分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル

要約

ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。

要約

角膜内皮細胞に関する実験的研究は、いくつかの困難に関連している。ヒトドナー角膜は、通常移植に必要とされるため、実験調査に利用できることはほとんどありません。内皮細胞培養は、多くの場合、生体内の状況にうまく翻訳されません。非ヒト角膜の生体構造特性により、栽培中の間の間質腫脹は実質的な角膜内皮細胞損失を引き起こし、長期間培養を行うことが困難となる。デキストランなどの膨張剤は、この応答を打ち消すために使用されます。しかし、それらはまた、著しい内皮細胞損失を引き起こす。そこで、脱膨張剤を必要としない元生体臓器培養モデルが確立された。地元の屠殺場からの豚の目は、分割角膜ボタンを準備するために使用されました。部分的な角膜トレフィン化の後、角膜の外層(上皮、ボウマン層、間質の一部)を除去した。これは、大規模な間質腫脹およびデセメットの膜折りたたみによって誘発される角膜内皮細胞損失を大幅に減少させ、より長い栽培期間を通して、内皮細胞層の一般的な保存を改善する。その後、完全な角膜トレフィン化に続いて、残りの眼球および栽培から分割角膜ボタンを除去した。内皮細胞密度は、軽微小顕微鏡を用いて調製後最大15日目(すなわち、1日目、8日目、15日目)のフォローアップ時間で評価した。使用される調製技術は、より少ない間質組織の腫脹によって可能な内皮細胞層のよりよい保存を可能にし、ヒトドナー角膜に匹敵する分割角膜ボタンのゆっくりと線形減少率をもたらす。この標準化された有機栽培研究モデルは、少なくとも2週間安定した栽培を可能にするため、今後の様々な外的要因の調査に代わる貴重な代替手段である。角膜内皮への影響。

概要

角膜移植手順は、世界で最も一般的に行われる^移植1の一つです。ヒトドナー角膜の深刻な不足があるので、ヒト角膜内皮細胞に対処する実験的研究^は、ヒト角膜の1を行うことが困難である。しかし、眼内で使用される灌漑液および他の物質の導入、眼科粘弾性装置、ならびに手術器具および技術(例えば、ファコエマル化物化器具および技術、超音波エネルギー)が必要である。臨床使用前の角膜内皮への影響に関する有効かつ広範な調査。

ヒトドナー角膜に代わるものはほとんどない。動物研究モデルは非常に貴重ですが、同時に非常に資源を消費し、ますます倫理的に疑問を持っています。インビトロ細胞培養の主な欠点は、人間の目への限られた翻訳です。細胞培養から得られた結果は、細胞が内皮間葉転移(EMT)を受ける可能性があるため、細胞の極性の喪失および細胞形状および遺伝子の変化によって引き起こされる線維芽細胞様形態を引き起こす可能性があるため、生体内条件に不一致である可能性がある。式².

以前のex vivoモデルはわずか120時間の栽培期間を報告したのに対し、少なくとも15日間新鮮な豚角膜を培養することによりブタ角膜内皮器官培養モデルを確立する新しい調製技術が最近導入^{された3 ,4,5,6}.角膜上皮と間質の一部を栽培前に角膜から取り除くと(合計で約300μm)、間質の腫れが分断角膜ボタンで減少し、内皮細胞の損失が少なくなり、内皮が維持される最大15日後の細胞層は、非分割角膜ボタンは、不均一な間質腫脹およびデスセメットの折り目の形成による著しい内皮細胞喪失を示す。アイバンクは通常、移植前に角膜の腫脹を減らすために、デキストランなどの浸透性膨潤剤を使用する。しかしながら、これらの薬剤は、内皮細胞^{損失7、8、9}の増加を誘導することが示された。

この論文は、将来の研究者が分割角膜ボタンを使用して角膜内皮の研究を行うことを可能にするために、この標準化されたex vivo研究モデルを詳細なステップバイステッププロトコルで可視化することを目的としています。このモデルは、眼科粘弾性デバイス、灌漑溶液、超音波エネルギー、または角膜内皮が関心のある他の手順など、眼内で使用される物質および技術をテストする簡単な方法を表す。

プロトコル

このプロトコルは、当社の機関の倫理的ガイドラインに従っています。私たちの機関の倫理審査委員会の法令に従って、すべての豚角膜は、地元の屠殺場から得られたので、実験の前に倫理的な承認を得る必要はありませんでした。

1. 臓器文化

1. 豚の目を準備します。
   1. 地元の屠殺場から、死後すぐに取り除かれたが、熱処理の前にブタの目を取得します。研究室に目を運び、数時間以内にそれらを処理します。輸送中は、処理前に室温(約21°C)で目を離してください。
   2. 目のはさみと大腸菌鉗子を使用して消毒する前に、すべての眼窩の付属体(眼筋、結膜、脂肪組織)を取り除きます。明らかな外傷、外部損傷(ナイフカットなど)、または目に見える角膜の不透明性を持つすべての目を分離して破棄します。
   3. リン酸緩衝生理食生(PBS)溶液の57mLに7.5%ポビドネヨウ素の3mLを加えて無菌カップに5%ヨウ素-PBS溶液(1:20)を調製する。また、60 mL純粋なPBSを含む別の滅菌カップを調調します。
      注:使用されるヨウ素-PBS溶液の総量とカップの大きさは、解剖する角膜の数に依存します。5~6眼は、5%-ヨウ素-PBS溶液の約60mLを適切に消毒する必要があります。
   4. 5%-ヨウ素-PBS溶液に5~6個の目を入れ、目の表面を適切に消毒するために合計5分間使用します。目の表面が完全に水没し、ヨウ素溶液中に完全に消毒されていることを確認するために、毎分慎重にかき混ぜます。
   5. 5分後、消毒した目を純粋なPBSで満たされた準備されたカップに移す。繰り返しますが、ヨウ素-PBS溶液が目の表面から洗い流されることを確認するために慎重にかき混ぜます。
      注:消毒された目の汚染を防ぐためにきれいなベンチでこのステップを実行します。
2. 細胞培養プレートを調調べます。
   注:一定の層状の空気の流れが付いているきれいなベンチの次のステップを行う。
   1. 胎児ふくらはぎ血清(FCS)の2mLを解凍する。鈍いカニューレを使用してFCSで注射器(5 mL)を充填します。注射器フィルター(0.22 μm)を通して注射器を空にして、FCSの細菌汚染を防ぐために、アールの塩、ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン[200mM]を含む80mLのデキス除去培養培地I(最小必須培地[MEM])に入る可能性があります。アンホテリシンB[250 μg/mL]、ヘペスバッファー[1M][50x]、NaHCO_3、および蒸留水)。混合物を攪拌して基板分布を確保します。
   2. 基板混合物の3 mLで12ウェル細胞培養プレートの各ウェルを充填する。
3. 解剖およびインキュベーションを行う。
   注: クリーンベンチでこの手順を実行します。角膜内皮に器械と触れないでください。
   1. PBSを持つカップから眼球を角膜を上向きにして眼球ホルダーに移し、眼科外科顕微鏡の下に置きます。0.9%のNaClで満たされた注射器を使用して、眼球ホルダーの上にわずかに吸引を加え、解剖のための位置に眼を固定します。
   2. 標準化されたインレイを含むトレフィン(ø 7.5 mm)を使用して、トレフィンの深さが300 μmを超えないようにし、中央角膜に表面的に切断します(図1A)。
   3. 大腸菌鉗子と三角形のブレードを持つ単一使用のメスを使用して、角膜の部分的にトレフィン部分を間質を通して水平に切断して除去します。角膜上皮、ボウマン層、および間質の一部からなる分離された角膜部分を破棄します。
      注:残りの間質の均一な厚さを得るために、厳密に水平切断方向を維持します。
   4. 実験中に間質側から内皮を区別できるように、10-0縫合糸(10-0ポリアミド6)を間質に表面的に配置する(図1B)。角膜内皮の浸透を防ぎます。内皮が浸透している場合は、眼球を捨てます。
      注:縫合針を持つ角膜内皮の浸透は、前眼室からの流体が縫合チャネルを通して漏れ出すので、目に見える。
   5. インレイなしでトレフィンを使用して、前眼室に達するまでトレフィンカットを完全な深さに進める(図1C)。前眼室から漏出する抵抗および液体の明確な低下は角膜の完全な浸透の後に知覚することができる。
      注:スプリット角膜ボタンがトレフィン後に分割角膜ボタンの片側に取り付けられたままの場合は、ホッケーナイフを使用します。
   6. 得られた分割角膜ボタンを、間質の一部(図2)、デスセメットの膜、および角膜内皮からなる、培養培地(培養培地I+FCS、セクション1.2参照)を12ウェル細胞培養プレートに移す。角膜内皮が上を向いるように、下向きにタグ付けされています。
      注:内皮側が下を向いていれば、内皮が損傷する可能性があります。
   7. フォローアップ中に識別するために、すべての分割角膜ボタンに個別の番号を割り当て、それに応じて細胞培養プレート上のウェルにラベルを付けます。
   8. 37°C、5%CO 2、95%の相対空気水分で、標準条件下でインキュベーターで充填された細胞培養プレートをインキュベートします。培養期間7日を超えた場合は8日目に培養培地(培養培地I+FCS)を変更する。
      注:分割角膜ボタンを使用したインキュベーション手順は、最大15日間検証されています。

図1:ブタ角膜の解剖を行い、分割角膜ボタンを得た。(A)300μmの深さに切断するインレイを用いたトレフィンを用いた角膜のトレフィンを用いた後、上皮および間質組織の一部を除去し、(B)縫合糸を角膜の浸透なしに間質に表面的に入れ間質側の後の同定のための内皮。(C)残りの角膜の完全なトレフィニングに続いて(D)眼球から得られた分割角膜ボタンの除去が続く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 内皮の顕微鏡検査と検査

1. 染色されていない検査を実行します。
   注:染色されていない検査は複数回行うことができます(例えば、1日目、8日目、15日目の毎週のフォローアップで)。しかし、染色されていないカウントは、形態学的パラメータではなく、内皮細胞密度の評価のみを可能にする。
   1. 12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに低トンバランス塩溶液(hBSS、材料表の組成を参照)の3 mLを充填する。hBSSに単一の分割角膜ボタンを慎重に配置して、角膜内皮細胞の腫脹を誘発し、細胞計数のための細胞の可視性を改善する。
      注:内皮側が顕微鏡の方向に向いていることを確認してください。反転相コントラスト顕微鏡を使用する場合、内皮側は下向きである必要があります。所定の位置にある間、培養プレートは内皮細胞の損傷を防ぐために移動してはならない。
   2. 顕微鏡に取り付けたカメラで内皮を撮影する前に、細胞を1〜2分間膨れ上がらせます。角膜内皮の実態の代表的な印象を得るために、少なくとも3つの異なる領域の少なくとも3枚の写真を撮る。角膜内皮細胞密度と形態パラメータの後の分析のために、真のスケール長を100 μmにするスケールバーを追加します。
   3. 浸透性損傷を防ぐには、最大5分後にhBSSから分割角膜ボタンを取り外し、培養培^地3に戻します。
2. 染色検査を行う。
   注:染色は、使用される染色物質が細胞傷害性であるとして、実験を終了します。従って、染色は形態学的パラメータ(変形図、ロゼット形成、アリザリン赤色染色細胞)の評価のための観察期間の終わりにのみ行われてもよい。
   1. 染色手順に0.25%のトリパンブルー溶液と0.2%のアリザリン赤S溶液を調出します。
      1. 0.25%のトリパンブルー溶液の場合、0.9%のNaCl溶液で0.4%のトリパンブルー溶液を希釈します。
         注:例えば、0.25%トリパンブルー溶液の20 mLを得るために、0.4%トリパンブルー溶液の12.5mLを0.9%NaCl溶液の7.5mLで希釈する。トリパンブルー溶液は、数週間または数ヶ月間室温で保存してもよい。
      2. 0.2%のアリザリン赤S溶液を得るために、加熱機能を持つ磁石攪拌板上で50°Cに一定の撹拌および加熱下で0.9%NaCl溶液の50mLでアリザリン赤S粉末の100mgを溶解する。可能な沈殿物を除去するには、得られた溶液を濾過する。それに応じて水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加して、アリザリン赤S溶液のpHをpH 4.2に調整します。
         注:alizarin赤S溶液の各アプリケーションの前に、pHが4.2に修正され、溶液中に沈殿物がないことを確認してください。溶液は室温で保存してもよい。溶液を4週間以上保存しないでください。
   2. 内皮細胞を汚すために、内皮側を上向きにしてペトリ皿に分割角膜ボタンを置きます。ピペットを使用して、0.25%のトリパンブルー溶液を90sの角膜内皮に落とし込みます。
      注:トリパンブルーは、それが彼らの核を汚すので、透過性膜で損傷した角膜細胞の同定を可能にします。
   3. スプリット角膜ボタンを0.9%NaClで小さなガラスビーカーで慎重にすすいでください。繰り返しますが、ピペットを使用して、0.2%のアリザリン赤S溶液を90sの角膜内皮に落とし込みます。
      注:アリザリン赤Sは、損傷していない角膜内皮細胞の細胞境界を強調し、基礎となるデスセメットの膜が見えるようになると破壊された細胞を強調するのに役立つデセメットの膜を染色します。また、より大きい破壊された区域の容易な識別を可能にする。
   4. 染色された角膜内皮の検査のためにセクション2.1の染色されていないカウントのために説明されたステップに従ってください。

3. 角膜内皮細胞密度と形態パラメータの解析

1. グラフィックス編集ソフトウェア(材料の表)を使用して画像上の正方形をカウントするプロジェクト。
   1. ソフトウェアを開き、[ファイル] を選択して角膜内皮の画像を開きます|開く |を選択します。
   2. 画像上の 100 μm の側面の長さをスケールするために true を持つ正方形を投影します。
      注: セクション 3.1.2 の次の手順は、表示ソフトウェアが画像に二乗を投影できる場合は無視できます。正方形の側面の長さは顕微鏡のカメラで撮影されたイメージの決断に依存し、スケールバーで計算することができる。
      1. 顕微鏡で撮影した写真からスケールバーをトリミングする:ツールバーまたはMを押して長方形マーキーツールを選択し、スケールバーの境界線を選択し、[編集]を選択します。Ctrl キーを押すか 、Ctrl キーを押します。
      2. [ファイル] をクリックします |新規(またはCtrl + N キーを押す)。次のウィンドウで、[ドキュメントタイプ]ドロップダウンリストでクリップボードを選択します。表示されるピクセル数は、カウント正方形の横長です。他の画像の対応するピクセルをメモし、[OK]をクリックします。
      3. ファイルの選択|新規(またはCtrl + N)。スケール バーの長さに従って、次のウィンドウにカウントの正方形の幅と長さをピクセル単位で挿入します。背景色を白色で選択し、[OK]を押します。
      4. [選択] をクリックします |すべて(またはCtrl + A) を選択します。[編集] を選択|コピー (またはCtrl + C)。
      5. ステップ3.1.1で開いた角膜内皮の画像を選択します。[編集] を選択|角膜内皮の写真に正方形を挿入するために貼り付ける(またはCtrl + V)。
      6. 正方形のレイヤーを選択し、透明度を調整します。レイヤーの選択|レイヤースタイル |ブレンドオプション |不透明度を 30% に設定|OK.
      7. 100 μmの側面の長さをスケールするために真の投影された正方形で画像を保存します。
2. 内皮細胞密度と形態パラメータを評価します。
   1. ImageJ (バージョン 1.50i) で投影された正方形でイメージを開き、CellCounter PlugIn を使用して正方形内のセルをカウントします。ImageJ を開き、[ファイル] を選択 |オープン(またはCtrl + O) |[イメージ] を選択します。
      注:ImageJとセルカウンタープラグインは、オンラインでダウンロード可能なフリーウェアです。
   2. プラグインの選択 |セルカウンタ |セルカウンタ |を初期化します。内皮細胞をカウントし、結果を記録します。正方形の 2 つの辺で、正方形の端でカットされたセルをカウントします。他の 2 つの側面の切断セルをカウントしないでください。
   3. 異なる領域(例えば、3枚の写真、1枚につき2つの正方形)から角膜当たり少なくとも6つの正方形を分析し、1平方あたりの平均角膜内皮細胞密度(100 μm²⁾を決定する。100 μm² ~ 1 mm²あたりの内皮細胞密度を 100 を掛けることによって外挿します。
3. 形態変化の評価のために、カウント改革図(3つではなく≥4細胞/細胞境界の合同会議)、ロゼット形成(特徴的なロゼット形の外観、破壊された細胞を取り囲む5つ以上の放射状に配置された細胞))、または投影された正方形のアリザリン赤い領域(破壊されたセル)。
   注:あるいは、より多くの代表的な結果を得るために、よく保存されたサンプルの形態解析に大きな正方形(例えば、200 x 200 μm²⁾を使用すると便利な場合があります。

結果

提示された解剖技術は、間質組織の部分的な除去を意味し、より薄い角膜サンプルをもたらし、したがって、より少ない間質腫脹をもたらす(図1および図2)。より少ない間質の腫脹は角膜内皮に否定的な影響を与えるより少ないせん断およびピンチ力を誘発し、したがって、より低い内皮細胞損失^率6を引?...

ディスカッション

このプロトコルは、^{研究目的6}のための標準化され、低コストのexvivo角膜内皮器官培養モデルを表すブタ分割角膜ボタンの調製のための方法を提供する。ブタ分割角膜ボタンは、2週間にわたって眼科で培養されたヒトドナー角膜で観察された内皮細胞損失に匹敵する内皮細胞密度の低下を示した6,10,^11,...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland