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要約

本研究では、ラットにおけるモノヨード酢酸の関節内注射法について述べ、結果として生じる疼痛関連行動および組織病理学的変化について議論し、将来の応用の参考となる。

要約

変形性関節症(OA)の現在の動物モデルは、自発モデルと誘発モデルに分けることができ、どちらもヒトOAの病態生理学的変化をシミュレートすることを目的としています。しかし、OA後期の主な症状として、痛みは患者の日常生活に影響を与え、利用可能なモデルは多くありません。モノヨードアセテート(MIA)誘発モデルは、最も広く使用されているOA疼痛モデルであり、主にげっ歯類で使用されます。MIAはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であり、軟骨細胞死、軟骨変性、骨棘、および動物の行動の測定可能な変化を引き起こします。さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)および炎症誘発性サイトカイン(IL1 βおよびTNF α)の発現変化は、MIA誘発モデルで検出できます。これらの変化は、ヒトにおけるOA病態生理学的状態と一致しており、MIAが測定可能で成功したOA疼痛モデルを誘発し得ることを示している。この研究は、ラットにおけるMIAの関節内注射の方法論を説明し、結果として生じる痛みに関連する行動と組織病理学的変化について議論することを目的としています。

概要

変形性関節症(OA)は世界で最も一般的な関節疾患であり、成人の推定10〜12%の人口に影響を及ぼします1。最も一般的に関与する関節は膝であり、OAは高齢者、特に女性の発生率が高くなっています2。慢性疾患として、OAは数十年にわたって徐々に進行し、軟骨喪失、滑膜炎症、骨植物症、機能低下、慢性疼痛などの症状を伴う関節不全に発展します3。世界保健機関(WHO)によると、OAは女性で4番目に蔓延している病気であり、男性で8番目に蔓延している病気です。2020年までに、OAはヒトで4番目に障害のある病気になる可能性があります4。しかし、現在利用可能なOA療法は症状のみに対処し、関節置換術までの時間を延長します5。

ヒト患者の自発的OAは、関節関連疼痛などの臨床症状を引き起こすのに長い時間がかかることが多い6。OAの初期段階では、痛みは通常断続的であり、病気が進行するにつれてより頻繁かつ重篤になり、患者の主な不満になります7。そのため、疼痛緩和療法を促進するために、過去半世紀にわたってOA疼痛の広範な動物モデルが開発されてきました。OAモデルは、古典的に自発モデルと誘発モデルに分けられてきた。自発的モデルには、自然発生モデルと遺伝子組み換えモデルが含まれ、ヒトの一次OAの経過をより厳密にシミュレートできます8。誘発モデルは、一般に2つのカテゴリーに分けることができる:1)手術または他の外傷によって誘発される心的外傷後OA;または2)軟骨毒性または炎症誘発性物質の関節内注射3。これらのモデルはOAの病態生理学的研究の基礎を築き、疼痛軽減や機能向上のための薬剤開発に大きく貢献しています。

最近、OAモデリングに最も広く使用されている誘導物質はモノヨードアセテート(MIA)です。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるMIAは、軟骨基質の変化、分解、軟骨の喪失、滑膜炎、およびヒト変形性関節症の病理学的変化と同様のその他の変化を引き起こす可能性があります9。MIAの関節内注射は、MIA投与後28日目に継続的な疼痛を誘発したことが注目されており、MIAモデルが慢性侵害受容性疼痛の調査に有用である可能性があることを示している10、11、12。この研究では、雄のSprague-Dawleyラットは、膝関節に0.5、1.5、または3 mgのMIAを含む関節内注射を受けました。MIA誘発性関節痛の重症度は、注射後1、7、14、21、28、および35日目の機械的および熱的感受性の評価によって測定されました。これに基づいて、注射後28日目の歩行パターンと組織学的変化を評価するための最終濃度として1.5 mgのMIAが選択されました。

プロトコル

動物を対象とする手順は、浙江中国医科大学の医療規範および倫理委員会によって承認されており、実験動物の使用と世話に関する中国の法律に準拠しています。

1.膝へのモノヨードアセテートの関節内注射

  1. 1週間の順応後、体重180〜200 g(4〜5週齢)の雄のSprague-Dawleyラット40匹をランダムかつ均等に4つのグループ(n = 10匹/グループ)に分けます。.
    注:対照群のラットは関節内注射されます 50μLの生理食塩水、実験群のラットは0.5、1.5、または3mgのMIAで治療されます それぞれ50μLの生理食塩水に溶解しました。
  2. 注射当日、15、30、60 mg / mL濃度の滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)中のMIA溶液と、滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)中の10%ペントバルビタール溶液を新たに調製します。
    注意:MIAは、粘膜、上気道、眼、皮膚、その他の組織に非常に破壊的な影響を及ぼします。したがって、溶液を調製するときはマスクと手袋をお勧めします。
  3. 60 mg / kgのケタミンと5 mg / kgのキシラジン(どちらも生理食塩水で調製)の腹腔内注射によってラットを麻酔します。.ラットのつま先をピンセットでそっと固定して麻酔を確認します。
  4. ラットを背中を下に向けて置きます。膝を剃り、膝関節の周囲をアルコールで拭きます。
  5. 膝を90°の角度に保ち、膝蓋骨の下の白い膝蓋骨腱を明らかにします。膝蓋骨腱を指先で押して、膝蓋骨の下の隙間を見つけます。
  6. 注入部位としてギャップと外側膝蓋腱の接合部を選択します。次に、26Gの針を約5mmの部位に垂直に挿入します。針が関節腔にあるときは抵抗を感じないでください。
    注意: 針を注射部位に対して垂直に保つことが重要です。
  7. 50 μLの生理食塩水またはMIA溶液を関節腔に注入します。ゆっくりと針を引き出し、逆流と漏れを最小限に抑えるために注射部位にガーゼを巻き付けます。麻酔が回復したら、ガーゼを外します。
  8. セクション2で説明されているように、注射後1、7、14、21、28、および35日目に痛みに関連する行動をテストします。

2.行動評価

  1. 機械的引き出ししきい値(MWT)
    注:MWTはフォンフライテスト13 によって測定され、観察者は動物が受けた注射を知らされていませんでした。
    1. ラットを、テーブルから50 cm上に吊り下げられた金網のベースを備えた高架プラスチックケージ(17 cm x 11 cm x 13 cm)に入れます。テスト環境が静かであることを確認し、ラットに環境に適応するために30分を与えます。
    2. フォンフレイ針を各ラットの後足の足底面に垂直に押します。足の持ち上げまたは足の舐めが発生するまで、圧力を徐々に(約20 g / s)直線的に上げます。
    3. 前のしきい値よりも低い力を使用して、しきい値が最小の撤退力であることを確認します。各ラットを少なくとも3〜5分間隔で3回以上テストします。
    4. 足の離脱反射を誘発する最小の力を記録します。ラットのMWTとしてデータを平均します。
  2. 熱離脱遅延 (TWL)
    注:TWLは足底試験装置(材料表)を使用して測定され、観察者は動物が受けた注射を知らされていませんでした。
    1. プレキシガラスの箱(60 cm x 20 cm x 14 cm、6つのコンパートメントに分けて)を厚さ3 mmのガラス板に置き、ラットを箱に入れます(各コンパートメントに1つずつ)。環境が静かで、室温が一定であることを確認してください。
    2. テスト環境に適応するためにラットに30分を与えます。
    3. 赤外線放射計を介して熱刺激を校正します。希望の赤外線強度を70単位に設定します。
    4. 赤外線エミッター/検出器を、テストする足の中央の真下の容器に置きます。
    5. スタートボタンを押します。タイマーが自動的に開始されます。コントローラーは、足の動きが発生するとすぐに赤外線を自動的にオフにし、タイマーを完全に停止します。
    6. 足の撤退と足の舐めの出現時の反応時間を記録します。
      注:テストの肯定的な反応は、足の撤退と足の舐めと見なされます。足の離脱のみが起こる場合、それは肯定的な反応ではなくラットの随意運動と見なされるべきです。
    7. テストを3回以上繰り返します。ラットのTWLとしてデータを平均します。
      注意: 輻射熱の各暴露は20秒を超えてはなりません。同じ後足での赤外線刺激は、少なくとも3〜5分離れている必要があります。
  3. 歩行パターン分析
    注:歩行パターン分析はイメージングシステム(材料表)を使用して測定され、観察者は動物が受けた注射を知らされていませんでした。
    1. 歩行コンパートメントの両端にあるノブを使用して、ウォーキングコンパートメントの長さをラットに適した長さ(61 cmなど)に調整します。
    2. ラットを歩行コンパートメントに入れ、正式な実験の前に、18 cm / sの速度で少なくとも5ステップサイクル中断することなく走るようにラットを訓練します。
      注:ラットを最初に歩行コンパートメントに配置すると、速度は約20 cm / sに設定され、約2秒走るときに停止できます。次に、速度を18 cm / sに設定します。ラットが歩行中に一時停止または後退する場合は、パーティションでラットの背中をそっとタップします。速度を18 cm / sから10 cm / sに徐々に下げてみてください。ラットが最終的にテストを実行できない場合は、テスト用に別のラットを選択することが許容されます。
    3. トレッドミルが目標速度(18 cm / s)に達するまで、トレッドミルの速度をゆっくりと上げます。透明なトレッドミルベルトの下に取り付けられた高速デジタルビデオカメラを使用して、ラットの連続的な動きの少なくとも5秒のビデオをキャプチャします。
    4. 各ラットを少なくとも5分間隔でテストして、少なくとも3回の中断のない実行を取得します。
    5. 「バウンディングボックス」を描画して、イメージングソフトウェアで動物の散歩画像の境界を定義し、各ビデオの実行速度を入力します。ビデオをグループとして選択し、ソフトウェアによってビデオを自動的に処理します。ビデオを処理した後、ソフトウェアはいくつかのスプレッドシートを出力して、スタンス、スイング、ブレーキ、推進力、ケイデンス、ステップシーケンスなどの歩行インデックスを報告します。
    6. 総足面積(cm2)、平均歩幅(cm)、および歩幅を結合します。
      注:総足面積は、ラットの各グループの4つの足の総面積の平均であり、足面積は、ステップサイクルのスタンスフェーズ中にトレッドミルと接触する最大足面積として定義されます。ストライドの長さは、1つの完全なストライドにおける同じ足の最初の接触間の距離です。単位歩幅=平均歩幅(cm)/体長(cm)。

3. 病理組織学的・免疫組織化学的解析

  1. ペントバルビタールナトリウムを150 mg / kg(生理食塩水で調製)で腹腔内注射することにより、ラットを安楽死させます。.組織学的分析のためにすぐに膝関節を切除します。
  2. 関節を10%ホルマリンで24時間固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の10%EDTAで8週間脱灰してから、関節をパラフィンに埋め込みます。
    注意: ホルマリンは、目、皮膚、気道の炎症を引き起こす可能性があります。.フードで取り扱う必要があります。
  3. パラフィン包埋接合部をミクロトームで厚さ3 mmで切片化し、蒸留水を入れた40°Cの水浴に浮かべます。
  4. セクションをスライドガラスに移します。スライドを一晩乾燥させ、スライドを室温(RT)で保存して、次の染色を継続します。
  5. スライドを60°Cのオーブンに4時間入れて脱パラフィンします。
  6. スライドをキシレン、キシレン、100%エタノール、100%エタノール、95%エタノール、80%エタノール、75%エタノールにそれぞれRTで5分間連続して浸します。
  7. ステップ3.8−3.12に記載されているように、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)、サフラニン-O(SO)およびアルシアンブルーヘマトキシリン(ABH)、ならびにラットII型コラーゲン(Col2)、X型コラーゲン(Col10)およびマトリックスメタロプロテイナーゼ13(MMP13)に対する抗体で切片を染色する。
  8. H&E染色
    1. スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。スライドをヘマトキシリンで3〜5分間染色します。
    2. ヘマトキシリンが表面に残らなくなるまで、脱イオンH2O 3xでそれぞれ1分間すすぎます。
    3. スライドをエオジンで30秒間染色します。次に、表面にエオジンが残らなくなるまで、脱イオンH2O 3xでそれぞれ1分間スライドします。
    4. スライドを0.1%アンモニアに10〜20秒間浸します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。
    5. スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。
    6. スライドを中性樹脂で覆います。
  9. SO染色
    1. スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。スライドをヘマトキシリンで3〜5分間染色します。
    2. 1%酸性アルコール(約3秒)ですばやく区別します。次に、ヘマトキシリンが表面に残らなくなるまで、脱イオンH2O 3xでそれぞれ1分間スライドします。
    3. スライドをファストグリーン(FCF)溶液で5分間染色します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。
    4. スライドをSOで1〜2分間染色します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。
    5. スライドを1%酢酸で1〜2分間すすぎ、残留FCFを除去します。スライドを脱イオンH2Oで1分間すすぎます。
    6. スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。
    7. スライドを中性樹脂で覆います。
  10. ABH染色
    1. スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。スライドを1%酸性アルコールに30秒間浸し、ペーパータオルで簡単に水気を切ります(すすがないでください)。
    2. スライドをABHに1時間浸します。次に、ABHが表面に残らなくなるまで、脱イオンH2O3xでスライドをそれぞれ1分間すすぎます。
    3. 1%酸性アルコール(約3秒)ですばやく区別します。スライドを脱イオンH2O 3x、それぞれ1分間すすぎます。
    4. スライドを0.5%アンモニウム水に15秒間浸します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。
    5. スライドを95%エタノールに1分間浸します。スライドをエオシン/オレンジG溶液に1.5分間浸します。
    6. スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。
    7. スライドを中性樹脂で覆います。
  11. すべてのスライドを顕微鏡で調べ、マンキンのスコアリングシステム14に従って、二重盲検観察によって0〜13のスケールで統計的に等級付けします。
  12. 免疫組織化学
    1. スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。
    2. スライドを0.1 Mクエン酸ナトリウムに浸し、スライドを60°Cのオーブンに4時間入れて抗原を回収します。
    3. スライドをPBSの0.3%トリトンX-100に10分間浸します。次に、スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。
    4. RTのメタノール中の3%H2 O2溶液中で切片を10分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断します。スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。
    5. 切片をPBS中の5%ヤギ血清でRTで30分間インキュベートし、非特異的結合をブロックします。スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。
    6. ラットII型コラーゲン(Col2)、X型コラーゲン(Col10)、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ13(MMP13)に対する100 μLのPBS希釈(1:1,000)一次抗体を用いて、切片を4°Cで一晩インキュベートします。スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。
    7. 100 μLのPBS希釈(1:1,000)二次抗体(ヤギ抗マウス二次抗体またはヤギ抗マウス二次抗体)で切片をRTで20分間インキュベートします。 スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。
    8. 切片を100 μLの3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)作業溶液でインキュベートします。発色反応がエピトープ部位を茶色に変えるので、反応を監視します。
      注意:DABは発がん性物質です。DABを使用するときは、常に手袋を着用し、フードをかぶって作業してください。
      注意: 発色の時間は数秒から10分までさまざまです。
    9. 切片に茶色が発達したらすぐに、脱イオンH2O 2x、それぞれ3分でスライドをすすぎます。
    10. スライドをヘマトキシリンに1〜2分間浸して、スライドを対比染色します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。
    11. スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。
    12. スライドを中性樹脂で覆います。
    13. 切片の抗体染色の色を顕微鏡で観察します。

結果

この方法論を用いて、ラットのOA疼痛モデルを確立し、結果として生じる変化を検出した。MWTおよびTWLは、それぞれ機械的異痛症および熱痛覚過敏を反映した。 図1に示されるように、MIAは、用量依存的に存在する機械的異痛症および熱痛覚過敏を誘発する。驚くべきことに、MWTの減少は21日から28日にかけてピークに達し、その後リバウンドし、この段階で関節修復が?...

ディスカッション

MIAによって誘発されるOAのラットモデルは、十分に確立され、広く使用されているモデルです。MIAの関節内注射は、最初に重度で急性の炎症を引き起こし、OA17,18のより長く変性段階を引き起こします。本研究では、MWTとTWLによる侵害受容感度を測定し、イメージングシステムで歩行変化を評価しました。以前の報告では、MIAの注射が求心性膝関節?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国浙江省自然科学財団(助成金番号:LY17H270016)、中国国家自然科学財団(助成金番号:81774331、81873049、および81673997)、および浙江省中国伝統中国医学科学技術プロジェクト(助成金番号:2013ZQ007および2016ZZ011)から資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Collagen II antibodyAbcam(UK)34712Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)
Anti-Collagen X (Col10) antibodyAbcam(UK)49945Primary antibody for IHC
DigiGait Imaging SystemMouse Specifics (Boston, MA, USA)Equipment for gait patterns analyses
EosinSigma-Aldrich861006The dye for HE staining
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibodyZSGQ-BIO (Beijing, China)PV-9002Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibodyZSGQ-BIO (Beijing, China)PV-9001Secondary antibody for IHC
HematoxylinSigma-AldrichH3163The dye for HE staining
MIASigma-AldrichI4386-10Gpowder
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)69926Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding centerThermo Fisher Scientific (USA)EC 350Produce paraffin blocks.
Plantar Test apparatusUgoBasile (Italy)37370Equipment for TWL assay
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)RR037AExtracte total RNA from cultured cells
Rotary and Sliding MicrotomesThermo Fisher Scientific (USA)HM325Precise paraffin sections.
Safranin-OSigma-AldrichS2255The dye for SO staining
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (Japan)Vacuum Infiltration Processor

参考文献

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