Sıçanlarda Mono-İyodoasetatın Eklem İçi Enjeksiyonu ile İndüklenen Osteoartrit Ağrı Modeli

Özet

Bu çalışma, sıçanlarda mono-iyodoasetatın eklem içi enjeksiyon yöntemini açıklamakta ve gelecekteki uygulamalar için referans sağlayan ağrıya bağlı davranışları ve histopatolojik değişiklikleri tartışmaktadır.

Özet

Osteoartritin (OA) mevcut hayvan modelleri, her ikisi de insan OA'sının patofizyolojik değişikliklerini simüle etmeyi amaçlayan spontan modellere ve indüklenmiş modellere ayrılabilir. Bununla birlikte, OA'nın geç evresinde ana semptom olarak, ağrı hastaların günlük yaşamını etkiler ve çok fazla model yoktur. Mono-iyodoasetat (MIA) kaynaklı model, esas olarak kemirgenlerde kullanılan en yaygın kullanılan OA ağrı modelidir. MIA, kondrosit ölümüne, kıkırdak dejenerasyonuna, osteofitlere ve hayvan davranışında ölçülebilir değişikliklere neden olan gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenazın bir inhibitörüdür. Ayrıca, MIA ile indüklenen modelde matriks metalloproteinaz (MMP) ve pro-inflamatuar sitokinlerin (IL1 β ve TNF α) ekspresyon değişiklikleri tespit edilebilir. Bu değişiklikler insanlarda OA patofizyolojik koşulları ile tutarlıdır, bu da MIA'nın ölçülebilir ve başarılı bir OA ağrı modelini indükleyebileceğini göstermektedir. Bu çalışma, sıçanlarda eklem içi MIA enjeksiyonunun metodolojisini tanımlamayı ve ortaya çıkan ağrıya bağlı davranışları ve histopatolojik değişiklikleri tartışmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Osteoartrit (OA) dünyada en sık görülen eklem hastalığıdır ve yetişkinlerde tahmini %10-12 oranında popülasyonu etkilemektedir¹. En sık tutulan eklem dizdir ve OA yaşlı erişkinlerde, özellikle de kadınlarda daha yüksek bir insidansa sahiptir². Kronik bir hastalık olarak OA, kıkırdak kaybı, sinovyal inflamasyon, osteofitozis, azalmış fonksiyon ve kronik ağrı gibi semptomlarla on yıllar içinde giderek eklem yetmezliğine dönüşür³. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre OA, kadınlarda dördüncü en sık görülen hastalık ve erkeklerde sekizinci en yaygın hastalıktır. 2020 yılına gelindiğinde, OA insanlarda dördüncü en çok engelleyici hastalık haline gelebilir⁴. Bununla birlikte, OA'nın şu anda mevcut tedavileri sadece semptomları ele almakta ve eklem replasman cerrahisine kadar süreyi uzatmaktadır⁵.

İnsan hastalarda spontan OA'nın eklem ağrısı gibi klinik semptomlar üretmesi genellikle uzun zaman alır⁶. OA'nın erken evrelerinde ağrı genellikle aralıklıdır ve hastalık ilerledikçe daha sık ve şiddetli hale gelir ve bu da onu hastaların baskın şikayeti haline getirir⁷. Bu nedenle, ağrı kesici tedaviyi teşvik etmek için son yarım yüzyılda OA ağrısı için kapsamlı hayvan modelleri geliştirilmiştir. OA modelleri klasik olarak spontan ve indüklenmiş modellere ayrılmıştır. Spontan modeller, insanlarda primer OA'nın seyrini daha yakından simüle edebilen doğal olarak oluşan modelleri ve genetiği değiştirilmiş modelleri içerir⁸. İndüklenen modeller genellikle iki kategoriye ayrılabilir: 1) cerrahi veya diğer travmalarla indüklenen travma sonrası OA; veya 2) kondrotoksik veya pro-inflamatuar maddelerin eklem içi enjeksiyonu³. Bu modeller OA'nın patofizyolojik çalışması için bir temel oluşturur ve ağrıyı azaltmak ve fonksiyonu arttırmak için ilaçların geliştirilmesine büyük katkıda bulunur.

Son zamanlarda, OA modellemesi için en yaygın kullanılan indükleyici mono-iyodoasetattır (MIA). Bir gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz inhibitörü olan MIA, insan osteoartritinin patolojik değişikliklerine benzer şekilde kıkırdak matrisinde, bozulmada, kıkırdak kaybında, sinovitte ve diğer değişikliklerde değişikliklere neden^olabilir. MIA'nın eklem içi enjeksiyonunun, MIA uygulamasından 28 gün sonra devam eden ağrıya neden olduğu ve MIA modelinin kronik nosiseptif ağrıyı araştırmak için yararlı olabileceğini gösterdiği belirtilmiştir ^10,11,12. Bu çalışmada, erkek Sprague-Dawley sıçanlarına diz eklemlerinde 0.5, 1.5 veya 3 mg MIA ile eklem içi enjeksiyonlar yapıldı. MIA'ya bağlı eklem ağrısının şiddeti, enjeksiyonlardan 1, 7, 14, 21, 28 ve 35 gün sonra mekanik ve termal duyarlılığın değerlendirilmesiyle ölçüldü. Bu temelde, enjeksiyonlardan 28 gün sonra yürüyüş paternlerini ve histolojik değişiklikleri değerlendirmek için son konsantrasyon olarak 1.5 mg MIA seçildi.

Protokol

Hayvan denekleri içeren prosedürler, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Tıbbi Normlar ve Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Çin mevzuatına uygundur.

1. Dizde mono-iyodoasetatın eklem içi enjeksiyonu

1. Bir haftalık alışmadan sonra, rastgele ve eşit olarak 180-200 g (4-5 haftalık) ağırlığındaki 40 erkek Sprague-Dawley sıçanını dört gruba ayırın (n = 10 sıçan / grup).
   NOT: Kontrol grubundaki sıçanlara eklem içi olarak 50 μL salin enjekte edilirken, deney gruplarındaki sıçanlar sırasıyla 50 μL salin içinde çözünmüş 0.5, 1.5 veya 3 mg MIA ile muamele edilecektir.
2. Enjeksiyon gününde, MIA çözeltisini 15, 30 ve 60 mg / mL konsantrasyonunda steril salin (% 0.9 NaCl) ve% 10 pentobarbital çözelti içinde steril salin (% 0.9 NaCl) içinde taze olarak hazırlayın.
   DİKKAT: MIA, mukoza zarı, üst solunum yolu, göz, cilt ve diğer dokular üzerinde son derece yıkıcı bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, bir çözelti hazırlarken maske ve eldivenler önerilir.
3. 60 mg / kg'da intraperitoneal ketamin ve 5 mg / kg'da ksilazin enjeksiyonu ile sıçanları anestezik hale getirin (her ikisi de salin içinde hazırlanır). Anesteziyi doğrulamak için sıçanın ayak parmaklarını bir cımbızla hafifçe sıkıştırın.
4. Sıçanı sırtı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Dizleri tıraş edin ve diz eklemini çevreleyen alanı alkolle silin.
5. Diz 90 ° açıyla tutun ve patellanın altındaki beyaz patellar tendonu ortaya çıkarın. Patellanın altındaki boşluğu bulmak için patellar tendonu parmak ucuyla bastırın.
6. Enjeksiyon bölgesi olarak boşluğun ve lateral patellar tendonun birleşme yerini seçin. Ardından, 26 G iğneyi yaklaşık 5 mm sahaya dikey olarak yerleştirin. İğne eklem boşluğundayken direnç hissedilmemelidir.
   NOT: İğneyi enjeksiyon bölgesine dik tutmak önemlidir.
7. Eklem boşluğuna 50 μL salin veya MIA çözeltisi enjekte edin. İğneyi yavaşça dışarı çekin ve reflü ve sızıntıyı en aza indirmek için enjeksiyon bölgesinin etrafına bir parça gazlı bez sarın. Anestezi iyileşmesinden sonra, gazlı bezi çıkarın.
8. Ağrıyla ilgili davranışı, bölüm 2'de açıklandığı gibi enjeksiyonlardan 1, 7, 14, 21, 28 ve 35 gün sonra test edin.

2. Davranışsal değerlendirmeler

1. Mekanik geri çekilme eşiği (MWT)
   NOT: MWT, von Frey testi¹³ ile ölçüldü ve gözlemci, hayvanların aldığı enjeksiyonlara kör edildi.
   1. Bir sıçanı, bir masanın 50 cm yukarısına asılı bir tel örgü tabana sahip yükseltilmiş bir plastik kafese (17 cm x 11 cm x 13 cm) yerleştirin. Test ortamının sessiz olduğundan emin olun ve sıçana çevreye uyum sağlaması için 30 dakika verin.
   2. Von Frey iğnesini her sıçanın arka pençesinin plantar yüzeyine dik olarak bastırın. Basıncı kademeli olarak (yaklaşık 20 g / s) ve pençe kaldırma veya pençe yalama gerçekleşene kadar doğrusal olarak artırın.
   3. Eşiğin minimum geri çekilme kuvveti olduğundan emin olmak için önceki eşikten daha düşük bir kuvvet kullanın. Her sıçanı en az 3-5 dakika arayla üç kereden fazla test edin.
   4. Pençe çekme refleksini ortaya çıkaran minimum kuvveti kaydedin. Verilerin ortalamasını sıçanların MWT'si olarak alın.
2. Termal geri çekilme gecikmesi (TWL)
   NOT: TWL, plantar test cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılarak ölçüldü ve gözlemci, hayvanların aldığı enjeksiyonlara kör edildi.
   1. 3 mm kalınlığında bir cam plaka üzerine bir pleksiglas kutu (60 cm x 20 cm x 14 cm, 6 bölmeye bölünmüş) yerleştirin ve sıçanları kutuya koyun (her bölmede bir tane). Ortamın sessiz olduğundan ve oda sıcaklığının sabit olduğundan emin olun.
   2. Sıçanlara test ortamına uyum sağlamaları için 30 dakika verin.
   3. Kızılötesi radyometre aracılığıyla termal uyaranı kalibre edin. İstenilen kızılötesi yoğunluğu 70 üniteye ayarlayın.
   4. Kızılötesi yayıcıyı/dedektörü, test edilen pençenin tam merkezinin altındaki kabın üzerine yerleştirin.
   5. BAŞLAT düğmesine basmak. Zamanlayıcı otomatik olarak başlayacaktır. Kontrolör kızılötesi ışığı otomatik olarak kapatacak ve pençenin hareketi gerçekleşir gerçekleşmez zamanlayıcıyı tamamen durduracaktır.
   6. Pençe çekilmesi ve pençe yalama görünümü olduğunda reaksiyon süresini kaydedin.
      NOT: Test için olumlu bir cevap, pençe çekilmesi ve pençe yalama olarak kabul edilir. Sadece pençe çekilmesi meydana gelirse, olumlu bir cevaptan ziyade sıçanın gönüllü bir hareketi olarak kabul edilmelidir.
   7. Testi üç defadan fazla tekrarlayın. Verileri sıçanların TWL'si olarak ortalama.
      NOT: Radyant ısının her maruziyeti 20 sn'yi geçmemelidir. Aynı arka pençedeki kızılötesi stimülasyonlar en az 3-5 dakika aralıklarla olmalıdır.
3. Yürüme paterni analizleri
   NOT: Yürüme paterni analizleri bir görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak ölçüldü ve gözlemci, hayvanların aldığı enjeksiyonlara kör edildi.
   1. Yürüme bölmesinin her iki ucundaki düğmeleri sıçanlar için uygun uzunluğa (örneğin, 61 cm) kullanarak yürüme bölmesinin uzunluğunu ayarlayın.
   2. Yürüme bölmesine bir sıçan yerleştirin ve resmi deneyden önce 18 cm / s hızında en az 5 adım döngüsü boyunca kesintisiz koşular yapmak için fareleri eğitin.
      NOT: Bir sıçan ilk kez yürüme bölmesine yerleştirildiğinde, hız yaklaşık 20 cm / s'ye ayarlanabilir ve 2 s civarında koşarken kapatılabilir. Ardından hızı 18 cm / s olarak ayarlayın. Sıçan yürüme sırasında duraklarsa veya geri çekilirse, sıçanın arkasına bölme ile hafifçe dokunun. Hızı kademeli olarak 18 cm / s'den 10 cm / s'ye düşürmeye çalışın. Sıçan sonunda testi gerçekleştiremezse, test için başka bir sıçan seçmek kabul edilebilir.
   3. Hedef hıza (18 cm / s) ulaşana kadar koşu bandının hızını yavaşça artırın. Şeffaf koşu bandı kemerinin altına monte edilmiş yüksek hızlı dijital video kamera ile sıçanın sürekli hareketinin en az 5 s videosunu çekin.
   4. En az üç kesintisiz çalışma elde etmek için her sıçanı en az 5 dakika arayla test edin.
   5. Görüntüleme yazılımında hayvan yürüyüşü görüntüsünün sınırını tanımlamak için bir "sınırlayıcı kutu" çizin ve her video için çalışma hızını girin. Videoları grup olarak seçin ve videoları yazılım tarafından otomatik olarak işleyin. Videoları işledikten sonra, yazılım duruş, salıncak, frenleme, tahrik, kadans, adım sırası vb. dahil olmak üzere yürüme endekslerini raporlamak için çeşitli elektronik tablolar çıkaracaktır.
   6. Toplam pençe alanını (^cm2), ortalama adım uzunluğunu (cm) hesaplayın ve adım uzunluğunu birleştirin.
      NOT: Toplam pençe alanı, her sıçan grubunun dört pençesinin toplam alanının ortalamasıdır ve pençe alanı, adım döngüsünün duruş aşamasında koşu bandı ile temas halinde olan maksimum pençe alanı olarak tanımlanır. Adım uzunluğu, aynı pençenin ilk temasları arasındaki mesafedir. Birim adım uzunluğu = ortalama adım uzunluğu (cm)/vücut uzunluğu (cm).

3. Histopatolojik ve immünohistokimyasal analizler

1. 150 mg / kg'da intraperitoneal pentobarbital sodyum enjeksiyonu ile sıçanları ötenazi hale getirin (salin içinde hazırlanır). Histolojik analizler için diz eklemlerini hemen rezeke edin.
2. Eklemleri 24 saat boyunca% 10 formalin içinde sabitleyin, 8 hafta boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 10 EDTA ile kireçlenin ve ardından eklemleri parafin içine gömün.
   DİKKAT: Formalin göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Bir davlumbazda ele alınmalıdır.
3. Parafin gömülü derzleri 3 mm kalınlığında bir mikrotom ile kesitleyin ve damıtılmış su içeren 40 °C'lik bir su banyosunda yüzer.
4. Bölümleri cam slaytlara aktarın. Slaytları gece boyunca kurutun ve aşağıdaki boyamaya devam etmek için slaytları oda sıcaklığında (RT) saklayın.
5. Slaytları 60 °C'lik bir fırına 4 saat boyunca deparafinize yerleştirin.
6. RT'de slaytları sırasıyla 5 dakika boyunca sırasıyla ksilen, ksilen,% 100 etanol,% 100 etanol,% 95 etanol,% 80 etanol ve% 75 etanol içine daldırın.
7. Adım 3.8-3.12'de açıklandığı gibi, hematoksilin ve eozin (H & E), safranin-O (SO) ve Alcian mavi hematoksilin (ABH) ile birlikte sıçan tip II kollajen (Col2), tip X kollajen (Col10) ve matriks metalloproteinaz 13'e (MMP13) karşı antikorlar içeren leke kesitleri.
8. H&E boyama
   1. Deiyonize H₂O ile kızakları 3 dakika durulayın. Leke 3-5 dakika boyunca hematoksilin ile kayar.
   2. Deiyonize H₂O 3x ile slaytları, yüzeyde hematoksilin kalmayana kadar her biri 1 dakika durulayın.
   3. Leke 30 s için eozin ile kaydırır. Daha sonra, deiyonize H₂O 3x ile slaytları, yüzeyde eozin kalmayana kadar her biri 1 dakika durulayın.
   4. Slaytları 10−20 s için% 0.1 amonyağa batırın. Ardından, slaytları deiyonize H₂O 3x, her biri 1 dakika ile durulayın.
   5. Slaytları sırasıyla %95 etanol, %100 etanol, ksilen, ksilen ve ksilen'e 1 dakika boyunca daldırın.
   6. Slaytları nötr reçine ile örtün.
9. SO boyama
   1. Deiyonize H₂O ile kızakları 3 dakika durulayın. Leke 3-5 dakika boyunca hematoksilin ile kayar.
   2. % 1 asit alkolde (yaklaşık 3 sn) hızlı bir şekilde farklılaşın. Daha sonra, yüzeyde hematoksilin kalmayıncaya kadar deiyonize H₂O 3x, her biri 1 dakika ile slaytları durulayın.
   3. Hızlı Yeşil (FCF) solüsyonlu leke kızakları 5 dakika. Ardından, slaytları deiyonize H₂O 3x, her biri 1 dakika ile durulayın.
   4. Leke 1-2 dakika boyunca SO ile kaydırılır. Ardından, slaytları deiyonize H₂O 3x, her biri 1 dakika ile durulayın.
   5. Artık FCF'yi çıkarmak için% 1 asetik asit ile kızakları 1-2 dakika boyunca durulayın. Deiyonize H₂O ile kızakları 1 dakika durulayın.
   6. Slaytları sırasıyla %95 etanol, %100 etanol, ksilen, ksilen ve ksilen'e 1 dakika boyunca daldırın.
   7. Slaytları nötr reçine ile örtün.
10. ABH boyama
    1. Deiyonize H₂O ile kızakları 3 dakika durulayın. Slaytları 30 sn boyunca% 1 asit alkole batırın ve bir kağıt havluya kısaca boşaltın (durulamayın).
    2. Slaytları 1 saat boyunca ABH'ye daldırın. Daha sonra, deiyonize H₂O 3x ile slaytları, yüzeyde ABH kalmayana kadar her biri 1 dakika durulayın.
    3. % 1 asit alkolde (yaklaşık 3 sn) hızlı bir şekilde farklılaşın. Deiyonize H₂O 3x ile kızakları durulayın, her biri 1 dakika.
    4. Slaytları 15 saniye boyunca% 0,5 amonyum suya batırın. Ardından, slaytları deiyonize H₂O 3x, her biri 1 dakika ile durulayın.
    5. Slaytları 1 dakika boyunca% 95 etanol içine daldırın. Slaytları 1,5 dakika boyunca eozin/turuncu G çözeltisine batırın.
    6. Slaytları sırasıyla %95 etanol, %100 etanol, ksilen, ksilen ve ksilen'e 1 dakika boyunca daldırın.
    7. Slaytları nötr reçine ile örtün.
11. Tüm slaytları mikroskop altında inceleyin ve Mankin'in puanlama sistemi^14'e göre çift kör gözlemle 0-13 ölçeğinde istatistiksel olarak derecelendirin.
12. İmmünohistokimya
    1. Deiyonize H₂O ile kızakları 3 dakika durulayın.
    2. Slaytları 0,1 M sodyum sitrat içine daldırın ve antijeni almak için slaytları 60 ° C'lik bir fırında 4 saat boyunca yerleştirin.
    3. Slaytları PBS'de %0,3 Triton X-100'e 10 dakika daldırın. Ardından, slaytları PBS 2x, her biri 3 dakika ile durulayın.
    4. Endojen peroksidaz aktivitesinibloke etmek için RT'de metanol içinde% 3_{H2 O 2} çözeltisindeki bölümleri 10 dakika boyunca inkübe edin. Kızakları PBS 2x, her biri 3 dakika ile durulayın.
    5. Spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı engellemek için RT'de 30 dakika boyunca PBS'de% 5 keçi serumu içeren bölümleri inkübe edin. Kızakları PBS 2x, her biri 3 dakika ile durulayın.
    6. Kesitleri 4 °C'de gece boyunca 100 μL PBS ile seyreltilmiş (1:1.000) sıçan tip II kollajen (Col2), tip X kollajen (Col10) ve matriks metalloproteinaz 13'e (MMP13) karşı primer antikorlarla inkübe edin. Kızakları PBS 2x, her biri 3 dakika ile durulayın.
    7. RT'de 20 dakika boyunca 100 μL PBS ile seyreltilmiş (1:1.000) ikincil antikor (keçi anti-fare sekonder veya keçi anti-fare ikincil) içeren bölümleri inkübe edin.
    8. 100 μL 3,3′-diaminobenzidin (DAB) çalışma çözeltisi ile bölümleri inkübe edin. Kromojenik reaksiyon epitop bölgelerini kahverengiye çevirirken reaksiyonu izleyin.
       DİKKAT: DAB bir kanserojendir. DAB ile çalışırken daima eldiven giyin ve bir başlıkta çalışın.
       NOT: Renk geliştirme süresi birkaç saniye ile 10 dakika arasında değişebilir.
    9. Kesitlerde kahverengi bir renk gelişir gelişmez, slaytları deiyonize H_{2 O 2x}, her biri 3 dakika ile durulayın.
    10. Slaytları lekelemek için slaytları hematoksilin içine 1-2 dakika batırın. Ardından, slaytları deiyonize H₂O 3x, her biri 1 dakika ile durulayın.
    11. Slaytları sırasıyla %95 etanol, %100 etanol, ksilen, ksilen ve ksilen'e 1 dakika boyunca daldırın.
    12. Slaytları nötr reçine ile örtün.
    13. Mikroskop altındaki bölümlerde antikor boyamasının rengini gözlemleyin.

Sonuçlar

Bu metodoloji ile sıçanda OA ağrı modeli oluşturduk ve ortaya çıkan değişiklikleri tespit ettik. MWT ve TWL sırasıyla mekanik allodini ve termal hiperaljezi yansıtıyordu. Şekil 1'de gösterildiği gibi, MIA indüklenen mekanik allodinya ve termal hiperaljezi doza bağımlı bir şekilde mevcuttur. Dikkat çekici bir şekilde, MWT'nin düşüşü 21 günden 28 güne kadar bir zirveye ulaştı ve daha sonra toparlandı, bu da eklem onarımının bu aşamada gerçekleşebileceğin...

Tartışmalar

MIA tarafından indüklenen OA'nın sıçan modeli, iyi kurulmuş, yaygın olarak kullanılan bir modeldir. MIA'nın eklem içi enjeksiyonu başlangıçta OA ^17,18'in daha uzun ve dejeneratif fazına yol açan şiddetli ve akut inflamasyona neden olur. Bu araştırmada, MWT ve TWL ile nosiseptif duyarlılığı ölçtük ve yürüme değişikliklerini bir görüntüleme sistemi ile değerlendirdik. Önceki raporlar, MIA enjeksiyonunun, termal hiperaljezi ve azalt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Collagen II antibody	Abcam(UK)	34712	Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)
Anti-Collagen X (Col10) antibody	Abcam(UK)	49945	Primary antibody for IHC
DigiGait Imaging System	Mouse Specifics (Boston, MA, USA)		Equipment for gait patterns analyses
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
MIA	Sigma-Aldrich	I4386-10G	powder
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks.
Plantar Test apparatus	UgoBasile (Italy)	37370	Equipment for TWL assay
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)	RR037A	Extracte total RNA from cultured cells
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections.
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor