Un modèle de culture d'orgue endothéliale de porc cornée utilisant des boutons cornéens fendus

Résumé

Ici, un protocole étape par étape pour la préparation et la culture des boutons cornéens fendus porcins est présenté. Comme ce modèle de culture d'organes organo-typiquement cultivé montre des taux de mortalité cellulaire dans les 15 jours, comparables aux cornées de donneurs humains, il représente le premier modèle permettant la culture à long terme de cornées non humaines sans ajouter de dextran toxique.

Résumé

La recherche expérimentale sur les cellules endothéliales cornéennes est associée à plusieurs difficultés. Les cornées de donneur humain sont rares et rarement disponibles pour des investigations expérimentales car elles sont normalement nécessaires pour la transplantation. Les cultures cellulaires endothéliales ne se traduisent souvent pas bien dans des situations in vivo. En raison des caractéristiques biostructurales des cornées non humaines, le gonflement stromal pendant la culture induit la perte substantielle de cellules endothéliales cornéennes, qui le rend difficile d'exécuter la culture pendant une période prolongée de temps. Des agents de dégonflement tels que le dextran sont utilisés pour contrecarrer cette réponse. Cependant, ils causent également la perte significative de cellules endothéliales. Par conséquent, un modèle ex vivo de culture d'organe n'exigeant pas des agents degonflement a été établi. Les yeux de porc d'un abattoir local ont été utilisés pour préparer des boutons cornésaux fendus. Après la tréphination cornéenne partielle, les couches extérieures de la cornée (épithélium, couche d'archer, parties du stroma) ont été enlevées. Ceci réduit de manière significative la perte endothéliale cornéenne induite par le gonflement stromal massif et le pliage de membrane de Descemet pendant de plus longues périodes de culture et améliore la conservation générale de la couche cellulaire endothéliale. La tréphination cornée complète suivante a été suivie par l'enlèvement du bouton cornéen fendu de l'ampoule et de la culture restantes d'oeil. La densité cellulaire endothéliale a été évaluée à des heures de suivi allant jusqu'à 15 jours après la préparation (c.-à-d., jours 1, 8, 15) utilisant la microscopie légère. La technique de préparation utilisée permet une meilleure préservation de la couche cellulaire endothéliale permise par moins de gonflement des tissus stromaux, ce qui entraîne des taux de déclin lents et linéaires dans les boutons cornésaux fendus comparables aux cornées des donneurs humains. Comme ce modèle de recherche organo-typiquement cultivé standardisé permet pour la première fois une culture stable pendant au moins deux semaines, il s'agit d'une alternative valable aux cornées des donneurs humains pour les études futures de divers facteurs externes en ce qui concerne leur effets sur l'endothélium cornéen.

Introduction

Les procédures de transplantation cornéenne sont parmi les transplantations les plus couramment effectuées dans le monde¹. Comme il y a une grave pénurie de cornées de donneurs humains, il est difficile d'effectuer¹. Cependant, l'introduction de solutions d'irrigation et d'autres substances utilisées dans l'œil, les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques, ainsi que les instruments et techniques chirurgicaux (p. ex., instruments et techniques de phacoemulsification, énergie par ultrasons) nécessite des investigations valides et étendues concernant leurs effets sur l'endothélium cornéen avant utilisation clinique.

Il existe peu d'alternatives aux cornées de donneurs humains pour la recherche. Les modèles de recherche sur les animaux sont très précieux, mais en même temps très gourmands en ressources et de plus en plus remis en question sur le plan éthique. Un inconvénient majeur des cultures cellulaires in vitro est leur traduction limitée à l'œil humain. Les résultats obtenus à partir de cultures cellulaires peuvent être incongrus à des conditions in vivo, parce que les cellules peuvent subir une transition mésenchymale endothéliale (EMT), résultant en morphologie fibroblaste-like causée par la perte de polarité cellulaire et les changements dans la forme cellulaire et le gène expression².

Alors que les modèles ex vivo précédents ont rapporté des périodes de culture allant jusqu'à seulement 120 h, une nouvelle technique de préparation pour établir un modèle de culture endothéliale endothéliale de porc porc porcin en creusant les cornées fraîches pendant au moins 15 jours a été récemment introduite^{3 ,4,5,6}. Si l'épithélium cornéen et certaines parties du stroma sont retirés (environ 300 m au total) de la cornée avant la culture, l'enflure du stroma est réduite en boutons cornésaux fendus, ce qui entraîne une diminution de la perte de cellules endothéliales et une endothéliale bien entretenue. couche cellulaire après jusqu'à 15 jours, tandis que les boutons cornéens non divisés montrent une perte importante de cellules endothéliales due à un gonflement stromal inégal et la formation des plis de Descemet. Les banques oculaires utilisent habituellement des agents de dégonflement osmotiques tels que le dextran pour réduire l'enflure des cornées avant la transplantation. Cependant, ces agents ont été montrés pour induire la perte endothéliale accrue de cellules^7,8,9.

Cet article vise à visualiser ce modèle de recherche ex vivo standardisé dans un protocole détaillé étape par étape afin de permettre aux futurs chercheurs d'effectuer des recherches sur l'endothélium cornéen à l'aide de boutons cornésiens fendus. Ce modèle représente une méthode simple pour tester les substances et les techniques utilisées dans l'œil, telles que les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques, les solutions d'irrigation et l'énergie par ultrasons, ou d'autres procédures où l'endothélium cornéen est d'intérêt.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices éthiques de notre institution. Conformément aux statuts du comité d'examen éthique de notre institution, aucune approbation éthique n'a dû être obtenue avant les expériences, car toutes les cornées porcines ont été obtenues de l'abattoir local.

1. Culture d'orgue

1. Préparer les yeux de porc.
   1. De l'abattoir local, obtenir des yeux de porc qui ont été enlevés peu de temps après l'autopsie, mais avant le traitement thermique. Transportez les yeux au laboratoire et traitez-les en quelques heures. Pendant le transport, gardez les yeux à température ambiante (environ 21 oC) avant le traitement.
   2. Enlever tous les adnexes orbitaux (muscles oculaires, conjonctive, tissu adipeux) avant la désinfection à l'aide de ciseaux pour les yeux et de forceps colibri. Séparez et jetez tous les yeux avec un traumatisme évident, des dommages externes (p. ex., une coupe au couteau) ou des opacités cornéennes visibles.
   3. Préparer une solution de 5 % d'iode-PBS (1:20) dans une tasse stérile en ajoutant 3 ml d'iode povidone de 7,5 % à 57 ml d'une solution saline saline tamponnée au phosphate (PBS). Préparez également une tasse stérile séparée contenant 60 ml de PBS pur.
      REMARQUE : La quantité totale de solution iode-PBS utilisée et la taille de la tasse dépendent du nombre de cornées à disséquer. Cinq à six yeux nécessitent environ 60 ml de la solution 5%-iode-PBS pour être désinfecté correctement.
   4. Mettez cinq à six yeux dans la solution 5%-iode-PBS pour un total de 5 min pour désinfecter correctement la surface des yeux. Remuer soigneusement chaque minute pour s'assurer que la surface des yeux est complètement immergée et désinfectée complètement dans la solution d'iode.
   5. Après 5 min, transférer les yeux désinfectés dans la tasse préparée remplie de PBS pur. Encore une fois, remuer soigneusement pour s'assurer que l'iode-PBS-solution est lavé de la surface des yeux.
      REMARQUE : Effectuez cette étape sur un banc propre pour empêcher la contamination des yeux désinfectés.
2. Préparer les plaques de culture cellulaire.
   REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes sur un banc propre avec un flux d'air laminaire constant.
   1. Décongeler 2 ml de sérum fœtal de veau (FCS). Remplir une seringue (5 ml) avec le FCS à l'aide d'une canule émoussée. Videz la seringue à travers un filtre à seringues (0,22 m) pour prévenir une éventuelle contamination bactérienne du FCS en 80 ml de milieu de culture sans dextran I (milieu essentiel minimum [MEM] avec sels d'Earle, pénicilline/streptomycine, L-glutamine [200 mM], amphotericin B [250 g/mL], hémato-tampon Hepes [1 M][50x], NaHCO₃, et eau distillée). Agiter le mélange pour assurer une distribution uniforme du substrat.
   2. Remplir chaque puits d'une plaque de culture de cellules de 12 puits avec 3 ml du mélange de substrat.
3. Effectuer la dissection et l'incubation.
   REMARQUE: Effectuer cette étape sur un banc propre. Ne touchez pas l'endothélium cornéen avec des instruments.
   1. Transférer une ampoule oculaire de la tasse avec PBS dans le support de l'ampoule oculaire avec la cornée vers le haut et le placer sous un microscope chirurgical ophtalmique. Utilisez une seringue remplie de 0,9% NaCl pour appliquer légèrement une certaine aspiration à l'œil sur le support de l'ampoule pour fixer l'œil en position de dissection.
   2. Utiliser une trephine (7,5 mm) contenant une inlaye normalisée, ce qui garantit que la profondeur trephined ne dépassera pas 300 m, pour couper superficiellement dans la cornée centrale (figure 1A).
   3. Utilisez des forceps colibri et un scalpel à usage unique avec une lame triangulaire pour couper et enlever la partie partiellement trephined de la cornée horizontalement à travers le stroma. Jetez la partie cornéenne séparée composée de l'épithélium cornéen, de la couche d'archer et d'une partie du stroma.
      REMARQUE : Maintenez strictement la direction horizontale de coupe pour obtenir une épaisseur égale du stroma restant.
   4. Placer superficiellement une suture 10-0 (10-0 polyamide 6) dans le stroma pour être en mesure de différencier l'endothéliale du côté stromal au cours des expériences (Figure 1B). Empêcher la pénétration de l'endothélium cornéen. Jetez l'ampoule oculaire si l'endothélium est pénétré.
      REMARQUE : La pénétration de l'endothélium cornéen avec l'aiguille suturing sera visible, car le fluide de la chambre antérieure d'oeil coulera par le canal de suture.
   5. Utilisez la trephine sans l'inlay pour faire avancer la coupe trephined à pleine profondeur jusqu'à ce que la chambre oculaire antérieure soit atteinte (Figure 1C). Une baisse distincte de la résistance et de la fuite de liquide de la chambre oculaire antérieure peut être perçue après une pénétration complète de la cornée.
      REMARQUE : Utilisez un couteau de hockey si le bouton cornée fendu reste fixé d'un côté du bouton cornéen fendu après la tréphination.
   6. Transférer le bouton cornée fendu obtenu, maintenant composé d'une partie du stroma (figure 2), la membrane du Descemet, et l'endothélium cornéen, dans le milieu de culture (culture moyenne I - FCS, voir section 1.2) dans la plaque de culture de 12 puits de cellules avec le côté étiqueté vers le bas, de sorte que l'endothélium cornéen est tourné vers le haut.
      REMARQUE : Si le côté endothélial est tourné vers le bas, l'endothélium peut être endommagé.
   7. Attribuez un numéro individuel à chaque bouton cornéen fendu pour identification pendant les suivis et étiquetez les puits sur la plaque de culture cellulaire en conséquence.
   8. Incuber les plaques de culture cellulaire remplies dans un incubateur dans des conditions standard à une température de 37 oC, 5 % de CO₂ et une humidité relative de l'air de 95 %. Changer le milieu de culture (culture moyenne I et FCS) le jour 8 si une période d'incubation de 7 jours est dépassée.
      REMARQUE : La procédure d'incubation à l'aide de boutons cornésaux fendus a été validée jusqu'à 15 jours.

Figure 1 : Dissection de la cornée porcine pour obtenir des boutons cornésiaux fendus. (A) Après le tréphination de la cornée à l'aide d'une trephine avec une inlaye à couper en profondeur de 300 m et l'enlèvement de l'épithélium et des parties du tissu stromal, (B) une suture est placée superficiellement dans le stroma sans pénétration de la cornée endothélium pour l'identification ultérieure du côté stromal. (C) Le tréphination complet de la cornée restante est suivi par (D) l'enlèvement du bouton cornéen fendu obtenu de l'ampoule d'oeil. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Microscopie et examen de l'endothélium

1. Effectuer un examen non taché.
   REMARQUE : L'examen non taché peut être effectué plusieurs fois (p. ex., lors d'un suivi hebdomadaire les jours 1, 8 et 15). Cependant, le comptage non taché ne permet que l'évaluation de la densité cellulaire endothéliale, et non des paramètres morphologiques.
   1. Remplir 3 ml de solution de sel hypotonique équilibrée (hBSS, voir composition dans table des matériaux) dans chaque puits d'une plaque de culture de cellules de 12 puits. Placez soigneusement un seul bouton cornéen fendu dans hBSS pour induire le gonflement des cellules endothéliales cornéennes et améliorer la visibilité des cellules pour le comptage cellulaire.
      REMARQUE : Assurez-vous que le côté endothélial fait face à la direction du microscope. Si un microscope de contraste de phase inversée est utilisé, le côté endothélial doit être orienté vers le bas. Pendant qu'elle est en place, la plaque de culture ne doit pas être déplacée pour prévenir les dommages aux cellules endothéliales.
   2. Laissez les cellules gonfler pendant 1-2 min avant de prendre une photo de l'endothélium avec la caméra attachée au microscope. Prenez au moins trois photographies d'au moins trois zones différentes afin d'obtenir une impression représentative de l'état réel de l'endothélium cornéen. Ajoutez une barre d'échelle avec la longueur vraie à l'échelle de 100 m pour l'analyse ultérieure de la densité des cellules endothéliales cornéennes et des paramètres morphologiques.
   3. Pour éviter les dommages osmotiques, retirez le bouton cornéen fendu du hBSS après un maximum de 5 min et transférez-le de nouveau dans le milieu de culture³.
2. Effectuer un examen taché.
   REMARQUE : La coloration met fin aux expériences, car les substances de coloration utilisées sont cytotoxiques. Par conséquent, la coloration ne peut être effectuée qu'à la fin de la période d'observation pour l'évaluation des paramètres morphologiques (figures de réforme, formations de rosettes, cellules tachées rouges alizarines).
   1. Préparer une solution de 0,25% trypan bleu et 0,2% alizarin rouge S solution pour la procédure de coloration.
      1. Pour la solution trypan blue de 0,25 %, diluez la solution bleu trypan de 0,4 % avec une solution NaCl de 0,9 %.
         REMARQUE : Par exemple, pour obtenir 20 ml d'une solution bleu trypan de 0,25 %, diluer 12,5 ml de la solution bleu trypan de 0,4 % avec 7,5 ml de la solution NaCl de 0,9 %. La solution bleu trypan peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs semaines ou mois.
      2. Pour obtenir une solution S rouge alizarin e de 0,2 %, dissoudre 100 mg de la poudre Rouge Alizarin S en 50 ml d'une solution NaCl de 0,9 % sous un mouvement constant et un chauffage à 50 oC sur une plaque d'agitation aimante avec fonction chauffante. Pour éliminer les précipités possibles, filtrez la solution obtenue. Ajuster le pH de la solution Rouge Alizarin S au pH 4.2 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium ou de l'acide chlorhydrique en conséquence.
         REMARQUE : Avant chaque application de la solution Rouge S alizarin, assurez-vous que le pH est corrigé à 4,2 et qu'il n'y a pas de précipités dans la solution. La solution peut être stockée à température ambiante. Ne pas stocker la solution pendant plus de 4 semaines.
   2. Placez les boutons cornés fendus dans les plats Petri avec le côté endothélial tourné vers le haut afin de tacher les cellules endothéliales. Utilisez une pipette pour égoutter lentement la solution trypan bleue de 0,25 % goutte à goutte sur l'endothélium cornéen pendant 90 s.
      REMARQUE: Trypan bleu permet d'identifier les cellules cornées endommagées avec une membrane perméable, car il tache leurs noyaux.
   3. Rincer soigneusement le bouton cornée fendu 3x dans 0.9% NaCl dans un petit bécher en verre. Encore une fois, utilisez une pipette pour égoutter lentement la solution S rouge alizarin de 0,2 % goutte à goutte sur l'endothélium cornéen pendant 90 s.
      REMARQUE : Alizarin rouge S tache la membrane du Descemet, qui aide à mettre en évidence les bordures cellulaires dans les cellules endothéliales cornéennes intactes et à mettre en évidence les cellules détruites lorsque la membrane sous-jacente de Descemet devient visible. En outre, il permet d'identifier facilement les grandes zones détruites.
   4. Pour l'examen de l'endothélium cornéen taché, suivez les étapes expliquées pour le comptage non taché à la section 2.1.

3. Analyse de la densité des cellules endothéliales cornéennes et des paramètres morphologiques

1. Projet de comptage des carrés sur les images à l'aide d'un logiciel d'édition graphique (Table of Materials).
   1. Ouvrez le logiciel et ouvrez une image de l'endothélium cornéen en sélectionnant le fichier. Ouvert à l'ouvert Sélectionnez.
   2. Projetez un carré avec une longueur latérale réelle à l'échelle de 100 m sur l'image.
      REMARQUE : Les étapes suivantes de la section 3.1.2 peuvent être ignorées si le logiciel de visualisation permet de projeter des carrés de comptage sur l'image. La longueur latérale du carré dépend de la résolution des images prises avec la caméra du microscope et peut être calculée avec la barre d'échelle.
      1. Recadrez la barre d'échelle à partir de la photographie prise avec le microscope : sélectionnez l'outil Rectangulaire Demarquee sur la barre d'outils ou appuyez sur M, puis borduredez la barre d'échelle, puis sélectionnez Edit . Crop ou appuyez sur Ctrl x.
      2. Cliquer sur Le Fichier Nouveau (ou appuyez sur Ctrl n. Sur la fenêtre à venir, sélectionnez Clipboard dans la liste de déclassement du type de document. Le nombre de pixels indiqués est la longueur latérale du carré de comptage. Notez les pixels correspondants pour les autres images et cliquez sur OK.
      3. Sélectionner le fichier Nouveau (ou Ctrl n). Insérer la largeur et la longueur (en pixels) du carré de comptage dans la fenêtre à venir en fonction de la longueur de la barre d'échelle. Sélectionnez couleur d'arrière-plan blanc, puis appuyez sur OK.
      4. Cliquez sur Sélectionner Sélectionnez tous (ou Ctrl et A). Sélectionnez Modifier Copie (ou Ctrl et C).
      5. Sélectionnez l'image de l'endothélium cornéen ouvert à l'étape 3.1.1. Sélectionnez Modifier Pâte (ou Ctrl et V) pour insérer le carré sur la photo de l'endothélium cornéen.
      6. Sélectionnez la couche du carré et ajustez la transparence. Sélectionner La couche Style de la couche Options de mélange (en anglais seulement) Définir opacité à 30% OK.
      7. Enregistrer l'image avec le carré projeté avec une longueur latérale réelle à l'échelle de 100 m. Répétez avec les autres images nécessaires à l'analyse.
2. Évaluer la densité cellulaire endothéliale et les paramètres morphologiques.
   1. Ouvrez les images avec les carrés projetés dans ImageJ (Version 1.50i) et utilisez le CellCounter PlugIn pour compter les cellules dans le carré. Ouvrez ImageJ, sélectionnez Fichier Ouvrez (ou Ctrl et O) Sélectionnez Image.
      REMARQUE: ImageJ et le CellCounter PlugIn sont freeware disponibles en téléchargement en ligne.
   2. Sélectionnez Plugins Cell-Counter - France Compteur de cellules (en anglais) Initialize. Comptez les cellules endothéliales et enregistrez le résultat. Sur les deux côtés du carré, compter les cellules qui sont coupées par le bord de la place. Ne comptez pas les cellules coupées des deux autres côtés.
   3. Analyser au moins six carrés par cornée à partir de différentes zones (p. ex., trois photos, deux carrés par image) et déterminer la densité moyenne des cellules endothéliales cornéennes par carré (100 m²). Extrapoler la densité cellulaire endothéliale par 100 m² à 1 mm² en multipliant par 100.
3. Pour l'évaluation des changements morphologiques, compter les chiffres de la réforme (réunion conjointe de 4 cellules/frontières cellulaires au lieu de trois), les formations de rosette (aspect caractéristique en forme de rosette, cinq cellules ou plus disposées radialement autour d'une cellule détruite ), ou zones rouges alizarines (cellules détruites) dans les carrés projetés.
   REMARQUE : Il peut également être utile d'utiliser des carrés plus grands (p. ex., 200 x 200 m²) pour l'analyse morphologique dans des échantillons bien conservés afin d'obtenir des résultats plus représentatifs.

Résultats

La technique de dissection présentée implique l'ablation partielle du tissu stromal, ce qui entraîne un échantillon de cornée plus mince et donc moins de gonflement stromal(figure 1 et figure 2). Moins de gonflement stromal induit moins de cisaillement et de pincement forces qui ont un impact négatif sur l'endothélium cornéen, causant ainsi des taux inférieurs de perte cellulaire endothéliale⁶. L...

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour la préparation des boutons cornésales fendus porcins, qui représente un modèle standardisé et à faible coût ex vivo de culture d'organe cornélial à des fins de recherche⁶. Les boutons cornéséaux fendus de Porc porcont ont montré une diminution de la densité endothéliale de cellules comparable aux pertes endothéliales de cellules observées dans les cornées de donneur humain cultivées dans les banques d'oeil sur une période de deux semaines

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland