Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

Resumo

Aqui, um protocolo passo a passo para a preparação e o cultivo de botões córneos rachados suínos é apresentado. Como este modelo organo-tipicamente cultivado da cultura do órgão mostra taxas de morte da pilha dentro de 15 dias, comparável às córneas doadoras humanas, representa o primeiro modelo permitindo o cultivo a longo prazo de córneas não-humanas sem adicionar o Dextran tóxico.

Resumo

A pesquisa experimental sobre as células endoteliais da córnea está associada a várias dificuldades. As córneas doadoras humanas são escassas e raramente estão disponíveis para investigações experimentais, pois são normalmente necessárias para o transplante. As culturas de células endoteliais muitas vezes não se traduzem bem em situações in vivo. Devido às características bioestruturais de córneas não humanas, o inchamento stromal durante o cultivo induz a perda endothelial córnea substancial da pilha, que faz difícil executar o cultivo por um período de tempo prolongado. Os agentes de deswelling tais como o dextrano são usados para neutralizar esta resposta. No entanto, eles também causam significativa perda de células endoteliais. Portanto, estabeleceu-se um modelo de cultura de órgãos ex vivo que não necessitava de agentes de deswelling. Os olhos do porco de um matadouro local foram usados para preparar os botões córneos rachados. Após a trephinação córnea parcial, as camadas exteriores da córnea (epitélio, camada do Bowman, partes do estroma) foram removidas. Isto reduz significativamente a perda endothelial córnea da pilha induzida pelo inchamento stromal maciço e Descemet ' dobra da membrana de s durante períodos mais longos do cultivo e melhora a preservação geral da camada endothelial da pilha. O trefinação córneo completo subseqüente foi seguido pela remoção da tecla córnea rachada do bulbo e do cultivo restantes do olho. A densidade de células endoteliais foi avaliada em tempos de seguimento de até 15 dias após a preparação (i.e., dias 1, 8, 15) utilizando microscopia de luz. A técnica da preparação usada permite uma melhor preservação da camada endothelial da pilha permitida pelo inchamento menos stromal do tecido, que conduz às taxas lentas e lineares do declínio nos botões córneos rachados comparáveis às córneas doadoras humanas. Como este modelo de pesquisa organo-tipicamente cultivado padronizado pela primeira vez permite um cultivo estável por pelo menos duas semanas, é uma alternativa valiosa para as córneas de doadores humanos para futuras investigações de vários fatores externos em relação à sua efeitos sobre o endotélio corneano.

Introdução

Os procedimentos de transplante de córnea estão entre os transplantações mais comumente realizados no mundo¹. Como há uma escassez severa de córneas doadoras humanas, a pesquisa experimental que aborda as células endoteliais corneanas em córneas humanas é difícil de realizar¹. No entanto, a introdução de soluções de irrigação e outras substâncias utilizadas no olho, dispositivos viscoelásticos oftalmológicos, bem como instrumentos e técnicas cirúrgicas (por exemplo, instrumentos e técnicas de facoemulsificação, energia de ultra-som) requer investigações válidas e extensivas a respeito de seus efeitos no endotélio córneo antes do uso clínico.

Poucas alternativas às córneas doadoras humanas existem para a pesquisa. Modelos de pesquisa animal são muito valiosos, mas ao mesmo tempo muito consumo de recursos e cada vez mais questionado eticamente. Uma grande desvantagem das culturas de células in vitro é a sua tradução limitada para o olho humano. Os resultados obtidos a partir de culturas celulares podem ser incongruentes em condições in vivo, pois as células podem sofrer transição mesenquimal endotelial (EMT), resultando em morfologia fibroblástica causada pela perda da polaridade celular e alterações na forma celular e no gene expressão².

Considerando que os modelos ex vivo anteriores relataram períodos de cultivo de até apenas 120 h, uma nova técnica de preparo para estabelecer um modelo de cultura de órgãos endoteliais da córnea porcina, cultivando córneas de suínos frescos por pelo menos 15 dias foi recentemente introduzida^{3 ,4,5,6}. Se o epitélio corneano e as partes do estroma forem removidos (aproximadamente 300 μm no total) da córnea antes do cultivo, o inchaço do estroma é reduzido em botões córneos divididos, resultando em menor perda de células endoteliais e um bem mantido endotelial camada da pilha após até 15 dias, visto que os botões córneos não-rachados mostram a perda endothelial significativa da pilha devido ao inchamento stromal desigual e à formação de Descemet ' dobras de s. Os bancos do olho usam geralmente agentes de deswelling osmótica tais como o dextrano para reduzir o inchamento das córneas antes da transplantação. Entretanto, esses agentes demonstraram induzir aumento da perda^decélulas endoteliais^7,8,9.

Este artigo tem como objetivo Visualizar este modelo de pesquisa ex vivo padronizado em um protocolo detalhado passo a passo, a fim de permitir que futuros investigadores realizem pesquisas sobre o endotélio corneano usando botões córneos divididos. Este modelo representa um método direto para testar substâncias e técnicas utilizadas dentro do olho, tais como dispositivos viscoelásticos oftalmológicos, soluções de irrigação, e energia de ultra-som, ou outros procedimentos onde o endotélio corneano é de interesse.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes éticas de nossa instituição. De acordo com os estatutos do Comitê de revisão ética da nossa instituição, nenhuma aprovação ética teve que ser obtida antes dos experimentos, pois todas as córneas suíno foram obtidas do matadouro local.

1. cultura de órgãos

1. Prepare os olhos de porco.
   1. Do matadouro local, obtenha os olhos do porco que foram removidos logo pós-morte mas antes do tratamento térmico. Transportar os olhos para o laboratório e processá-los dentro de algumas horas. Durante o transporte, mantenha os olhos à temperatura ambiente (aproximadamente 21 ° c) antes do processamento.
   2. Remova todos os anexos orbitais (músculos oculares, conjuntiva, tecido adiposo) antes da desinfecção usando tesouras oculares e fórceps colibri. Separe e descarte todos os olhos com trauma óbvio, danos externos (por exemplo, corte de faca) ou opacidades corneanas visíveis.
   3. Prepare uma solução de 5% de iodo-PBS (1:20) em um copo estéril adicionando 3 mL de iodo de povidona de 7,5% a 57 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Prepare também um copo estéril separado contendo 60 mL de PBS puro.
      Nota: a quantidade total de iodo-PBS-solução usada e o tamanho do copo dependem do número de córneas a ser dissecadas. Cinco a seis olhos exigem aproximadamente 60 mL da solução de 5%-iodo-PBS-ser desinfectados corretamente.
   4. Coloque cinco a seis olhos na solução de 5%-iodo-PBS para um total de 5 min para desinfectar adequadamente a superfície dos olhos. Mexa cuidadosamente a cada minuto para garantir que a superfície dos olhos esteja totalmente submersa e desinfectada completamente na solução de iodo.
   5. Após 5 min, transfira os olhos desinfectados para o copo preparado preenchido com PBS puro. Novamente, mexa cuidadosamente para garantir que a solução de iodo-PBS é lavada longe da superfície dos olhos.
      Nota: Realize esta etapa em um banco limpo para evitar a contaminação dos olhos desinfectados.
2. Prepare placas de cultura celular.
   Nota: execute as seguintes etapas em um banco limpo com fluxo de ar laminar constante.
   1. Thaw 2 mL do soro fetal da vitela (FCS). Encha uma seringa (5 mL) com o FCS usando uma cânula sem corte. Esvazie a seringa através de um filtro de seringa (0,22 μm) para evitar possíveis contaminaçõesbacterianas do FCS em 80 mL de meio de cultura livre de Dextran I (meio essencial mínimo [MEM] com sais de Earle, penicilina/estreptomicina, L-glutamina [200 mM], Anfotericina B [250 μg/mL], tampão de HEPES [1 M] [50x], NaHCO₃e água destilada). Agitar a mistura para garantir a distribuição de substrato mesmo.
   2. Encha cada poço de uma placa da cultura da pilha de 12 poços com 3 mL da mistura do substrato.
3. Realize dissecção e incubação.
   Nota: execute esta etapa em um banco limpo. Não toque no endotélio corneano com nenhum instrumento.
   1. Transfira um bulbo do olho do copo com o PBS no suporte da ampola do olho com a córnea que enfrenta acima e coloc o abaixo de um microscópio cirúrgico oftálmica. Use uma seringa enchida com o NaCl 0,9% para aplicar ligeiramente alguma sucção ao olho sobre o suporte da ampola do olho para fixar o olho na posição para a dissecção.
   2. Use uma trefina (ø 7,5 mm) contendo um embutimento padronizado, que assegura que a profundidade trefinado não exceda 300 μm, para cortar superficialmente na córnea central (Figura 1a).
   3. Use fórceps colibri e um bisturi de uso único com uma lâmina triangular para cortar e remover a parte parcialmente trefinado da córnea horizontalmente através do estroma. Elimine a parte córnea separada consistindo no epitélio córneo, na camada do Bowman, e em uma parte do estroma.
      Nota: manter rigorosamente o sentido de corte horizontal para obter uma espessura ainda maior do estroma remanescente.
   4. Coloc superficially uma sutura 10-0 (10-0 poliamida 6) no estroma para poder diferenciar o endothelial do lado stromal durante os experimentos (Figura 1B). Impeça a penetração do endothelium córneo. Descarte o bulbo ocular se o endotélio for penetrado.
      Nota: a penetração do endotélio corneano com a agulha de sutura será visível, pois o fluido da câmara ocular anterior irá vazar através do canal de sutura.
   5. Use o trephine sem o embutimento para avançar o corte trefinado à profundidade cheia até que a câmara de olho anterior esteja alcangado (Figura 1C). Uma gota distinta na resistência e no líquido que escapa da câmara anterior do olho pode ser percebida após a penetração completa da córnea.
      Nota: Use uma faca do hóquei se o botão córneo rachado permanecer Unido em um lado da tecla córnea rachada após o trephination.
   6. Transferir o botão córneo de divisão obtido, agora constituído por uma parte do estroma (Figura 2), a membrana de Descemet, e o endotélio corneano, para o meio de cultura (meio de cultura I + FCS, ver secção 1,2) na placa de cultura de 12 células bem com o Tagged lado virado para baixo, de modo que o endotélio corneano está virado para cima.
      Nota: se o lado endotelial estiver virado para baixo, o endotélio pode ficar danificado.
   7. Atribua um número individual a cada botão córneo dividido para a identificação durante os follow ups e Rotule os poços na placa da cultura da pilha conformemente.
   8. Incubar as placas de cultura de células preenchidas em uma incubadora condições padrão a uma temperatura de 37 ° c, 5% CO₂ e uma umidade relativa do ar de 95%. Mude o meio de cultura (meio de cultura I + FCS) no dia 8 se um período de incubação de 7 dias for excedido.
      Nota: o procedimento de incubação utilizando botões corneanos divididos foi validado por até 15 dias.

Figura 1: dissecção da córnea porcina para obtenção de botões córneos divididos. (A) após trefinação da córnea usando um trephine com um embutimento para cortar em uma profundidade de 300 μm e a remoção do epitélio e das partes do tecido stromal, (B) uma sutura é coloc superficialmente no estroma sem penetração do córneo endotélio para posterior identificação do lado estromal. (C) a trephinação completa da córnea restante é seguida por (D) a remoção da tecla córnea rachada obtida do bulbo do olho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. microscopia e exame do endotélio

1. Realize um exame não manchado.
   Nota: o exame não manchado pode ser realizado várias vezes (por exemplo, em follow ups semanais no dia 1, 8 e 15). No entanto, a contagem não manchada permite apenas a avaliação da densidade celular endotelial, não parâmetros morfológicos.
   1. Encha 3 ml da solução de sal equilibrada hipotônica (HBSS, veja a composição na tabela de materiais) em cada poço de uma placa da cultura da pilha de 12 poços. Coloc com cuidado uma única tecla córnea da separação em hBSS para induzir o inchamento das pilhas endothelial córneas e para melhorar a visibilidade das pilhas para a contagem da pilha.
      Nota: Certifique-se de que o lado endotelial está voltado para a direção do microscópio. Se for utilizado um microscópio de contraste de fase invertida, o lado endotelial deve ser voltado para baixo. Quando no lugar, a placa da cultura não deve ser movida para impedir dano endothelial da pilha.
   2. Deixe as pilhas incham para 1-2 minutos antes de tomar um retrato do endotélio com a câmera unida ao microscópio. Tome pelo menos três fotografias de pelo menos três áreas diferentes a fim obter uma impressão representativa da condição real do endothelium córneo. Adicione uma barra de escala com o comprimento de escala de 100 μm para posterior análise da densidade da célula endotelial corneana e parâmetros morfológicos.
   3. Para evitar danos osmóticos, retire o botão de córnea da divisão dos hBSS após um máximo de 5 min e transfira-o de volta para o meio de cultura³.
2. Executar o exame manchado.
   Nota: a coloração encerra os experimentos, pois as substâncias de coloração utilizadas são citotóxicas. Portanto, a coloração só pode ser realizada no final do período de observação para a avaliação dos parâmetros morfológicos (figuras de reformação, formações de Roseta, células de coloração vermelha alizarina).
   1. Prepare uma solução de 0,25% de Tripan azul e 0,2% de solução de vermelho S de alizarina para o procedimento de coloração.
      1. Para a solução de 0,25% de Tripan Blue, diluir a solução de azul de Tripan de 0,4% com uma solução de NaCl de 0,9%.
         Nota: por exemplo, para obter 20 ml de uma solução de 0,25% de Tripan Blue, diluir 12,5 ml da solução de azul de Tripan de 0,4% com 7,5 ml da solução de NaCl de 0,9%. A solução azul de Tripan pode ser armazenada à temperatura ambiente durante várias semanas ou meses.
      2. Para obter uma solução de 0,2% de S vermelho de alizarina dissolva 100 MGS do pó vermelho de alizarina s em 50 mL de uma solução de NaCl de 0,9% agitação constante e aquecimento a 50 ° c em uma placa de agitação do ímã com função de aquecimento. Para remover possíveis precipitados, filtre a solução obtida. Ajuste o pH da solução de S vermelho de alizarina ao pH 4,2 adicionando o hidróxido de sódio ou o ácido clorídrico conformemente.
         Nota: antes de cada aplicação da solução de S vermelho alizarina certifique-se de que o pH é corrigido para 4,2 e que não há precipitados na solução. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente. Não guarde a solução durante mais de 4 semanas.
   2. Coloc os botões córneos rachados em placas de Petri com o lado endothelial que enfrenta para cima a fim manchar as pilhas endothelial. Use uma pipeta para gotejamento lentamente a gota da solução azul do Tripan de 0,25% pela gota no endotélio córneo para 90 s.
      Nota: o azul de trypan permite a identificação de pilhas córneas danificadas com uma membrana permeável porque mancha seus núcleos.
   3. Enxaguar com cuidado o botão córneo rachado 3x em 0,9% NaCl em uma taça de vidro pequena. Outra vez, use uma pipeta para gotejamento lentamente a gota da solução do vermelho de 0,2% alizarina pela gota no endotélio córneo para 90 S.
      Nota: o vermelho de alizarin mancha a membrana de Descemet, que ajuda a realçar beiras da pilha em pilhas endothelial córneas não danificadas e realçar pilhas destruídas quando a membrana subjacente de Descemet se torna visível. Também, permite a identificação fácil de áreas destruídas maiores.
   4. Para a examinação do endotélio córneo manchado siga as etapas explicadas para a contagem não manchada na seção 2,1.

3. análise da densidade da célula endotelial corneana e parâmetros morfológicos

1. Projeto contando praças sobre as imagens usando um software de edição de gráficos (tabela de materiais).
   1. Abra o software e abra uma imagem do endotélio corneano selecionando File | Aberto | Selecioneo.
   2. Projetar um quadrado com um comprimento de lado de escala de 100 μm na imagem.
      Nota: as seguintes etapas da seção 3.1.2 podem ser ignoradas se o software de visualização permite a projeção de quadrados de contagem para a imagem. O comprimento lateral do quadrado depende da resolução das imagens tiradas com a câmera do microscópio e pode ser calculada com a barra de escala.
      1. Recorte a barra de escala da fotografia tirada com o microscópio: selecione a ferramenta Letreiro Retangular na barra de ferramentas ou pressione Me, em seguida, limite a barra de escala e selecione Editar | Recortar ou pressione Ctrl + X.
      2. Clique em arquivo | Novo (ou pressione Ctrl + N). Na próxima janela, selecione a área de transferência na lista suspensa tipo de documento . O número de pixels mostrados é o comprimento lateral do quadrado de contagem. Observe os pixels correspondentes para as outras imagens e clique em OK.
      3. Selecione arquivo | Novo (ou Ctrl + N). Insira a largura e o comprimento (em pixels) do quadrado de contagem na próxima janela de acordo com o comprimento da barra de escala. Seleccione cor de fundo brancoe, em seguida, prima OK.
      4. Clique em selecionar | Selecione tudo (ou Ctrl + A). Selecione Editar | Copiar (ou Ctrl + C).
      5. Selecione a imagem do endotélio corneano aberto na etapa 3.1.1. Selecione Editar | Cole (ou Ctrl + V) para inserir o quadrado na foto do endotélio corneano.
      6. Selecione a camada do quadrado e ajuste a transparência. Selecionar camada | Estilo de camada | Opções de mesclagem | Definir opacidade para 30% | Está bem.
      7. Salve a imagem com o quadrado projetado com um comprimento lateral de escala de 100 μm. Repita com as outras imagens necessárias para análise.
2. Avaliar a densidade celular endotelial e os parâmetros morfológicos.
   1. Abra as imagens com os quadrados projetados no ImageJ (versão 1.50 i) e use o plug-in CellCounter para contar as células dentro do quadrado. Abra o ImageJ, selecione arquivo | Abrir (ou Ctrl + o) | Selecione imagem.
      Nota: ImageJ e o PlugIn CellCounter são freeware disponível para download online.
   2. Selecione plugins | Cell_Counter | Contador de células | Inicializaro. Conte as células endoteliais e registre o resultado. Em dois lados do quadrado, conte as células que são cortadas pela borda do quadrado. Não conte células cortadas nos outros dois lados.
   3. Analisar pelo menos seis quadrados por córnea de diferentes áreas (por exemplo, três figuras, dois quadrados por imagem) e determinar a média da densidade de células endoteliais corneanas por quadrado (100 μm²). Extrapolar a densidade de células endoteliais por 100 μm² a 1 mm² multiplicando por 100.
3. Para a avaliação de alterações morfológicas, figuras de reformação de contagem (reunião conjunta de ≥ 4 células/bordas celulares em vez de três), formações de roseta (aspecto característico em forma de Roseta, cinco ou mais células radialmente dispostas em torno de uma célula destruída ), ou áreas vermelhas de alizarina (células destruídas) nos quadrados projetados.
   Nota: Alternativamente, pode ser útil usar quadrados maiores (por exemplo, 200 x 200 μm²) para a análise morfológica em amostras bem preservadas para obter resultados mais representativos.

Resultados

A técnica de dissecção apresentada implica a remoção parcial do tecido estromal, resultando em uma amostra de córnea mais fina e, portanto, menos inchaço estromal (Figura 1 e Figura 2). Menos inchaço estromal induz menos cisalhamento e apertar forças que têm um impacto negativo sobre o endotélio corneano, causando menor taxa de perda de células endoteliais⁶. As teclas córneas rachadas mostram ...

Discussão

Este protocolo fornece um método para a preparação de botões córneos rachados suínos, que represente um modelo endotélio da cultura do órgão endothelial ex vivo estandardizado e de baixo custo para finalidades da pesquisa⁶. Os botões córneos rachados porcine mostraram uma diminuição da densidade endothelial da pilha comparável às perdas endothelial da pilha observadas nas córneas doadoras humanas cultivadas em bancos do olho durante um período de duas semanas⁶

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland