מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת

Summary

כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.

Abstract

המחקרים הניסיוניים על תאי הקרנית. משויכים למספר קשיים קרניות של תורמים אנושיים נדירות ולעיתים רחוקות זמינות לחקירות נסיוניות כאשר הן נחוצות בדרך כלל להשתלה. תרביות תאים אנדותל לעתים קרובות לא לתרגם היטב במצבים vivo. בשל המאפיינים הביוקונסטרוקטיבי של הקרניות הבלתי-אנושיות, מסטרומה נפיחות במהלך הטיפוח-תרגול גורם לאובדן משמעותי של תאי הקרנית, מה שמקשה על הטיפוח-תרגול למשך זמן ממושך. סוכני deswelling כגון תוספי משמשים כדי לנטרל תגובה זו. עם זאת, הם גם גורמים לאיבוד משמעותי בתאי האנדותל. לכן, מודל תרבות vivo לשעבר האיברים אינו דורש הוקמה סוכנים. עיני חזיר מבית המטבחיים המקומי שימשו להכנת כפתורי הקרנית מפוצל. לאחר הסרת הקרנית חלקית, השכבות החיצוניות של הקרנית (אפיתל, שכבת באומן, חלקים של משתית) הוסרו. זה מפחית באופן משמעותי את האובדן של תא אנדותל הקרנית הנגרמת על ידי נפיחות מסיבית של הממברנה וקיפול הקרום של האמת לאורך תקופות הטיפוח הארוך יותר ומשפר את השימור הכללי של שכבת התא האנדותל. מעקב אחר הקרנית מלאה לאחר מכן ההסרה של כפתור הקרנית מפוצל מנורת העין הנותרים וטיפוח. צפיפות התא של האנדותל הוערך בשעות המעקב של עד 15 יום לאחר ההכנה (כלומר, ימים 1, 8, 15) במיקרוסקופ אור. טכניקת ההכנה המשמשת מאפשרת שימור טוב יותר של שכבת התא האנדותל, המופעלת על-ידי נפיחות ברקמות פחות מסטרומה, דבר הגורם לירידה איטית וליניארית בקצב הקרניות המפוצל בהשוואה לקרניות של תורמים אנושיים. כמו זה מודל אורגאנו-בדרך כלל מעובד מחקר בפעם הראשונה מאפשר טיפוח יציב לפחות שבועיים, זה חלופה רבת ערך לקרנית התורם האנושי לחקירות עתידיות של גורמים חיצוניים שונים לגבי השפעות. על האנדותל הקרנית

Introduction

השתלת הקרנית הליכים הם בין השתלות הנפוצות ביותר ברחבי העולם¹. מאחר שקיים מחסור חמור בקרניות של תורמים אנושיים, מחקר ניסיוני מטפל בתאי הקרתל של הקרניות בקרנית אנושית קשה לביצוע¹. עם זאת, המבוא של פתרונות השקיה וחומרים אחרים המשמשים בתוך העין, מכשירים למדידת התקשות אופטלמולוגית, כמו גם מכשירים כירורגיים וטכניקות (למשל, מכשירים וטכניקות phacoאמולסיה, אנרגיית אולטרסאונד) דורש חקירה חוקית ונרחבת בנוגע להשפעות שלהם על האנדותל הקרנית לפני שימוש קליני.

מעטים האלטרנטיבות לקרניות. התורמות של האדם למחקר מודלים מחקר בעלי חיים הם בעלי ערך רב, אבל באותו זמן מאוד משאבים רב והוא נחקר יותר ויותר מבחינה אתית. החיסרון העיקרי של תרביות תאים מבחנה הוא התרגום המוגבל שלהם לעין האנושית. התוצאות שהתקבלו מתרבויות התא יכול להיות לא מתאים בתנאים vivo, כי תאים עשויים לעבור מעבר אנדותל mesenchymal (האמבולנס), וכתוצאה מכך פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה הנגרמת על ידי אובדן של קוטביות התאים ושינויים בצורת תא גן ביטוי².

ואילו הדגמים הקודמים vivo ex דיווחו על תקופות הטיפוח של עד רק 120 h, טכניקת הכנה הרומן כדי להקים מודל הקרנית של הקרניות האנדותל של הגוף על ידי הקרנית החזיר טרי לפחות לאחר 15 ימים הוצג לאחרונה^{3 ,4,5,6}. אם אפיתל הקרנית וחלקים של משתית מוסרים (כ 300 יקרומטר בסך הכל) מן הקרנית לפני הטיפוח, נפיחות של משתית מופחת לחצני הקרנית מפוצל וכתוצאה מכך אובדן התאים האנדותל ומתוחזק היטב שכבת התא לאחר עד 15 ימים, ואילו לחצני הקרנית לא מפוצל להראות הפסד משמעותי בתאי האנדותל בשל נפיחות סטרומה מחוספס היווצרות של קפלי האמת של. בנקים עין בדרך כלל להשתמש אוסמוטי deswelling סוכנים כגון תוספי כדי להפחית נפיחות של קרניות לפני ההשתלה. עם זאת, סוכנים אלה הוכחו לגרום לאובדן של התאיםהאנדותל^{מוגברת 7,8,9}.

מאמר זה שואפת להמחיש מודל זה vivo ex סטנדרטית לשעבר בפרוטוקול צעד אחר צעד מפורט כדי לאפשר חוקרים עתידיים לבצע מחקר על אנדותל הקרנית באמצעות כפתורי הקרנית מפוצל. מודל זה מייצג שיטה ישירה לבדיקת חומרים וטכניקות המשמשים בתוך העין, כגון מכשירים אלסטיים, פתרונות השקיה, ואנרגיית אולטרסאונד, או הליכים אחרים שבהם מדובר באנדותל הקרנית.

Protocol

פרוטוקול זה מלווה את ההנחיות האתיות של המוסד שלנו. בהתאם לחוקים של ועדת הביקורת האתית של המוסד שלנו לא היה צריך לקבל אישור מוסרי לפני הניסויים, כמו כל הקרניות שהתקבלו מהמטבחיים המקומי.

1. התרבות העוגב

1. . הכן את עיני החזיר
   1. מתוך המטבחיים המקומי, להשיג עיניים חזיר שהוסרו זמן קצר לאחר המוות, אבל לפני טיפול תרמי. להעביר את העיניים למעבדה. ולעבד אותם תוך כמה שעות במהלך ההובלה, שמרו את העיניים בטמפרטורת החדר (כ -21 ° c) לפני העיבוד.
   2. הסר את כל adnexes מסלולית (שרירי העין, לחמית, רקמת האדיפוז) לפני חיטוי באמצעות מספריים העין מלקחיים. להפריד ולמחוק את כל העיניים עם טראומה ברורה, נזק חיצוני (למשל, חיתוך סכין), או להציג הקרניות הקרנית.
   3. הכינו 5% יוד-PBS-פתרון (1:20) בספל סטרילי על ידי הוספת 3 מ ל של 7.5% povidone יוד ל 57 mL של תמיסת מלח פוספט מאגור (PBS). כמו כן להכין גביע סטרילי נפרד המכיל 60 mL טהור PBS.
      הערה: הסכום הכולל של השימוש יוד-PBS-פתרון ואת גודל הספל תלוי במספר של קרניות לגזור. חמש עד שישה עיניים דורשים כ 60 mL של 5%-יוד-PBS-פתרון להיות חיטוי כראוי.
   4. שים חמש עד שש עיניים לתוך 5%-יוד-PBS פתרון עבור סך של 5 דקות כדי לחטא כראוי את פני השטח של העיניים. מערבבים בזהירות כל דקה כדי להבטיח את פני השטח של העיניים הוא שקוע לחלוטין מחוטא לגמרי בתמיסה יוד.
   5. לאחר 5 דקות, העבר את העיניים החיטוי לגביע המוכן ממולא ב-PBS טהור. שוב, בזהירות מערבבים כדי להבטיח את התמיסה יוד-PBS נשטף הרחק מפני השטח של העיניים.
      הערה: בצע צעד זה על ספסל נקי כדי למנוע זיהום של העיניים החיטוי.
2. הכן את לוחיות התרבות של התאים.
   הערה: בצע את השלבים הבאים על ספסל נקי עם זרימה מתמדת של אוויר שכבתית.
   1. הפשרת 2 מ ל סרום לעגל עוברי (FCS). ממלאים מזרק (5 מ ל) עם ה-FCS באמצעות צינורית קהה. לרוקן את המזרק דרך מסנן מזרק (0.22 μm) כדי למנוע זיהום חיידקי אפשרי FCS לתוך 80 mL של בינונית התרבות ללא דקטרן I (מדיום חיוני מינימלי [הגברת] עם מלחים של ארל, פניצילין/סטרפטומיצין, L-גלוטמין [200 mM], אמפוריטיצין B [250 μg/mL], מאגר Hepes [1 מ'] [50x], נחקו₃, ו מים מזוקקים). מתפרעים את התערובת כדי להבטיח גם התפלגות המצע.
   2. ממלאים כל באר של 12 היטב לוחית התרבות תא עם 3 מ ל של תערובת המצע.
3. לבצע ניתוח הדגירה.
   הערה: בצע שלב זה על ספסל נקי. אל תגעו באנדותל הקרנית. עם כלים כלשהם
   1. העבר הנורה העין מן הספל עם PBS לתוך מחזיק הנורה העין עם הקרנית פונה כלפי מעלה ולמקם אותו מתחת מיקרוסקופ כירורגי אופטלמולוגי. השתמש מזרק מלא עם 0.9% הנאגל כדי להחיל מעט יניקה על העין על מחזיק נורת העין כדי לקבוע את העין בעמדה לניתוח.
   2. השתמש טרפין (ø 7.5 מ"מ) המכיל שיבוץ סטנדרטית, אשר מבטיח את עומק הטרפן לא יעלה על 300 μm, כדי לחתוך שטחי לתוך הקרנית המרכזית (איור 1א).
   3. השתמש מלקחיים co, ו אזמל יחיד לשימוש עם להב משולש כדי לגזור ולהסיר את החלק הטרפלורי חלקית של קרנית אופקית דרך משתית. להיפטר חלק הקרנית מופרדים המורכב האפיתל הקרנית, שכבת באומן, וחלק של הסטרומה.
      הערה: לשמור בקפדנות על כיוון החיתוך האופקי כדי לקבל עובי אפילו של הסטרומה שנותרו.
   4. מקום שטחי 10-0 תפר (10-0 פוליאמיד 6) לתוך משתית כדי להיות מסוגל להבדיל את האנדותל מן הסטרומה בצד במהלך הניסויים (איור 1B). למנוע חדירה של. הקרנית האנדותל להשליך את הנורה העין אם האנדותל היא חדרה.
      הערה: חדירה של אנדותל הקרנית עם המחט תפירה יהיה גלוי, כמו נוזל מחדר העין הקדמי לדלוף דרך תעלת תפר.
   5. השתמשו בטרפין ללא שיבוץ כדי לקדם את הטרפריק לעומק מלא עד שיגיע לחדר העין הקדמי (איור 1ג). ירידה ברורה בהתנגדות נוזל דולף מן התא העין הקדמי ניתן להיתפס לאחר חדירה מלאה של הקרנית.
      הערה: השתמש סכין הוקי אם לחצן הקרנית מפוצל נשאר מחובר בצד אחד של לחצן הקרנית מפוצל לאחר התרפלוקס.
   6. העבר את לחצן הקרנית המפוצל שהושג, המורכב כעת מחלק מסטרומה (איור 2), הקרום של הספר, והאנדותל הקרנית, לתוך מדיום התרבות (התרבות הבינונית I + fcs, ראה סעיף 1.2) לצלחת תרבות התא 12 היטב עם ה מתויג לצד כלפי מטה, כך אנדותל הקרנית פונה כלפי מעלה.
      הערה: אם צד האנדותל מפונה כלפי מטה, האנדותל עלול להיפגע.
   7. הקצה מספר בודד לכל לחצן הקרניות המפוצל לזיהוי במהלך עליות המעקב ותייג את הבארות בלוח התרבות של התא בהתאם.
   8. מודטה את לוחיות התרבות של התאים המלאים בחממה תחת תנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 ° c, 5% CO₂ ו לחות האוויר היחסי של 95%. שנה את מדיום התרבות (בינוני בתרבות I + FCS) ביום 8 אם יש חריגה מתקופת דגירה של 7 ימים.
      הערה: תהליך הדגירה באמצעות לחצני הקרנית מפוצל אומת עד 15 ימים.

איור 1: חיתוך של הקרנית חזירי להשיג כפתורי הקרנית מפוצל. (א) לאחר trephination של הקרנית באמצעות טרפין עם שיבוץ לחתוך לעומק של 300 יקרומטר והסרה של האפיתל וחלקים של רקמת סטרומה, (ב) תפר ממוקם שטחי לתוך משתית ללא חדירה של הקרנית אנדותל לזיהוי מאוחר יותר של הצד של סטרומה. (ג) trephination מלא של הקרנית הנותרים ואחריו (ד) הסרת כפתור הקרנית מפוצל השיגה מנורת העין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. מיקרוסקופיה ובחינת האנדותל

1. בצע בדיקה בלתי מוכתמת.
   הערה: ניתן לבצע בדיקה ללא ויטראז מספר פעמים (למשל, במעקב שבועי ביום 1, 8, ו -15). עם זאת, ספירה בלתי מוכתמת רק מאפשר הערכה של צפיפות התא אנדותל, לא פרמטרים מורפולוגיים.
   1. מילוי 3 מ ל של תמיסת היפוטוניקה מאוזנת מלח (hBSS, ראה קומפוזיציה בטבלה של חומרים) בכל באר של 12 היטב התרבות תא לוחית. בזהירות המקום כפתור הקרנית מפוצל יחיד hBSS לגרום נפיחות של תאי הקרנית אנדותל ולשפר את הניראות של התאים עבור ספירת תאים.
      הערה: ודא שהצד האנדותל פונה לכיוון המיקרוסקופ. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגודיות של שלב הפוך, הצד האנדותל צריך להיות פונה כלפי מטה. במקום זאת, אין להזיז את לוח התרבות כדי למנוע נזק לתאי האנדותל.
   2. תן לתאים להתנפח 1-2 דקות לפני נטילת תמונה של האנדותל עם המצלמה המצורפת למיקרוסקופ. קח לפחות שלוש תמונות של לפחות שלושה אזורים שונים כדי לקבל רושם מייצג של המצב הממשי של אנדותל הקרנית. הוסף סרגל קנה מידה עם האמת לאורך קנה המידה של 100 יקרומטר לניתוח מאוחר יותר של צפיפות התא של הקרנית אנדותל ופרמטרים מורפולוגיים.
   3. כדי למנוע נזק אוסמוטי, להסיר את לחצן הקרנית מפוצל מן hBSS לאחר מקסימום של 5 דקות ולהעביר אותו בחזרה למדיום התרבות³.
2. ביצוע בדיקה ויטראז '.
   הערה: כתמים מסיים את הניסויים, כמו חומרים מכתים בשימוש הם ציטוטוקסיים. לכן, כתמים ניתן לבצע רק בתום תקופת התצפית להערכת פרמטרים מורפולוגיים (הרפורמציה דמויות, תצורות שושנת, מוכתם אדום תאים אדומים).
   1. הכינו 0.25% טריבן הפתרון הכחול 0.2% אליזרין הפתרון האדום של הליך הצביעת.
      1. לקבלת הפתרון הכחול 0.25%, דלל את הפתרון הכחול 0.4% באמצעות פתרון כחול של 0.9%.
         הערה: לדוגמה, כדי להשיג 20 מ ל של 0.25% מהפתרון הכחול של הפתרון, יש לדלל 12.5 mL של הפתרון הכחול של 0.4%, עם 7.5 mL מתוך הפתרון של 0.9%. הפתרון הכחול עשוי להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות או חודשים.
      2. כדי להשיג 0.2% aliזרין אדום הפתרון התמוססות 100 mg של אבקת S האדום אליזרין 50 mL של 0.9% הפתרון מתחת לערבוב קבוע וחימום כדי 50 ° c על צלחת ערבוב מגנט עם החום הפונקציה. כדי להסיר מאיצים אפשריים, סנן את הפתרון שהושג. להתאים את ה-ph של הפתרון האדום של אליזרין כדי ph 4.2 על ידי הוספת נתרן הידרוקסיד או חומצה הידרוכלורית בהתאם.
         הערה: לפני כל יישום של הפתרון האדום האליזרין ודא כי ה-pH מתוקן ל-4.2 ושאין מאיצים בפתרון. הפתרון עשוי להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר. אין לאחסן את הפתרון למשך יותר מ -4 שבועות.
   2. הניחו את לחצני הקרניות הפוצלים במנות פטרי, כשצד האנדותל פונה כלפי מעלה כדי להכתים את תאי האנדותל. השתמש בפיפטה כדי לטפטף באיטיות את 0.25% טריפי הפתרון הכחול ירידה על ידי ירידה אל אנדותל הקרנית עבור 90 s.
      הערה: טרילון כחול מאפשר זיהוי של תאי הקרנית פגום עם קרום חדיר כי זה מכתים את הגרעינים שלהם.
   3. לשטוף בזהירות את כפתור הקרנית מפוצל 3x ב 0.9% בתוך מיכל זכוכית קטן. שוב, השתמש בפיפטה כדי לטפטף לאט את 0.2% אליזרין אדום הפתרון ירידה על ידי ירידה אל אנדותל הקרנית עבור 90 S.
      הערה: אליזרין אדום כתמי הקרום של האור, המסייע להדגיש את גבולות התאים בתאי הקרנית שאינם תקינים ולהדגיש תאים שנהרסו כאשר הקרום של האור המשמש כבסיס הופך גלוי. כמו כן, היא מאפשרת זיהוי קל של אזורים נהרסו גדולים יותר.
   4. לבדיקה של אנדותל הקרנית המוכתמת בעקבות הצעדים שהוסברו לספירה בלתי מוכתמת בסעיף 2.1.

3. ניתוח צפיפות תא הקרנית ופרמטרים מורפולוגיים

1. Project מספור ריבועים על התמונות באמצעות תוכנת עריכת גרפיקה (טבלת חומרים).
   1. פתח את התוכנה ופתח תמונה של אנדותל הקרנית על ידי בחירת קובץ | פתח | . בחרובו
   2. פרוייקט ריבוע בעל אורך מדויק לרוחב הקצה של 100 יקרומטר על התמונה.
      הערה: ניתן להתעלם מהשלבים הבאים של מקטע 3.1.2 אם תוכנת הצפייה מאפשרת הקרנת ריבועי הספירה על התמונה. האורך הצדדי של הכיכר תלוי ברזולוציה של התמונות שצולמו עם המצלמה של המיקרוסקופ ניתן לחשב עם סרגל סרגל.
      1. חתוך את סרגל קנה המידה מהתמונה נלקח עם המיקרוסקופ: בחר את הכלי סימון מלבני בסרגל הכלים או הקש M, לאחר מכן הגבול סרגל סרגל, ולאחר מכן בחר עריכה | חתוך או הקש Ctrl + X.
      2. לחץ על קובץ | חדש (או הקש Ctrl + N). בחלון הקרוב, בחר בלוח ברשימה הנפתחת סוג מסמך . מספר הפיקסלים המוצגים הוא האורך הצדדי של ריבוע הספירה. שים לב לפיקסלים המתאימים לתמונות האחרות ולחץ על הלחצן ' אשר'.
      3. בחר קובץ | חדש (או Ctrl + N). הוסף רוחב ואורך (בפיקסלים) של ריבוע הספירה בחלון הקרוב בהתאם לאורך סרגל הסרגל. בחר צבע רקע לבןולאחר מכן לחץ על אישור.
      4. לחץ על בחר | בחר הכל (או Ctrl + A). בחר באפשרות ' עריכה ' | העתקה (או Ctrl + C).
      5. בחר את התמונה של אנדותל הקרנית שנפתחה בשלב 3.1.1. בחר באפשרות ' עריכה ' | הדבק (או Ctrl + V) כדי להוסיף את הריבוע על התמונה של אנדותל הקרנית.
      6. בחרו בשכבת הריבוע והתאימו את השקיפות. בחר שכבה | סגנון שכבה | אפשרויות מיזוג | קבעו אטימות ל-30% | . אנימבין.
      7. שמור את התמונה עם הכיכר המתוכננת עם האורך הנכון עד קנה המידה של 100 μm. חזור על התמונות האחרות הדרושות לניתוח.
2. העריכו את צפיפות התא האנדותל ופרמטרים מורפולוגיים.
   1. פתח את התמונות עם ריבועים מוקרן ב ImageJ (גירסה 1.50 i) ולהשתמש בתוסף CellCounter כדי לספור את התאים בתוך הכיכר. פתח את ImageJ, בחר קובץ | פתח (או Ctrl + O) | בחרו ' תמונה '.
      הערה: ImageJ ו-CellCounter PlugIn הם freeware זמין להורדה באינטרנט.
   2. בחר תוספים | Cell_Counter | מונה תאים | . לאתחלאת זה הרוזן את תאי האנדותל ותעד את התוצאה. בשני צידי הכיכר, ספור את התאים החתוכים על-ידי קצה הריבוע. אל תספרו תאים חתוכים. בשני הצדדים האחרים
   3. לנתח לפחות שישה ריבועים לקרנית מאזורים שונים (למשל, שלוש תמונות, שני ריבועים לתמונה) ולקבוע את צפיפות תא הקרנית הממוצעת לאנדותל לכל ריבוע (100 יקרומטר²). לשער את צפיפות התא האנדותל לכל 100 יקרומטר² עד 1 מ"מ² על ידי הכפלת על-ידי 100.
3. להערכת שינויים מורפולוגיים, ספירת הרפורמציה (מפגש משותף של ≥ 4 תאים/גבולות תאים במקום שלושה), תצורות שושנת עלים (המראה האופייני של שושנת העלים, חמישה או יותר תאים מסודרים בקרינה סביב תא נהרס ), או אליזרין שטחים אדומים (הרסו תאים) בריבועים המוקרנת.
   הערה: לחלופין, ייתכן שיהיה שימושי להשתמש בריבועים גדולים יותר (למשל, 200 x 200 יקרומטר²) עבור ניתוח מורפולוגית בדגימות שהשתמרו היטב כדי להשיג תוצאות מייצגות יותר.

תוצאות

טכניקת החיתוך המוצג מרמז על הסרה חלקית של רקמת סטרומה, וכתוצאה מכך דגימת קרנית דק יותר ובכך מסטרומה פחות נפיחות (איור 1 ואיור 2). הנפיחות פחות מסטרומה גורמת פחות להטות ולצבוט כוחות שיש להם השפעה שלילית על אנדותל הקרנית, ובכך גורם נמוך יותר ה?...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה להכנת כפתורי הקרנית מפוצל חזירי, אשר מייצגת מודל סטנדרטית ובעלות נמוכה לשעבר הקרנית vivo הקרתל למטרות מחקר⁶. Porcine לחצני הקרנית לפצל הראה ירידה של צפיפות התא האנדותל הדומה הפסדים התאים האנדותל שנצפו בקרנית התורם האנושי שטיפח בבנקים העין במשך שבועיים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland