раскол роговицы в hBSS, чтобы вызвать отек роговицы эндотелиальных клеток и улучшить видимость клеток для подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эндотелиальная сторона обращена в направлении микроскопа. Если используется перевернутый фазовый контрастный микроскоп, эндотелиальная сторона должна быть обращена вниз. В то время как на месте, культурная плита не должна быть перемещена, чтобы предотвратить повреждение эндотелиальных клеток.
   2. Пусть клетки набухают в течение 1-2 минут, прежде чем сфотографировать эндотелий с камерой, прикрепленной к микроскопу. Сделайте по крайней мере три фотографии по крайней мере трех различных областей, чтобы получить репрезентативное впечатление о фактическом состоянии эндотелия роговицы. Добавьте панель масштаба с истинной для масштабирования длиной 100 мкм для последующего анализа плотности эндотелиальных клеток и морфологических параметров.
   3. Для предотвращения повреждения осмотическими, удалите сплит-кнопку роговицы из hBSS после максимум5 мин и перенесите ее обратно в среду культуры^3.
2. Выполните окрашенные экспертизы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание прекращает эксперименты, так как используемые окрашивающие сятоксические вещества являются цитотоксическими. Поэтому окрашивание может быть выполнено только в конце периода наблюдения для оценки морфологических параметров (фигуры реформирования, розетки, ализарин красные окрашенные клетки).
   1. Подготовьте раствор 0.25 trypan голубой и 0.2% ализарин красный S разрешение для процедуры окрашивания.
      1. Для 0,25% trypan синий раствор, разбавить 0,4% trypan синий раствор с 0,9% NaCl раствор.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для получения 20 мл раствора 0,25% трипан синий, разбавить 12,5 мл 0,4% трипан синий раствор с 7,5 мл 0,9% NaCl раствор. Синий раствор trypan может храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель или месяцев.
      2. Для получения 0,2% ализарин красный Раствор S растворяют 100 мг ализарин красного S порошок в 50 мл 0,9% NaCl раствор при постоянном перемешивании и нагревадой до 50 градусов по Цельсию на магните, помешивая пластины с функцией нагрева. Чтобы удалить возможные осадки, отфильтруйте полученное решение. Отрегулируйте рН ализарин красный S раствор рН 4.2, добавив гидроксид натрия или соляной кислоты соответственно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым применением ализарин красный S решение убедитесь, что рН исправлена до 4,2 и что Есть нет осадков в растворе. Раствор может храниться при комнатной температуре. Не храните раствор дольше 4 недель.
   2. Поместите разделенные кнопки роговицы в чашках Петри с эндотелиальной стороной, обращенной вверх, чтобы запятнать эндотелиальные клетки. Используйте пипетку, чтобы медленно капать 0,25% trypan синий раствор капля за каплей на роговицы эндотелия в течение 90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трипан синий позволяет идентификации поврежденных клеток роговицы с проницаемой мембраной, потому что это пятна их ядра.
   3. Тщательно промыть раскол роговицы кнопку 3x в 0,9% NaCl в небольшом стакане. Опять же, используйте пипетку, чтобы медленно капать 0,2% ализарин красный S раствор капля за каплей на роговицы эндотелия в течение 90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ализарин красный S пятна мембраны Descemet, который помогает выделить клеточные границы в неповрежденных роговицы эндотелиальных клеток и выделить разрушенные клетки, когда мембрана descemet становится видимым. Кроме того, это позволяет легко идентифицировать более крупные разрушенные районы.
   4. Для изучения окрашенных роговицы эндотелия следовать шаги объяснил для неокрашенных подсчета в разделе 2.1.

3. Анализ плотности эндотелиальных клеток роговицы и морфологических параметров

1. Проект подсчета квадратов на картинках с помощью программного обеспечения для редактирования графики (Таблица материалов).
   1. Откройте программное обеспечение и откройте изображение эндотелия роговицы, выбрав файл Открыто (ru) Выберите.
   2. Проект квадрата с истинной для масштабирования боковой длины 100 мкм на изображении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги раздела 3.1.2 могут быть проигнорированы, если программное обеспечение для просмотра позволяет проецировать подсчет квадратов на картинку. Длина стороны квадрата зависит от разрешения изображений, сделанных с помощью камеры микроскопа, и может быть рассчитана с помощью панели масштаба.
      1. Обрезать шкалу бар с фотографией, сделанной с микроскопом: выберите прямоугольный инструмент Marquee на панели инструментов или нажмите M, затем границы шкалы бар, а затем выберите Edit Урожай или нажмите Ctrl x.
      2. Нажмите файл (ru) Новое (или нажмите Ctrl n). В предстоящем окне выберите Clipboard в списке выпадающих типов документов. Количество показанных пикселей — это длина стороны квадрата подсчета. Обратите внимание на соответствующие пиксели для других фотографий и нажмите OK.
      3. Выберите файл Новое (или Ctrl n). Вставьте ширину и длину (в пикселях) квадрата подсчета в предстоящем окне в зависимости от длины панели шкалы. Выберите фоновый цвет белый,затем нажмите OK.
      4. Нажмите Выберите Выберите все (или Ctrl и A). Выбрать Edit Копировать (или Ctrl и C).
      5. Выберите изображение эндотелия роговицы, открытого в шаге 3.1.1. Выбрать Edit Вставить (или Ctrl и V),чтобы вставить квадрат на фото роговицы эндотелия.
      6. Выберите слой квадрата и отрегулируйте прозрачность. Выберите Слой Стиль слоя (англ.) Варианты смешивания (англ.) Установите непрозрачность до 30% OK.
      7. Сохранить изображение с проецируемой площади с истинной для масштабирования боковой длины 100 мкм. Повторите с другими изображениями, необходимыми для анализа.
2. Оцените плотность эндотелиальных клеток и морфологические параметры.
   1. Откройте изображения с проецированными квадратами в ImageJ (версия 1.50i) и используйте PlugIn CellCounter для подсчета ячеек в квадрате. Открыть ImageJ, выберите Файл Открыто (или Ctrl и O) Выберите изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ и CellCounter PlugIn являются бесплатно доступны для скачивания в Интернете.
   2. Выберите плагины Сотовый счетчик Счетчик ячеек Инициализация. Подсчитайте эндотелиальные клетки и запишите результат. С двух сторон квадрата подсчитайте ячейки, которые вырезаны краем квадрата. Не считайте вырезанные клетки с двух сторон.
   3. Проанализируйте по крайней мере шесть квадратов на роговицу из разных областей (например, три картинки, два квадрата на картинку) и определите среднюю плотность эндотелиальных клеток на квадрат (100 мкм²). Экстраполировать плотность эндотелиальных клеток на 100 мкм^{от 2} до 1 мм^2, умножая на 100.
3. Для оценки морфологических изменений, подсчет показателей реформирования (совместное собрание 4 клеток/клеточных границ вместо трех), розетовые образования (характерный розовый вид, пять или более радиорасположенных клеток, окружающих разрушенную клетку ), или ализарин красные области (уничтоженные клетки) в прогнозируемых квадратов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, может быть полезно использовать большие квадраты (например, 200 х 200 мкм²⁾для морфологического анализа в хорошо сохранившихся образцах для получения более репрезентативных результатов.

Результаты

Представленный метод вскрытия подразумевает частичное удаление стромальной ткани, в результате чего более тонкий образец роговицы и, таким образом, менее стромальный отек(рисунок 1 и рисунок 2). Менее стромальный отек вызывает меньше с?...

Обсуждение

Этот протокол предоставляет метод для подготовки свиной сплит роговицы кнопки, которая представляет собой стандартизированные и недорогие ex vivo роговицы эндотелиальной модели культуры органов для исследовательских^{целей 6}. Свиной раскол роговицы кнопки показали снижение...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland