Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Zusammenfassung

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.

Zusammenfassung

Experimentelle Forschung an hornhauten Endothelzellen ist mit mehreren Schwierigkeiten verbunden. Menschliche Spenderhornhäuten sind knapp und selten für experimentelle Untersuchungen verfügbar, da sie normalerweise für eine Transplantation benötigt werden. Endothelzellkulturen übersetzen sich oft nicht gut in In-vivo-Situationen. Aufgrund der biostrukturellen Eigenschaften nichtmenschlicher Hornhäuten führt eine stromale Schwellung während der Kultivierung zu einem erheblichen Korneal-Endothelzellverlust, der die Kultivierung über einen längeren Zeitraum erschwert. Entschwellende Mittel wie Dextran werden verwendet, um dieser Reaktion entgegenzuwirken. Jedoch, Sie verursachen auch signifikanteen Endothelzellverlust. Daher wurde ein Ex-vivo-Organkulturmodell ohne Entschwellende Mittel etabliert. Schweineaugen aus einem örtlichen Schlachthof wurden verwendet, um gespaltene Hornhautknöpfe zuzubereiten. Nach partieller Hornhauttrephination wurden die äußeren Schichten der Hornhaut (Epithel, Bogenmannschicht, Teile der Stroma) entfernt. Dies reduziert signifikant den verlustfreien Hornhautzellverlust, der durch massive stromale Schwellungen und Descemets Membranfaltung über längere Kultivierungsperioden verursacht wird, und verbessert die allgemeine Erhaltung der Endothelzellschicht. Auf die anschließende vollständige Hornhauttrephination folgte die Entfernung des gespaltenen Hornhautknopfes aus der verbleibenden Augenzwiebel und der Kultivierung. Die Endothelzelldichte wurde in Folgezeiten von bis zu 15 Tagen nach der Zubereitung (d. h. tage 1, 8, 15) mittels Lichtmikroskopie bewertet. Die verwendete Zubereitungstechnik ermöglicht eine bessere Konservierung der Endothelzellschicht, die durch eine geringere stromale Gewebeschwellung ermöglicht wird, was zu langsamen und linearen Abnahmeraten in gespaltenen Hornhautknöpfen führt, die mit menschlichen Spenderhornhäuten vergleichbar sind. Da dieses standardisierte organotypisch kultivierte Forschungsmodell erstmals einen stabilen Anbau für mindestens zwei Wochen ermöglicht, ist es eine wertvolle Alternative zu menschlichen Spenderhornhäuten für zukünftige Untersuchungen verschiedener externer Faktoren in Bezug auf ihre Wirkungen auf das Hornhautendothel.

Einleitung

Hornhauttransplantationsverfahren gehören zu den am häufigsten durchgeführten Transplantationen weltweit¹. Da es einen schweren Mangel an menschlichen Spender Hornhäuten gibt, ist experimentelle Forschung zur Bekämpfung von Hornhautendothelzellen in menschlichen Hornhäuten schwierig,¹durchzuführen. Die Einführung von Bewässerungslösungen und anderen im Auge verwendeten Substanzen, ophthalmologischen viskoelastischen Geräten sowie chirurgischen Instrumenten und Techniken (z. B. Phakoemulsifikationsinstrumente und -techniken, Ultraschallenergie) valide und umfangreiche Untersuchungen über ihre Auswirkungen auf das Hornhautendothel vor der klinischen Anwendung.

Für die Forschung gibt es nur wenige Alternativen zu menschlichen Spenderhornhäuten. Tierforschungsmodelle sind sehr wertvoll, aber gleichzeitig sehr ressourcenverbrauchend und zunehmend ethisch hinterfragt. Ein großer Nachteil der In-vitro-Zellkulturen ist ihre begrenzte Übersetzung in das menschliche Auge. Die Ergebnisse aus Zellkulturen können unpassend zu In-vivo-Bedingungen sein, da Zellen einen endotheliaalen mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen können, was zu einer fibroblastenähnlichen Morphologie führt, die durch den Verlust der Zellpolarität und Veränderungen der Zellform und des Gens verursacht wird. Ausdruck².

Während frühere Ex-vivo-Modelle Anbauzeiten von bis zu 120 h meldeten, wurde vor kurzem eine neuartige Zubereitungstechnik eingeführt, um ein Porenhorn-Endothel-Organkulturmodell zu etablieren, indem frische Schweinehornhäasen für mindestens 15 Tage kultiviert wurden^{3 ,4,5,6}. Wenn das Hornhautepithel und Teile des Stroma vor der Kultivierung aus der Hornhaut entfernt werden (insgesamt ca. 300 m), wird die Schwellung des Stroma in gespaltenen Hornhautknöpfen reduziert, was zu einem geringeren Endothelzellverlust und einem gepflegten Endothel Zellschicht nach bis zu 15 Tagen, während nicht-gespaltene Hornhautknöpfe einen signifikanten Endothelzellverlust aufgrund ungleichmäßiger stromaler Schwellungen und der Bildung von Descemets Falten aufweisen. Augenbänke verwenden in der Regel osmotische Entschwellende Mittel wie Dextran, um die Schwellung von Hornhäuten vor der Transplantation zu reduzieren. Jedoch, Diese Agenten wurden gezeigt, dass erhöhte Endothelzellverlust^7,8,9induzieren.

Dieser Artikel zielt darauf ab, dieses standardisierte Ex-vivo-Forschungsmodell in einem detaillierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zu visualisieren, um zukünftigen Forschern die Durchführung von Forschungen am Hornhautendothel mit gespaltenen Hornhautknöpfen zu ermöglichen. Dieses Modell stellt eine einfache Methode dar, um Substanzen und Techniken zu testen, die im Auge verwendet werden, wie ophthalmologische viskoelastische Geräte, Bewässerungslösungen und Ultraschallenergie oder andere Verfahren, bei denen das Hornhautendothel von Interesse ist.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den ethischen Richtlinien unserer Institution. Gemäß den Statuten des Ethikprüfungsausschusses unserer Institution musste vor den Experimenten keine ethische Genehmigung eingeholt werden, da alle Schweinehornhäuschen vom örtlichen Schlachthof bezogen wurden.

1. Orgelkultur

1. Bereiten Sie Schweineaugen vor.
   1. Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie Schweineaugen, die kurz nach dem Mortem, aber vor der thermischen Behandlung entfernt wurden. Transportieren Sie die Augen zum Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb weniger Stunden. Während des Transports die Augen vor der Verarbeitung bei Raumtemperatur (ca. 21 °C) halten.
   2. Entfernen Sie alle orbitalen Adnexe (Augenmuskeln, Bindehaut, Fettgewebe) vor der Desinfektion mit Augenschere und colibrien Zangen. Alle Augen mit offensichtlichen Traumata, äußeren Schäden (z. B. Messerschnitt) oder sichtbaren Hornhauttrübungen trennen und entsorgen.
   3. Bereiten Sie eine 5% Jod-PBS-Lösung (1:20) in einer sterilen Tasse vor, indem Sie 3 ml 7,5% Povidonjod zu 57 ml einer Phosphatgepufferten Salinelösung (PBS) hinzufügen. Bereiten Sie auch eine separate sterile Tasse mit 60 ml reinen PBS vor.
      HINWEIS: Die Gesamtmenge der verwendeten Jod-PBS-Lösung und die Größe der Tasse hängt von der Anzahl der zu sezierenden Hornhäuten ab. Fünf bis sechs Augen benötigen etwa 60 ml der 5%-Jod-PBS-Lösung, um richtig desinfiziert zu werden.
   4. Legen Sie fünf bis sechs Augen in die 5%-Jod-PBS-Lösung für insgesamt 5 min, um die Augenoberfläche richtig zu desinfizieren. Jede Minute vorsichtig umrühren, um sicherzustellen, dass die Augenoberfläche vollständig untergetaucht und vollständig in der Jodlösung desinfiziert wird.
   5. Nach 5 min die desinfizierten Augen auf den vorbereiteten Becher mit reinem PBS gefüllt übertragen. Erneut vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass die Jod-PBS-Lösung von der Augenoberfläche weggespült wird.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank aus, um eine Kontamination der desinfizierten Augen zu verhindern.
2. Bereiten Sie Zellkulturplatten vor.
   HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte auf einer sauberen Bank mit konstantem laminaren Luftstrom aus.
   1. Tau2 ml fetales Wadenserum (FCS). Füllen Sie eine Spritze (5 ml) mit dem FCS mit einer stumpfen Kanüle. Entleeren Sie die Spritze durch einen Spritzenfilter (0,22 m), um eine mögliche bakterielle Kontamination des FCS in 80 ml dextranfreies Kulturmedium I (mindestens wesentliches Medium [MEM] mit Earle-Salzen, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin [200 mM], zu verhindern, Amphotericin B [250 g/ml], Hepespuffer [1 M] [50x], NaHCO₃und destilliertes Wasser). Rühren Sie die Mischung, um eine gleichmäßige Substratverteilung zu gewährleisten.
   2. Füllen Sie jeden Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte mit 3 ml der Substratmischung.
3. Durchführen von Sezierungen und Inkubationen.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank aus. Berühren Sie das Hornhautendothel nicht mit irgendwelchen Instrumenten.
   1. Übertragen Sie eine Glühbirne aus der Tasse mit PBS in den Augenzwiebelhalter mit der Hornhaut nach oben und legen Sie sie unter ein ophthalmologisches Operationsmikroskop. Verwenden Sie eine Spritze gefüllt mit 0,9% NaCl, um leicht etwas Absaugung auf das Auge über die Augenzwiebelhalter, um das Auge in Position für die Zerlegung zu fixieren.
   2. Verwenden Sie ein Trephin (ca. 7,5 mm), das ein standardisiertes Inlay enthält, das sicherstellt, dass die Trephintiefe 300 m nicht überschreitet, um oberflächlich in die zentrale Hornhaut zu schneiden (Abbildung 1A).
   3. Verwenden Sie colibrifarbene Zangen und ein Einwegsskalpell mit einer dreieckigen Klinge, um den teilweise gebäusbten Teil der Hornhaut horizontal durch die Stroma zu schneiden und zu entfernen. Entsorgen Sie den abgetrennten Hornhautteil, der aus dem Hornhautepithel, der Bogenmannschicht und einem Teil des Stroma besteht.
      HINWEIS: Halten Sie die horizontale Schnittrichtung strikt aufrecht, um eine gleichmäßige Dicke des verbleibenden Stroma zu erhalten.
   4. Oberflächlich eine 10-0 Naht (10-0 Polyamid 6) in den Stroma legen, um das Endothel während der Experimente von der stromalen Seite unterscheiden zu können (Abbildung 1B). Verhindern Sie das Eindringen des Hornhautendothel. Entsorgen Sie die Glühbirne, wenn das Endothel durchdrungen ist.
      HINWEIS: Das Eindringen des Hornhautendotheles mit der Nahtnadel wird sichtbar sein, da Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer durch den Nahtkanal austritt.
   5. Verwenden Sie das Trephin ohne Inlay, um den trephinierten Schnitt bis zur erliegenden vorderen Augenkammer in die volle Tiefe zu bringen (Abbildung 1C). Ein deutlicher Rückgang des Widerstands und flüssigkeitsaustritt aus der vorderen Augenkammer kann nach vollständiger Penetration der Hornhaut wahrgenommen werden.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Hockeymesser, wenn der gespaltene Hornhautknopf nach der Trephination auf einer Seite des geteilten Hornhautknopfes befestigt bleibt.
   6. Übertragen Sie den erhaltenen geteilten Hornhautknopf, der nun aus einem Teil der Stroma (Abbildung 2), der Descemet-Membran und dem Hornhautendothel besteht, in das Kulturmedium (Kulturmedium I + FCS, siehe Abschnitt 1.2) in die 12 Brunnenzellkulturplatte mit dem getaggte Seite nach unten, so dass das Hornhautendothel nach oben gerichtet ist.
      HINWEIS: Wenn die Endothelseite nach unten gerichtet ist, kann das Endothel beschädigt werden.
   7. Weisen Sie jedem geteilten Hornhautknopf eine individuelle Zahl zur Identifizierung während der Follow-ups zu und beschriften Sie die Brunnen auf der Zellkulturplatte entsprechend.
   8. Inkubieren Sie die gefüllten Zellkulturplatten in einem Inkubator unter Standardbedingungen bei einer Temperatur von 37 °C, 5%_CO2 und einer relativen Luftfeuchte von 95%. Ändern Sie das Kulturmedium (Kulturmedium I + FCS) an Tag 8, wenn eine Inkubationszeit von 7 Tagen überschritten wird.
      HINWEIS: Das Inkubationsverfahren mit geteilten Hornhautknöpfen wurde für bis zu 15 Tage validiert.

Abbildung 1: Zerlegung der Schweinehornhaut, um gespaltene Hornhautknöpfe zu erhalten. (A) Nach der Trephination der Hornhaut mit einem Trephin mit einer Inlay, um in eine Tiefe von 300 m zu schneiden und das Epithel und Teile des Stromalgewebes zu entfernen, (B) wird eine Naht oberflächlich in die Stroma gelegt, ohne dass die Hornhaut Endothel zur späteren Identifizierung der stromalen Seite. (C) Auf die vollständige Trephination der verbleibenden Hornhaut folgt (D) die Entfernung des erhaltenen gespaltenen Hornhautknopfes aus der Augenzwiebel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Mikroskopie und Untersuchung des Endothel

1. Führen Sie eine ungefärbte Untersuchung durch.
   HINWEIS: Die unbefleckte Untersuchung kann mehrmals durchgeführt werden (z. B. bei wöchentlichen Follow-ups an Tag 1, 8 und 15). Die unbefleckte Zählung erlaubt jedoch nur die Beurteilung der Endothelzelldichte, nicht morphologische Parameter.
   1. Füllen Sie 3 ml hypotonische ausgewogene Salzlösung (hBSS, siehe Zusammensetzung in Tabelle der Materialien) in jedem Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte. Legen Sie vorsichtig einen einzelnen gespaltenen Hornhautknopf in hBSS, um schwellungen der hornhauten Endothelzellen zu induzieren und die Sichtbarkeit der Zellen für die Zellzählung zu verbessern.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endothelseite in Richtung des Mikroskops ausgerichtet ist. Wenn ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop verwendet wird, muss die endotheliale Seite nach unten gerichtet sein. Während an Ort und Stelle, die Kulturplatte sollte nicht bewegt werden, um Endothelzellschäden zu verhindern.
   2. Lassen Sie die Zellen für 1-2 min anschwellen, bevor Sie ein Bild des Endothels mit der Kamera am Mikroskop befestigt. Nehmen Sie mindestens drei Fotos von mindestens drei verschiedenen Bereichen auf, um einen repräsentativen Eindruck vom tatsächlichen Zustand des Hornhautendothel zu erhalten. Fügen Sie einen Maßstabsbalken mit einer Maßstabslänge von 100 m für eine spätere Analyse der kornealen Endothelzelldichte und morphologischen Parameter hinzu.
   3. Um osmotische Schäden zu vermeiden, entfernen Sie den geteilten Hornhautknopf nach maximal 5 min aus dem hBSS und übertragen Sie ihn wieder in das Kulturmedium³.
2. Führen Sie eine gefärbte Untersuchung durch.
   HINWEIS: Die Färbung beendet die Experimente, da die verwendeten Färbesubstanzen zytotoxisch sind. Daher darf die Färbung nur am Ende des Beobachtungszeitraums zur Beurteilung morphologischer Parameter (Reformationsfiguren, Rosettenbildungen, Alizarinrot-Gefärbte Zellen) durchgeführt werden.
   1. Bereiten Sie eine 0,25% Trypan-Blau-Lösung und 0,2% Alizarin rote S-Lösung für das Färbeverfahren vor.
      1. Für die 0,25% Trypan-Blaulösung die 0,4% Trypan-Blaulösung mit einer 0,9% NaCl-Lösung verdünnen.
         HINWEIS: Um beispielsweise 20 ml einer 0,25% Trypan-Blaulösung zu erhalten, verdünnen Sie 12,5 ml der 0,4% Trypan-Blaulösung mit 7,5 ml der 0,9%-NaCl-Lösung. Die Trypanblaulösung kann mehrere Wochen oder Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
      2. Um eine 0,2% Alizarin rote S-Lösung zu erhalten, lösen Sie 100 mg des Alizarin-Roten S-Pulvers in 50 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung unter ständigem Rühren und Erhitzen auf 50 °C auf einer Magnetrührplatte mit Heizfunktion auf. Um mögliche Ausscheidungen zu entfernen, filtern Sie die erhaltene Lösung. Stellen Sie den pH-Wert der Alizarin-Rot-S-Lösung auf pH 4.2 ein, indem Sie Natriumhydroxid oder Salzsäure entsprechend zusetzen.
         HINWEIS: Stellen Sie vor jeder Anwendung der Alizarin-Rot-S-Lösung sicher, dass der pH-Wert auf 4.2 korrigiert wird und dass sich keine Ausfällungen in der Lösung befinden. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Bewahren Sie die Lösung nicht länger als 4 Wochen auf.
   2. Legen Sie die geteilten Hornhautknöpfe in Petrischalen mit der endotheliaalen Seite nach oben, um die Endothelzellen zu färben. Verwenden Sie eine Pipette, um die 0,25% Trypan-Blaulösung Tropfen für Tropfen auf das Hornhautendothel für 90 s langsam zu tropfen.
      HINWEIS: Trypan blue ermöglicht die Identifizierung beschädigter Hornhautzellen mit einer durchlässigen Membran, da sie ihre Kerne färbt.
   3. Spülen Sie den gespaltenen Hornhautknopf 3x in 0,9% NaCl vorsichtig in einem kleinen Glasbecher ab. Verwenden Sie erneut eine Pipette, um die 0,2% Alizarin rote S-Lösung Tropfen für Tropfen auf das Hornhautendothel für 90 s langsam zu tropfen.
      HINWEIS: Alizarin rot S färbt die Membran des Descemet, die hilft, Zellränder in unbeschädigten hornhauten Endothelzellen hervorzuheben und zerstörte Zellen hervorzuheben, wenn die zugrunde liegende Descemet-Membran sichtbar wird. Außerdem ermöglicht es die einfache Identifizierung größerer zerstörter Gebiete.
   4. Zur Untersuchung des gefärbten Hornhautendothel folgen Sie den Schritten, die für die unbefleckte Zählung in Abschnitt 2.1 erklärt werden.

3. Analyse der kornealen Endothelzelldichte und morphologischer Parameter

1. Projektzählquadrate auf den Bildern mit einer Grafikbearbeitungssoftware (Tabelle der Materialien).
   1. Öffnen Sie die Software und öffnen Sie ein Bild des Hornhautendothel, indem Sie Datei | Öffnen | Wählen Sie.
   2. Projizieren Sie ein Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 m auf das Bild.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte von Abschnitt 3.1.2 können ignoriert werden, wenn die Anzeigesoftware das Projizieren von Quadraten auf das Bild ermöglicht. Die Seitenlänge des Quadrats hängt von der Auflösung der mit der Kamera des Mikroskops aufgenommenen Bilder ab und kann mit dem Skalenbalken berechnet werden.
      1. Schneiden Sie die Skalenleiste aus dem mit dem Mikroskop aufgenommenen Foto zu: Wählen Sie das rechteckige Marquee-Werkzeug auf der Werkzeugleiste aus oder drücken Sie M, um dann die Maßstabsleiste einzugrenzen, und wählen Sie dann Bearbeiten | Zuschneiden oder drücken Sie Strg + X.
      2. Klicken Sie auf Datei | Neu (oder drücken Sie Strg + N). Wählen Sie im kommenden Fenster die Zwischenablage in der Dropdown-Liste Dokumenttyp aus. Die Anzahl der angezeigten Pixel ist die Seitenlänge des Zählquadrats. Beachten Sie die entsprechenden Pixel für die anderen Bilder und klicken Sie auf OK.
      3. Datei auswählen | Neu (oder Strg + N). Fügen Sie breite und lange (in Pixel) des Zählquadrats im kommenden Fenster entsprechend der Länge der Maßstabsleiste ein. Wählen Sie die Hintergrundfarbe Weiß, und drücken Sie dann OK.
      4. Klicken Sie auf Auswählen | Wählen Sie alle (oder Strg + A). Bearbeiten auswählen | Kopieren (oder Strg + C).
      5. Wählen Sie das Bild des Hornhautendothel, das in Schritt 3.1.1 geöffnet wurde. Bearbeiten auswählen | Fügen Sie (oder Strg + V) ein, um das Quadrat auf dem Foto des Hornhautendothels einzufügen.
      6. Wählen Sie die Ebene des Quadrats aus, und passen Sie die Transparenz an. Layer auswählen | Layer-Stil | Mischoptionen | Opazität auf 30 % einstellen | OK.
      7. Speichern Sie das Bild mit dem projizierten Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 m. Wiederholen Sie dies mit den anderen Bildern, die für die Analyse benötigt werden.
2. Bewerten Sie die Endothelzelldichte und die morphologischen Parameter.
   1. Öffnen Sie die Bilder mit den projizierten Quadraten in ImageJ (Version 1.50i) und verwenden Sie das CellCounter PlugIn, um die Zellen innerhalb des Quadrats zu zählen. Öffnen Sie ImageJ, wählen Sie Datei | Öffnen (oder Strg + O) | Wählen Sie Bild.
      HINWEIS: ImageJ und das CellCounter PlugIn stehen freeware zum Online-Download zur Verfügung.
   2. Plugins auswählen | Cell_Counter | Zelle Zähler | Initialisierenvon . Zählen Sie die Endothelzellen und zeichnen Sie das Ergebnis auf. Zählen Sie auf zwei Seiten des Quadrats die Zellen, die durch den Rand des Quadrats geschnitten werden. Zählen Sie die geschnittenen Zellen nicht auf den beiden anderen Seiten.
   3. Analysieren Sie mindestens sechs Quadrate pro Hornhaut aus verschiedenen Bereichen (z. B. drei Bilder, zwei Quadrate pro Bild) und bestimmen Sie die durchschnittliche korneale Endothelzelldichte pro Quadrat (100 m²). Extrapolieren Sie die Endothelzelldichte pro 100 m² bis 1 mm² durch Multiplikation mit 100.
3. Für die Beurteilung morphologischer Veränderungen zählen Reformationszahlen (gemeinsames Treffen von 4 Zellen/Zellrändern statt drei), Rosettenformationen (charakteristisches rosetteförmiges Aussehen, fünf oder mehr radial angeordnete Zellen, die eine zerstörte Zelle umgeben ) oder alizarin rote Bereiche (zerstörte Zellen) in den projizierten Quadraten.
   HINWEIS: Alternativ kann es sinnvoll sein, größere Quadrate (z. B. 200 x 200 m²) für die morphologische Analyse in gut erhaltenen Proben zu verwenden, um repräsentativere Ergebnisse zu erzielen.

Ergebnisse

Die vorgestellte Seziertechnik impliziert eine teilweise Entfernung von Stromgewebe, was zu einer dünneren Hornhautprobe und damit zu einer geringeren stromalen Schwellung führt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Weniger stromale Schwellungen induziert weniger Scher- und Prisenkräfte, die einen negativen Einfluss auf das Hornhautendothel haben, wodurch niedrigere Endothelzellverlustraten⁶verursacht werden. ...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Schweinesplit-Hornhautknöpfen, die ein standardisiertes und kostengünstiges ex vivo korneales endotheliales Organkulturmodell für Forschungszwecke darstellt⁶. Porcin Split Hornhautknöpfe zeigten eine Abnahme der Endothelzelldichte vergleichbar mit Endothelzellverlusten, die in menschlichen Spenderhornhäuten beobachtet wurden, die in Augenbänken über einen Zeitraum von zwei Wochen kultiviert wurden^6,<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland