Modelo de dolor de osteoartritis inducido por inyección intraarticular de monoyodoacetato en ratas

Resumen

Este estudio describe el método de inyección intraarticular de monoyodoacetato en ratas y discute los comportamientos resultantes relacionados con el dolor y los cambios histopatológicos, que proporcionan referencias para futuras aplicaciones.

Resumen

Los modelos animales actuales de osteoartritis (OA) se pueden dividir en modelos espontáneos y modelos inducidos, los cuales tienen como objetivo simular los cambios fisiopatológicos de la OA humana. Sin embargo, como síntoma principal en la etapa tardía de la OA, el dolor afecta la vida diaria de los pacientes, y no hay muchos modelos disponibles. El modelo inducido por monoyodoacetato (MIA) es el modelo de dolor OA más utilizado, utilizado principalmente en roedores. MIA es un inhibidor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, que causa la muerte de los condrocitos, la degeneración del cartílago, el osteofito y cambios medibles en el comportamiento animal. Además, los cambios en la expresión de la metaloproteinasa de matriz (MMP) y las citoquinas proinflamatorias (IL1 β y TNF α) se pueden detectar en el modelo inducido por MIA. Esos cambios son consistentes con las condiciones fisiopatológicas de OA en humanos, lo que indica que MIA puede inducir un modelo de dolor de OA medible y exitoso. Este estudio tiene como objetivo describir la metodología de inyección intraarticular de MIA en ratas y discutir los comportamientos relacionados con el dolor resultantes y los cambios histopatológicos.

Introducción

La osteoartritis (OA) es la enfermedad articular más común en el mundo, afectando a un estimado de 10-12% de las poblaciones en adultos¹. La articulación más generalmente involucrada es la rodilla, y la OA tiene una mayor incidencia en adultos mayores, especialmente mujeres². Como enfermedad crónica, la OA se desarrolla progresivamente durante décadas en insuficiencia articular con síntomas como pérdida de cartílago, inflamación sinovial, osteofitosis, disminución de la función y dolor crónico³. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la OA es la cuarta enfermedad más prevalente en las mujeres y la octava enfermedad más prevalente en los hombres. Para 2020, la OA puede convertirse en la cuarta enfermedad más incapacitante en humanos⁴. Sin embargo, las terapias actualmente disponibles de OA abordan solo los síntomas y extienden el tiempo hasta la cirugía de reemplazo articular⁵.

La OA espontánea en pacientes humanos a menudo tarda mucho tiempo en producir síntomas clínicos como dolor articular⁶. En las primeras etapas de la OA, el dolor suele ser intermitente y se vuelve más frecuente y severo a medida que la enfermedad progresa, por lo que es la queja predominante de los pacientes⁷. Por lo tanto, se han desarrollado modelos animales extensos para el dolor de OA durante el último medio siglo para promover la terapia de alivio del dolor. Los modelos de OA se han dividido clásicamente en modelos espontáneos e inducidos. Los modelos espontáneos incluyen modelos naturales y modelos modificados genéticamente, que pueden simular más de cerca el curso de la OA primaria en humanos⁸. Los modelos inducidos generalmente se pueden dividir en dos categorías: 1) OA postraumática inducida por cirugía u otro trauma; o 2) inyección intraarticular de sustancias condrotóxicas o proinflamatorias³. Estos modelos sientan las bases para el estudio fisiopatológico de la OA y contribuyen en gran medida al desarrollo de fármacos para reducir el dolor y aumentar la función.

Recientemente, el inductor más utilizado para el modelado de OA es el monoyodoacetato (MIA). La MIA, un inhibidor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, puede causar cambios en la matriz del cartílago, degradación, pérdida de cartílago, sinovitis y otros cambios, que son similares a los cambios patológicos de la osteoartritis humana⁹. Se ha observado que la inyección intraarticular de MIA indujo dolor continuo a los 28 días después de la administración de MIA, lo que indica que el modelo de MIA puede ser útil para investigar el dolor nociceptivo crónico^10,11,12. En este estudio, las ratas macho Sprague-Dawley recibieron inyecciones intraarticulares con 0.5, 1.5 o 3 mg de MIA en las articulaciones de la rodilla. La gravedad del dolor articular inducido por MIA se midió mediante la evaluación de la sensibilidad mecánica y térmica a los 1, 7, 14, 21, 28 y 35 días después de las inyecciones. Sobre esta base, se seleccionaron 1,5 mg de MIA como concentración final para evaluar los patrones de marcha y los cambios histológicos a los 28 días después de las inyecciones.

Protocolo

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Normas Médicas y Ética de la Universidad Médica China de Zhejiang y están de acuerdo con la legislación de China sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio.

1. Inyección intraarticular de monoyodoacetato en la rodilla

1. Después de una semana de aclimatación, divida aleatoria y equitativamente 40 ratas Sprague-Dawley macho que pesan 180-200 g (4-5 semanas de edad) en cuatro grupos (n = 10 ratas / grupo).
   NOTA: Las ratas en el grupo control serán inyectadas intraarticularmente con 50 μL de solución salina, mientras que las ratas en los grupos experimentales serán tratadas con 0.5, 1.5 o 3 mg de MIA disueltos en 50 μL de solución salina, respectivamente.
2. El día de la inyección, preparar la solución de MIA en solución salina estéril (NaCl al 0,9%) a una concentración de 15, 30 y 60 mg/ml y una solución de pentobarbital al 10% en solución salina estéril (NaCl al 0,9%).
   PRECAUCIÓN: MIA tiene un efecto extremadamente destructivo sobre la membrana mucosa, el tracto respiratorio superior, el ojo y la piel y otros tejidos. Por lo tanto, se recomienda mascarilla y guantes al preparar una solución.
3. Anestesiar ratas mediante inyección intraperitoneal de ketamina a 60 mg/kg y xilazina a 5 mg/kg (ambas preparadas en solución salina). Sujete suavemente los dedos de los pies de la rata con una pinza para confirmar la anestesia.
4. Coloque la rata con la espalda hacia abajo. Afeite la rodilla y limpie el área que rodea la articulación de la rodilla con alcohol.
5. Mantenga la rodilla en un ángulo de 90 ° y revele el tendón rotuliano blanco debajo de la rótula. Presione el tendón rotuliano con la yema del dedo para encontrar el espacio debajo de la rótula.
6. Elija la unión del espacio y el tendón rotuliano lateral como sitio de inyección. Luego, inserte la aguja 26 G verticalmente en el sitio aproximadamente 5 mm. No se debe sentir resistencia cuando la aguja está en el espacio articular.
   NOTA: Es importante mantener la aguja perpendicular al lugar de la inyección.
7. Inyecte 50 μL de solución salina o MIA en la cavidad articular. Saque lentamente la aguja y envuelva un trozo de gasa alrededor del sitio de inyección para minimizar el reflujo y las fugas. Después de la recuperación de la anestesia, retire la gasa.
8. Pruebe el comportamiento relacionado con el dolor a los 1, 7, 14, 21, 28 y 35 días después de las inyecciones, tal como se describe en la sección 2.

2. Evaluaciones de comportamiento

1. Umbral de retirada mecánica (MWT)
   NOTA: El MWT se midió mediante la prueba de von Frey¹³ y el observador fue cegado a las inyecciones que los animales habían recibido.
   1. Coloque una rata en una jaula de plástico elevada (17 cm x 11 cm x 13 cm) con una base de malla de alambre suspendida a 50 cm sobre una mesa. Asegúrese de que el entorno de prueba sea silencioso y dele a la rata 30 minutos para adaptarse al entorno.
   2. Presione la aguja de von Frey perpendicularmente sobre la superficie plantar de la pata trasera de cada rata. Aumentar la presión gradualmente (aproximadamente 20 g/s) y linealmente hasta que se levante la pata o se lama la pata.
   3. Utilice una fuerza inferior al umbral anterior para asegurarse de que el umbral es la fuerza de retirada mínima. Pruebe cada rata más de tres veces, con al menos 3-5 minutos de diferencia.
   4. Registre la fuerza mínima que provoca un reflejo de retirada de la pata. Promedie los datos como el MWT de ratas.
2. Latencia de retirada térmica (TWL)
   NOTA: El TWL se midió utilizando el aparato de prueba plantar (Tabla de Materiales) y el observador fue cegado a las inyecciones que los animales habían recibido.
   1. Coloque una caja de plexiglás (60 cm x 20 cm x 14 cm, dividida en 6 compartimentos) en una placa de vidrio de 3 mm de espesor y coloque ratas en la caja (una en cada compartimento). Asegúrese de que el ambiente sea silencioso y que la temperatura ambiente sea constante.
   2. Dé a las ratas 30 minutos para adaptarse al entorno de prueba.
   3. Calibre el estímulo térmico a través del radiómetro infrarrojo. Ajuste la intensidad infrarroja deseada en 70 unidades.
   4. Coloque el emisor/detector de infrarrojos en el recipiente directamente debajo del centro de la pata que se está probando.
   5. Pulsando el botón START . El temporizador se iniciará automáticamente. El controlador apagará automáticamente la luz infrarroja y detendrá el temporizador por completo tan pronto como se produzca el movimiento de la pata.
   6. Registre el tiempo de reacción cuando aparece la retirada de la pata y el lamido de la pata.
      NOTA: Una respuesta positiva para la prueba se considera como la retirada de la pata y lamer la pata. Si solo se produce la retirada de la pata, debe considerarse como un movimiento voluntario de la rata en lugar de una respuesta positiva.
   7. Repita la prueba más de tres veces. Promedie los datos como el TWL de ratas.
      NOTA: Cada exposición al calor radiante no debe exceder los 20 s. Las estimulaciones infrarrojas en la misma pata trasera deben estar separadas por al menos 3-5 minutos.
3. Análisis de patrones de marcha
   NOTA: Los análisis del patrón de marcha se midieron utilizando un sistema de imágenes (Tabla de materiales) y el observador fue cegado a las inyecciones que los animales habían recibido.
   1. Ajuste la longitud del compartimento para caminar usando las perillas en ambos extremos del compartimiento para caminar a la longitud adecuada para ratas (por ejemplo, 61 cm).
   2. Coloque una rata en el compartimiento para caminar y entrene a las ratas para que hagan carreras ininterrumpidas durante al menos 5 ciclos de pasos a una velocidad de 18 cm / s antes del experimento formal.
      NOTA: Cuando se coloca una rata por primera vez en el compartimiento para caminar, la velocidad se puede ajustar a unos 20 cm / s y apagarse cuando se corre alrededor de 2 s. A continuación, ajuste la velocidad a 18 cm/s. Golpee suavemente la parte posterior de la rata con la partición, si la rata se detiene o se retira mientras camina. Trate de reducir la velocidad gradualmente de 18 cm / s a 10 cm / s. Si la rata finalmente no realiza la prueba, es aceptable elegir otra rata para la prueba.
   3. Aumente lentamente la velocidad de la cinta de correr hasta que alcance la velocidad objetivo (18 cm / s). Capture al menos 5 s de video del movimiento continuo de la rata con la cámara de video digital de alta velocidad montada debajo del cinturón transparente de la cinta de correr.
   4. Pruebe cada rata con al menos 5 minutos de diferencia para obtener al menos tres carreras ininterrumpidas.
   5. Dibuje un "cuadro delimitador" para definir el límite de la imagen de paseo de animales en el software de imágenes e ingrese la velocidad de ejecución para cada video. Seleccione videos como grupo y procese videos automáticamente por el software. Después de procesar videos, el software generará varias hojas de cálculo para informar los índices de marcha, incluida la postura, el balanceo, el frenado, la propulsión, la cadencia, la secuencia de pasos, etc.
   6. Calcule el área total de la pata (cm²), la longitud promedio de la zancada (cm) y la longitud de la zancada unitaria.
      NOTA: El área total de la pata es la media del área total de cuatro patas de cada grupo de ratas y el área de la pata se define como el área máxima de la pata en contacto con la cinta durante la fase de postura del ciclo de paso. La longitud de zancada es la distancia entre los contactos iniciales de la misma pata en una zancada completa. Unidad de longitud de zancada = longitud media de zancada (cm)/longitud del cuerpo (cm).

3. Análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos

1. Eutanasia en ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a 150 mg/kg (preparado en solución salina). Resecar las articulaciones de la rodilla inmediatamente para los análisis histológicos.
2. Fijar las articulaciones en formalina al 10% durante 24 h, descalcificar con EDTA al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 8 semanas y luego incrustar las juntas en parafina.
   PRECAUCIÓN: La formalina puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Debe manipularse con capucha.
3. Secciona las juntas incrustadas en parafina a 3 mm de espesor con un micrótomo y flota en un baño de agua a 40 °C que contiene agua destilada.
4. Transfiera secciones a portaobjetos de vidrio. Seque los portaobjetos durante la noche y guárdelos a temperatura ambiente (RT) para continuar con la siguiente tinción.
5. Colocar los portaobjetos en un horno a 60 ºC durante 4 h para desparafinar.
6. Sumerja las diapositivas sucesivamente en xileno, xileno, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 80% etanol y 75% etanol durante 5 min, respectivamente, en RT.
7. Secciones de tinción con hematoxilina y eosina (H&E), safranina-O (SO) y hematoxilina azul alciana (ABH), así como anticuerpos contra colágeno tipo II de rata (Col2), colágeno tipo X (Col10) y metaloproteinasa de matriz 13 (MMP13), como se describe en los pasos 3.8-3.12.
8. Tinción H&E
   1. Enjuague las diapositivas con_H2Odesionizado durante 3 min. Diapositivas de tinción con hematoxilina durante 3-5 min.
   2. Enjuague los portaobjetos con H₂O 3x desionizado, 1 min cada uno, hasta que no quede hematoxilina en la superficie.
   3. Portaobjetos de manchas con eosina durante 30 s. Luego, enjuague los portaobjetos con H₂O 3x desionizado, 1 min cada uno, hasta que no quede eosina en la superficie.
   4. Sumerja los portaobjetos en amoníaco al 0,1% durante 10-20 s. Luego, enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una.
   5. Sumerja las diapositivas sucesivamente en etanol al 95%, etanol al 100%, xileno, xileno y xileno durante 1 minuto, respectivamente.
   6. Cubra las diapositivas con resina neutra.
9. Tinción SO
   1. Enjuague las diapositivas con_H2Odesionizado durante 3 min. Diapositivas de tinción con hematoxilina durante 3-5 min.
   2. Diferenciar rápidamente en alcohol ácido al 1% (aproximadamente 3 s). Luego, enjuague los portaobjetos con H₂O 3x desionizado, 1 min cada uno, hasta que no quede hematoxilina en la superficie.
   3. Portaobjetos de manchas con solución Fast Green (FCF) durante 5 min. Luego, enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una.
   4. Diapositivas de manchas con SO durante 1-2 min. Luego, enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una.
   5. Enjuague los portaobjetos con ácido acético al 1% durante 1-2 min para eliminar el FCF residual. Enjuague las diapositivas con H₂O desionizado durante 1 min.
   6. Sumerja las diapositivas sucesivamente en etanol al 95%, etanol al 100%, xileno, xileno y xileno durante 1 minuto, respectivamente.
   7. Cubra las diapositivas con resina neutra.
10. Tinción ABH
    1. Enjuague las diapositivas con_H2Odesionizado durante 3 min. Sumerja las diapositivas en alcohol ácido al 1% durante 30 s y escurra brevemente sobre una toalla de papel (no enjuague).
    2. Sumergir las diapositivas en ABH durante 1 h. Luego, enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una, hasta que no quede ABH en la superficie.
    3. Diferenciar rápidamente en alcohol ácido al 1% (aproximadamente 3 s). Enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una.
    4. Sumerja los toboganes en agua al 0,5% de amonio durante 15 s. Luego, enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una.
    5. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% durante 1 minuto. Sumerja los portaobjetos en la solución de eosina / naranja G durante 1,5 min.
    6. Sumerja las diapositivas sucesivamente en etanol al 95%, etanol al 100%, xileno, xileno y xileno durante 1 minuto, respectivamente.
    7. Cubra las diapositivas con resina neutra.
11. Examinar todas las diapositivas bajo un microscopio y calificar estadísticamente en una escala de 0-13 por observación doble ciego, de acuerdo con el sistema de puntuación de Mankin¹⁴.
12. Inmunohistoquímica
    1. Enjuague las diapositivas con_H2Odesionizado durante 3 min.
    2. Sumerja los portaobjetos en citrato de sodio a 0,1 M y coloque los portaobjetos en un horno a 60 °C durante 4 h para recuperar el antígeno.
    3. Sumerja las diapositivas en Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 min. Luego, enjuague las diapositivas con PBS 2x, 3 min cada una.
    4. Incubar secciones en solución de_H2O2al 3% en metanol a RT durante 10 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Enjuague las diapositivas con PBS 2x, 3 min cada una.
    5. Incubar secciones con suero de cabra al 5% en PBS durante 30 min a RT para bloquear cualquier unión no específica. Enjuague las diapositivas con PBS 2x, 3 min cada una.
    6. Incubar secciones durante la noche a 4 °C con 100 μL de anticuerpos primarios diluidos en PBS (1:1.000) contra colágeno tipo II de rata (Col2), colágeno tipo X (Col10) y metaloproteinasa de matriz 13 (MMP13). Enjuague las diapositivas con PBS 2x, 3 min cada una.
    7. Incubar secciones con 100 μL de anticuerpo secundario diluido en PBS (1:1.000) (secundario antiratón de cabra o secundario de ratón de cabra) durante 20 min en RT. Enjuague las diapositivas con PBS 2x, 3 min cada una.
    8. Incubar secciones con 100 μL de solución de trabajo de 3,3′-diaminobencidina (DAB). Controle la reacción a medida que la reacción cromogénica vuelve marrones los sitios del epítopo.
       PRECAUCIÓN: DAB es un carcinógeno. Siempre use guantes y trabaje con una capucha cuando trabaje con DAB.
       NOTA: El tiempo de desarrollo del color puede variar de unos pocos segundos a 10 minutos.
    9. Tan pronto como se desarrolle un color marrón en las secciones, enjuague las diapositivas con H₂O 2x desionizado, 3 min cada una.
    10. Sumerja los portaobjetos en hematoxilina durante 1-2 minutos para contrarrestar las diapositivas. Luego, enjuague las diapositivas con H₂O 3x desionizado, 1 min cada una.
    11. Sumerja las diapositivas sucesivamente en etanol al 95%, etanol al 100%, xileno, xileno y xileno durante 1 minuto, respectivamente.
    12. Cubra las diapositivas con resina neutra.
    13. Observe el color de la tinción de anticuerpos en las secciones bajo un microscopio.

Resultados

Con esta metodología, establecimos un modelo de dolor de OA en la rata y detectamos los cambios resultantes. MWT y TWL reflejaron alodinia mecánica e hiperalgesia térmica, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1, MIA indujo alodinia mecánica e hiperalgesia térmica presente de manera dependiente de la dosis. Sorprendentemente, la disminución de MWT alcanzó un pico de 21 días a 28 días, y luego se recuperó, lo que sugiere que la reparación articular puede ocurrir en esta eta...

Discusión

El modelo de rata de OA inducida por MIA es un modelo bien establecido y ampliamente utilizado. La inyección intraarticular de MIA causa inicialmente inflamación severa y aguda, lo que da lugar a la fase más larga y degenerativa de OA^17,18. En esta investigación, medimos la sensibilidad nociceptiva mediante MWT y TWL, y evaluamos las alteraciones de la marcha con un sistema de imagen. Informes anteriores encontraron que la inyección de MIA podría elevar la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Collagen II antibody	Abcam(UK)	34712	Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)
Anti-Collagen X (Col10) antibody	Abcam(UK)	49945	Primary antibody for IHC
DigiGait Imaging System	Mouse Specifics (Boston, MA, USA)		Equipment for gait patterns analyses
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
MIA	Sigma-Aldrich	I4386-10G	powder
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks.
Plantar Test apparatus	UgoBasile (Italy)	37370	Equipment for TWL assay
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)	RR037A	Extracte total RNA from cultured cells
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections.
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor