Osteoarthritis-Schmerzmodell, induziert durch intraartikuläre Injektion von Mono-Jodacetat bei Ratten

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die Methode der intraartikulären Injektion von Monojodacetat bei Ratten und diskutiert die daraus resultierenden schmerzbezogenen Verhaltensweisen und histopathologischen Veränderungen, die Referenzen für zukünftige Anwendungen liefern.

Zusammenfassung

Die aktuellen Tiermodelle der Arthrose (OA) lassen sich in spontane Modelle und induzierte Modelle unterteilen, die beide darauf abzielen, die pathophysiologischen Veränderungen der menschlichen OA zu simulieren. Als Hauptsymptom im Spätstadium der OA beeinträchtigen Schmerzen jedoch das tägliche Leben der Patienten, und es gibt nicht viele verfügbare Modelle. Das Monojodacetat (MIA)-induzierte Modell ist das am weitesten verbreitete OA-Schmerzmodell, das hauptsächlich bei Nagetieren eingesetzt wird. MIA ist ein Inhibitor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, die Chondrozytentod, Knorpeldegeneration, Osteophyten und messbare Veränderungen im Verhalten der Tiere verursacht. Darüber hinaus können Expressionsänderungen der Matrix-Metalloproteinase (MMP) und proinflammatorischer Zytokine (IL1-β und TNF-α) im MIA-induzierten Modell nachgewiesen werden. Diese Veränderungen stehen im Einklang mit den pathophysiologischen Bedingungen der OA beim Menschen, was darauf hindeutet, dass MIA ein messbares und erfolgreiches OA-Schmerzmodell induzieren kann. Diese Studie zielt darauf ab, die Methodik der intraartikulären Injektion von MIA bei Ratten zu beschreiben und die daraus resultierenden schmerzbezogenen Verhaltensweisen und histopathologischen Veränderungen zu diskutieren.

Einleitung

Osteoarthritis (OA) ist die häufigste Gelenkerkrankung der Welt und betrifft schätzungsweise 10-12% der Erwachsenen¹. Das am häufigsten betroffene Gelenk ist das Knie, und OA hat eine höhere Inzidenz bei älteren Erwachsenen, insbesondere bei Frauen². Als chronische Erkrankung entwickelt sich OA über Jahrzehnte fortschreitend zu Gelenkversagen mit Symptomen wie Knorpelverlust, Synovialentzündung, Osteophytose, verminderter Funktion und chronischen Schmerzen³. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist OA die vierthäufigste Krankheit bei Frauen und die achthäufigste Krankheit bei Männern. Bis 2020 könnte OA die vierthäufigste behindernde Krankheit beim Menschen werden⁴. Die derzeit verfügbaren Therapien der OA behandeln jedoch nur die Symptome und verlängern die Zeit bis zur Gelenkersatzoperation⁵.

Die spontane Arthrose bei menschlichen Patienten dauert oft lange, bis sie klinische Symptome wie Gelenkschmerzen hervorruft⁶. In den frühen Stadien der OA sind die Schmerzen in der Regel intermittierend und werden mit fortschreitender Krankheit häufiger und schwerer, was sie zur vorherrschenden Beschwerde der Patienten macht⁷. Daher wurden im letzten halben Jahrhundert umfangreiche Tiermodelle für OA-Schmerzen entwickelt, um die Schmerzlinderungstherapie zu fördern. Open-Access-Modelle wurden klassischerweise in spontane und induzierte Modelle unterteilt. Zu den spontanen Modellen gehören natürlich vorkommende Modelle und genetisch veränderte Modelle, die den Verlauf der primären OA beim Menschen genauer simulieren können⁸. Induzierte Modelle können im Allgemeinen in zwei Kategorien unterteilt werden: 1) posttraumatische OA, die durch eine Operation oder ein anderes Trauma induziert wird; oder 2) intraartikuläre Injektion von chondrotoxischen oder entzündungsfördernden Substanzen³. Diese Modelle bilden die Grundlage für die pathophysiologische Untersuchung von OA und tragen wesentlich zur Entwicklung von Medikamenten zur Schmerzlinderung und Funktionssteigerung bei.

In jüngster Zeit ist Mono-Iodacetat (MIA) der am weitesten verbreitete Induktor für die OA-Modellierung. MIA, ein Inhibitor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, kann Veränderungen in der Knorpelmatrix, Abbau, Knorpelverlust, Synovitis und andere Veränderungen verursachen, die den pathologischen Veränderungen der menschlichen Arthrose ähneln⁹. Es wurde festgestellt, dass die intraartikuläre Injektion von MIA 28 Tage nach der MIA-Verabreichung anhaltende Schmerzen induzierte, was darauf hindeutet, dass das MIA-Modell für die Untersuchung chronischer nozizeptiver Schmerzen nützlich sein kann^10,11,12. In dieser Studie erhielten männliche Sprague-Dawley-Ratten intraartikuläre Injektionen mit 0,5, 1,5 oder 3 mg MIA in die Kniegelenke. Der Schweregrad der MIA-induzierten Gelenkschmerzen wurde durch Beurteilung der mechanischen und thermischen Empfindlichkeit 1, 7, 14, 21, 28 und 35 Tage nach der Injektion gemessen. Auf dieser Grundlage wurden 1,5 mg MIA als Endkonzentration ausgewählt, um Gangmuster und histologische Veränderungen 28 Tage nach der Injektion zu bewerten.

Protokoll

Verfahren mit Tieren wurden von der Kommission für medizinische Normen und Ethik der Zhejiang Chinese Medical University genehmigt und entsprechen den chinesischen Rechtsvorschriften über die Verwendung und Pflege von Labortieren.

1. Intraartikuläre Injektion von Monojodacetat in das Knie

1. Nach einer Woche Akklimatisierung werden 40 männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 180−200 g (4−5 Wochen alt) nach dem Zufallsprinzip und gleichmäßig in vier Gruppen (n = 10 Ratten/Gruppe) aufgeteilt.
   HINWEIS: Ratten in der Kontrollgruppe werden intraartikulär 50 μl Kochsalzlösung injiziert, während Ratten in den Versuchsgruppen mit 0,5, 1,5 oder 3 mg MIA behandelt werden, die in 50 μl Kochsalzlösung gelöst sind.
2. Am Tag der Injektion wird die MIA-Lösung in steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) in einer Konzentration von 15, 30 und 60 mg/ml und eine 10%ige Pentobarbitallösung in steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) frisch zubereitet.
   VORSICHT: MIA hat eine extrem zerstörerische Wirkung auf die Schleimhäute, die oberen Atemwege, das Auge und die Haut und andere Gewebe. Daher werden bei der Zubereitung einer Lösung Maske und Handschuhe empfohlen.
3. Anästhesien Ratten durch intraperitoneale Injektion von Ketamin in einer Dosis von 60 mg/kg und Xylazin in einer Dosis von 5 mg/kg (beide in Kochsalzlösung hergestellt). Klemmen Sie die Zehen der Ratte vorsichtig mit einer Pinzette, um die Anästhesie zu bestätigen.
4. Legen Sie die Ratte mit dem Rücken nach unten. Rasieren Sie das Knie und wischen Sie den Bereich um das Kniegelenk mit Alkohol ab.
5. Halten Sie das Knie in einem 90°-Winkel und legen Sie die weiße Patellasehne unterhalb der Kniescheibe frei. Drücken Sie mit der Fingerspitze auf die Patellasehne, um den Spalt unter der Kniescheibe zu finden.
6. Wählen Sie die Verbindung der Lücke und der lateralen Patellasehne als Injektionsstelle. Führen Sie dann die 26 G Nadel etwa 5 mm vertikal in die Stelle ein. Es sollte kein Widerstand zu spüren sein, wenn sich die Nadel im Gelenkraum befindet.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Nadel senkrecht zur Injektionsstelle zu halten.
7. Injizieren Sie 50 μL Kochsalzlösung oder MIA-Lösung in die Gelenkhöhle. Ziehen Sie langsam die Nadel heraus und wickeln Sie ein Stück Gaze um die Injektionsstelle, um Reflux und Leckage zu minimieren. Nach der Anästhesieerholung entfernen Sie die Gaze.
8. Das schmerzbedingte Verhalten ist 1, 7, 14, 21, 28 und 35 Tage nach der Injektion wie in Abschnitt 2 beschrieben zu testen.

2. Verhaltensbeurteilungen

1. Mechanische Entnahmeschwelle (MWT)
   ANMERKUNG: Die MWT wurde mit dem von Frey-Test¹³ gemessen und der Beobachter war blind für die Injektionen, die die Tiere erhalten hatten.
   1. Setzen Sie eine Ratte in einen erhöhten Kunststoffkäfig (17 cm x 11 cm x 13 cm) mit einer Maschendrahtbasis, die 50 cm über einem Tisch hängt. Stellen Sie sicher, dass die Testumgebung ruhig ist, und geben Sie der Ratte 30 Minuten Zeit, um sich an die Umgebung anzupassen.
   2. Drücken Sie die von Frey-Nadel senkrecht auf die plantare Oberfläche der Hinterpfote jeder Ratte. Erhöhen Sie den Druck allmählich (ca. 20 g/s) und linear, bis das Pfotenheben oder Pfotenlecken erfolgt.
   3. Verwenden Sie eine Kraft, die niedriger als der vorherige Schwellenwert ist, um sicherzustellen, dass der Schwellenwert die minimale Rückzugskraft ist. Testen Sie jede Ratte mehr als dreimal, mindestens 3-5 Minuten auseinander.
   4. Notieren Sie die minimale Kraft, die einen Pfotenrückziehreflex hervorruft. Mittelwert der Daten als MWT von Ratten.
2. Thermische Entnahmelatenz (TWL)
   ANMERKUNG: Die TWL wurde mit dem plantaren Testgerät (Materialtabelle) gemessen, und der Beobachter war blind für die Injektionen, die die Tiere erhalten hatten.
   1. Stellen Sie eine Plexiglasbox (60 cm x 20 cm x 14 cm, unterteilt in 6 Fächer) auf eine 3 mm dicke Glasplatte und legen Sie Ratten in die Box (eine in jedem Fach). Stellen Sie sicher, dass die Umgebung ruhig ist und die Raumtemperatur konstant ist.
   2. Geben Sie den Ratten 30 Minuten Zeit, um sich an die Testumgebung zu gewöhnen.
   3. Kalibrieren Sie den thermischen Reiz über das Infrarot-Radiometer. Stellen Sie die gewünschte Infrarotintensität auf 70 Einheiten ein.
   4. Platzieren Sie den Infrarot-Sender/-Detektor auf dem Behälter direkt unter der Mitte der zu testenden Pfote.
   5. Drücken Sie die START-Taste . Der Timer startet automatisch. Der Controller schaltet das Infrarotlicht automatisch aus und stoppt den Timer vollständig, sobald die Pfote bewegt wird.
   6. Notieren Sie die Reaktionszeit beim Auftreten von Pfotenrückzug und Pfotenlecken.
      HINWEIS: Eine positive Antwort auf den Test gilt als Pfotenentzug und Pfotenlecken. Wenn nur ein Pfotenentzug auftritt, sollte dies eher als eine willkürliche Bewegung der Ratte als als eine positive Reaktion angesehen werden.
   7. Wiederholen Sie den Test mehr als dreimal. Berechnen Sie den Durchschnitt der Daten als TWL von Ratten.
      HINWEIS: Jede Strahlungswärmeeinwirkung sollte 20 s nicht überschreiten. Infrarot-Stimulationen an derselben Hinterpfote sollten mindestens 3-5 Minuten voneinander entfernt sein.
3. Analyse von Gangmustern
   HINWEIS: Die Gangbildanalysen wurden mit einem bildgebenden System (Table of Materials) gemessen und der Beobachter wurde für die Injektionen, die die Tiere erhalten hatten, blind gemacht.
   1. Stellen Sie die Länge des Laufabteils ein, indem Sie die Knöpfe an beiden Enden des Laufabteils auf eine für Ratten geeignete Länge (z. B. 61 cm) verwenden.
   2. Setzen Sie eine Ratte in das Laufabteil und trainieren Sie Ratten, um vor dem formalen Experiment mindestens 5 Schrittzyklen mit einer Geschwindigkeit von 18 cm/s ununterbrochen zu laufen.
      HINWEIS: Wenn eine Ratte zum ersten Mal in den Laufraum gesetzt wird, kann die Geschwindigkeit auf ca. 20 cm/s eingestellt und abgeschaltet werden, wenn sie ca. 2 s läuft. Stellen Sie dann die Geschwindigkeit auf 18 cm/s ein. Klopfen Sie vorsichtig mit der Trennwand auf den Rücken der Ratte, wenn die Ratte während des Gehens pausiert oder sich zurückzieht. Versuchen Sie, die Geschwindigkeit schrittweise von 18 cm/s auf 10 cm/s zu reduzieren. Wenn die Ratte den Test schließlich nicht durchführt, ist es akzeptabel, eine andere Ratte für den Test zu wählen.
   3. Erhöhen Sie langsam die Geschwindigkeit des Laufbandes, bis es die Zielgeschwindigkeit (18 cm/s) erreicht. Nehmen Sie mit der digitalen Hochgeschwindigkeits-Videokamera, die unter dem transparenten Laufbandgurt montiert ist, mindestens 5 Sekunden lang ein Video der kontinuierlichen Bewegung der Ratte auf.
   4. Testen Sie jede Ratte im Abstand von mindestens 5 Minuten, um mindestens drei ununterbrochene Läufe zu erhalten.
   5. Zeichnen Sie einen "Begrenzungsrahmen", um die Grenze des Tierlaufbildes in der Bildbearbeitungssoftware zu definieren, und geben Sie die Ausführungsgeschwindigkeit für jedes Video ein. Wählen Sie Videos als Gruppe aus und verarbeiten Sie Videos automatisch von der Software. Nach der Verarbeitung von Videos gibt die Software mehrere Tabellenkalkulationen aus, um Gangindizes zu melden, einschließlich Stand, Schwung, Bremsen, Antrieb, Trittfrequenz, Schrittfolge usw.
   6. Berechnen Sie die Gesamtpfotenfläche (^{cm 2}), die durchschnittliche Schrittlänge (cm) und die Schrittlänge der Einheit.
      HINWEIS: Die Gesamtpfotenfläche ist der Mittelwert der Gesamtfläche von vier Pfoten jeder Rattengruppe und die Pfotenfläche ist definiert als die maximale Pfotenfläche, die während der Standphase des Schrittzyklus mit dem Laufband in Kontakt kommt. Die Schrittlänge ist der Abstand zwischen den ersten Kontakten derselben Pfote in einem vollständigen Schritt. Einheit Schrittlänge = durchschnittliche Schrittlänge (cm)/Körperlänge (cm).

3. Histopathologische und immunhistochemische Analysen

1. Euthanasieren von Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbitalnatrium in einer Dosis von 150 mg/kg (in Kochsalzlösung hergestellt). Resektionieren Sie die Kniegelenke sofort für die histologischen Analysen.
2. Fixieren Sie die Fugen in 10% Formalin für 24 h, entkalken Sie mit 10% EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 8 Wochen und betten Sie dann die Fugen in Paraffin ein.
   VORSICHT: Formalin kann Augen-, Haut- und Atemwegsreizungen verursachen. Es sollte in einer Kapuze gehandhabt werden.
3. Die in 3 mm dicken Paraffinfugen werden mit einem Mikrotom geschnitten und in einem 40 °C warmen Wasserbad mit destilliertem Wasser schwimmen.
4. Übertragen Sie Schnitte auf Objektträger. Trocknen Sie die Objektträger über Nacht und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT), um die anschließende Färbung fortzusetzen.
5. Die Objektträger für 4 h in einen 60 °C heißen Ofen geben, um sie zu entparaffinieren.
6. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander in Xylol, Xylol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 80% Ethanol und 75% Ethanol für jeweils 5 min bei RT.
7. Färbungsschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), Safranin-O (SO) und Alcianblau-Hämatoxylin (ABH) sowie Antikörpern gegen Rattenkollagen Typ II (Col2), Kollagen Typ X (Col10) und Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13), wie in den Schritten 3.8−3.12 beschrieben.
8. H&E-Färbung
   1. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2Ofür 3 min. Objektträger mit Hämatoxylin für 3−5 Min. einfärben.
   2. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2O3x, jeweils 1 min, bis kein Hämatoxylin mehr auf der Oberfläche verbleibt.
   3. Färben Sie Objektträger mit Eosin für 30 s. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült, bis kein Eosin mehr auf der Oberfläche verbleibt.
   4. Die Objektträger werden 10−20 s lang in 0,1 % Ammoniak getaucht. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült.
   5. Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.
   6. Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.
9. SO-Färbung
   1. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2Ofür 3 min. Objektträger mit Hämatoxylin für 3−5 Min. einfärben.
   2. Schnell differenzieren in 1% saurem Alkohol (ca. 3 s). Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült, bis kein Hämatoxylin mehr auf der Oberfläche verbleibt.
   3. Fleckenobjektträger mit Fast Green (FCF) Lösung für 5 min. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült.
   4. Färben Sie Objektträger mit SO für 1−2 min. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült.
   5. Spülen Sie die Objektträger 1−2 min lang mit 1%iger Essigsäure ab, um den Rest-FCF zu entfernen. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2Ofür 1 min.
   6. Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.
   7. Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.
10. ABH-Färbung
    1. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2Ofür 3 min. Die Objektträger 30 s in 1%igen Säurealkohol eintauchen und kurz auf einem Küchenpapier abtropfen lassen (nicht ausspülen).
    2. Dias 1 Stunde lang in ABH eintauchen. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült, bis kein ABH mehr auf der Oberfläche verbleibt.
    3. Schnell differenzieren in 1% saurem Alkohol (ca. 3 s). Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2O3x, jeweils 1 min.
    4. Tauchen Sie die Objektträger für 15 s in 0,5% Ammoniumwasser. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült.
    5. Objektträger 1 Minute lang in 95%iges Ethanol eintauchen. Die Objektträger 1,5 Minuten lang in Eosin/Orange G-Lösung eintauchen.
    6. Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.
    7. Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.
11. Untersuchen Sie alle Objektträger unter einem Mikroskop und bewerten Sie sie statistisch auf einer Skala von 0-13 durch Doppelblindbeobachtung gemäß Mankins Bewertungssystem¹⁴.
12. Immunhistochemie
    1. Spülen Sie Objektträger mit deionisiertem_H2Ofür 3 min.
    2. Die Objektträger werden in 0,1 M Natriumcitrat getaucht und für 4 h in einen 60 °C-Ofen gestellt, um das Antigen zu entnehmen.
    3. Dias 10 Minuten lang in 0,3% Triton X-100 in PBS eintauchen. Anschließend die Objektträger 2x mit PBS abspülen, jeweils 3 min.
    4. Abschnitte in 3%iger_H2O2-Lösungin Methanol bei RT für 10 min inkubieren, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, je 3 min.
    5. Inkubieren Sie Schnitte mit 5% Ziegenserum in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, je 3 min.
    6. Schnitte werden über Nacht bei 4 °C mit 100 μL PBS-verdünnten (1:1.000) Primärantikörpern gegen Rattenkollagen Typ II (Col2), Kollagen Typ X (Col10) und Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13) inkubiert. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, je 3 min.
    7. Inkubieren Sie Schnitte mit 100 μL PBS-verdünntem (1:1.000) sekundärem Antikörper (Ziegen-Anti-Maus-sekundär oder Ziegen-Anti-Maus-Sekundäranti-Maus-Sekundär) für 20 min bei RT. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, jeweils 3 min.
    8. Inkubieren Sie Abschnitte mit 100 μL 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) Arbeitslösung. Beobachten Sie die Reaktion, während die chromogene Reaktion die Epitopstellen braun färbt.
       VORSICHT: DAB ist krebserregend. Tragen Sie immer Handschuhe und arbeiten Sie in einer Kapuze, wenn Sie mit DAB arbeiten.
       HINWEIS: Die Zeit der Farbentwicklung kann von wenigen Sekunden bis zu 10 Minuten variieren.
    9. Sobald sich eine braune Farbe auf den Abschnitten entwickelt, spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem H₂O 2x, jeweils 3 min.
    10. Tauchen Sie die Objektträger für 1-2 Minuten in Hämatoxylin, um die Objektträger gegenzufärben. Anschließend werden die Objektträger mit deionisiertem_H2O3x jeweils 1 min gespült.
    11. Die Objektträger werden nacheinander für 1 Minute in 95% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol und Xylol eingetaucht.
    12. Deckglas der Objektträger mit neutralem Harz.
    13. Beobachten Sie die Farbe der Antikörperfärbung in den Schnitten unter einem Mikroskop.

Ergebnisse

Mit dieser Methodik etablierten wir ein OA-Schmerzmodell in der Ratte und erkannten die daraus resultierenden Veränderungen. MWT und TWL spiegelten mechanische Allodynie bzw. thermische Hyperalgesie wider. Wie in Abbildung 1 dargestellt, induzierten MIA mechanische Allodynie und thermische Hyperalgesie in dosisabhängiger Weise. Bemerkenswert ist, dass die Abnahme der MWT einen Höhepunkt von 21 Tagen auf 28 Tage erreichte und sich dann wieder erholte, was darauf hindeutet, dass in diesem S...

Diskussion

Das Rattenmodell der durch MIA induzierten OA ist ein gut etabliertes, weit verbreitetes Modell. Die intraartikuläre Injektion von MIA verursacht zunächst eine schwere und akute Entzündung, die zu der längeren und degenerativen Phase von OA^17,18 führt. In dieser Studie haben wir die nozizeptive Empfindlichkeit von MWT und TWL gemessen und Gangveränderungen mit einem Bildgebungssystem bewertet. Frühere Berichte ergaben, dass die Injektion von MIA die Empfin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Collagen II antibody	Abcam(UK)	34712	Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)
Anti-Collagen X (Col10) antibody	Abcam(UK)	49945	Primary antibody for IHC
DigiGait Imaging System	Mouse Specifics (Boston, MA, USA)		Equipment for gait patterns analyses
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
MIA	Sigma-Aldrich	I4386-10G	powder
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks.
Plantar Test apparatus	UgoBasile (Italy)	37370	Equipment for TWL assay
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)	RR037A	Extracte total RNA from cultured cells
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections.
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor