Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos

Resumo

Este estudo descreve o método de injeção intra-articular de mono-iodoacetato em ratos e discute os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas, que fornecem referências para futuras aplicações.

Resumo

Os modelos animais atuais de osteoartrite (OA) podem ser divididos em modelos espontâneos e modelos induzidos, ambos com o objetivo de simular as alterações fisiopatológicas da OA humana. No entanto, como principal sintoma na fase tardia da OA, a dor afeta a vida diária dos pacientes, não havendo muitos modelos disponíveis. O modelo induzido por monoiodoacetato (MIA) é o modelo de dor de OA mais utilizado, utilizado principalmente em roedores. A AIM é um inibidor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que causa morte por condrócitos, degeneração da cartilagem, osteófito e alterações mensuráveis no comportamento animal. Além disso, alterações de expressão da metaloproteinase da matriz (MMP) e citocinas pró-inflamatórias (IL1 β e TNF α) podem ser detectadas no modelo induzido por MIA. Essas alterações são consistentes com as condições fisiopatológicas da OA em humanos, indicando que a AIM pode induzir um modelo de dor da OA mensurável e bem-sucedido. Este estudo tem como objetivo descrever a metodologia de injeção intra-articular de MIA em ratos e discutir os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas.

Introdução

A osteoartrite (OA) é a doença articular mais comum no mundo, afetando cerca de 10-12% da população em adultos¹. A articulação mais geralmente envolvida é o joelho, e a OA tem maior incidência em idosos, especialmente mulheres². Como doença crônica, a OA desenvolve-se progressivamente ao longo de décadas em falência articular com sintomas como perda de cartilagem, inflamação sinovial, osteofitose, diminuição da função e dor crônica³. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a OA é a quarta doença mais prevalente no sexo feminino e a oitava doença mais prevalente no sexo masculino. Até 2020, a OA pode se tornar a quarta doença mais incapacitante em humanos⁴. No entanto, as terapias atualmente disponíveis de OA abordam apenas os sintomas e estendem o tempo até a cirurgia de substituição articular⁵.

A OA espontânea em pacientes humanos muitas vezes leva muito tempo para produzir sintomas clínicos, como dor relacionada às articulações⁶. Nos estágios iniciais da OA, a dor geralmente é intermitente e torna-se mais frequente e grave à medida que a doença progride, tornando-se a queixa predominante dos pacientes⁷. Portanto, extensos modelos animais para a dor da OA foram desenvolvidos ao longo do último meio século para promover a terapia de alívio da dor. Os modelos de OA foram classicamente divididos em modelos espontâneos e induzidos. Os modelos espontâneos incluem modelos naturais e modelos geneticamente modificados, que podem simular mais de perto o curso da OA primária em humanos⁸. Os modelos induzidos geralmente podem ser divididos em duas categorias: 1) OA pós-traumática induzida por cirurgia ou outro trauma; ou 2) injeção intra-articular de substâncias condrotóxicas ou pró-inflamatórias³. Esses modelos estabelecem uma base para o estudo fisiopatológico da OA e contribuem muito para o desenvolvimento de drogas para reduzir a dor e aumentar a função.

Recentemente, o indutor mais utilizado para a modelagem da OA é o mono-iodoacetato (MIA). A AIM, inibidora da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, pode causar alterações na matriz cartilaginosa, degradação, perda de cartilagem, sinovite e outras alterações, que são semelhantes às alterações patológicas da osteoartrite humana⁹. Observou-se que a injeção intra-articular de AIM induziu dor contínua aos 28 dias após a administração da AIM, indicando que o modelo de AIM pode ser útil para investigar a dor nociceptiva crônica^10,11,12. Neste estudo, ratos machos de Sprague-Dawley receberam injeções intra-articulares com 0,5, 1,5 ou 3 mg de MIA nas articulações do joelho. A gravidade da dor articular induzida por MIA foi medida pela avaliação da sensibilidade mecânica e térmica aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após as injeções. Com base nisso, 1,5 mg de AIM foi selecionado como concentração final para avaliar os padrões de marcha e as alterações histológicas aos 28 dias após as injeções.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Normas Médicas e Ética da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang e estão de acordo com a legislação da China sobre o uso e cuidado de animais de laboratório.

1. Injeção intra-articular de mono-iodoacetato no joelho

1. Após uma semana de aclimatação, divida aleatoriamente e igualmente 40 ratos Sprague-Dawley machos pesando 180-200 g (4-5 semanas de idade) em quatro grupos (n = 10 ratos / grupo).
   NOTA: Os ratos do grupo controle serão injetados intra-articularmente com 50 μL de solução salina, enquanto os ratos dos grupos experimentais serão tratados com 0,5, 1,5 ou 3 mg de MIA dissolvidos em 50 μL de solução salina, respectivamente.
2. No dia da injeção, preparar recentemente a solução de MIA em solução salina estéril (NaCl a 0,9%) na concentração de 15, 30 e 60 mg/ml e solução de pentobarbital a 10% em solução salina estéril (NaCl a 0,9%).
   CUIDADO: MIA tem um efeito extremamente destrutivo sobre a membrana mucosa, o trato respiratório superior, o olho e a pele e outros tecidos. Portanto, máscara e luvas são recomendadas ao preparar uma solução.
3. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de cetamina a 60 mg/kg e xilazina a 5 mg/kg (ambas preparadas em solução salina). Prenda suavemente os dedos dos pés do rato com uma pinça para confirmar a anestesia.
4. Coloque o rato com as costas voltadas para baixo. Raspe o joelho e limpe a área ao redor da articulação do joelho com álcool.
5. Mantenha o joelho em um ângulo de 90° e revele o tendão patelar branco abaixo da patela. Pressione o tendão patelar com a ponta do dedo para encontrar a lacuna abaixo da patela.
6. Escolha a junção do espaço e do tendão patelar lateral como local de injeção. Em seguida, insira a agulha 26 G verticalmente no local cerca de 5 mm. Nenhuma resistência deve ser sentida quando a agulha está no espaço articular.
   NOTA: É importante manter a agulha perpendicular ao local da injeção.
7. Injete 50 μL de solução salina ou MIA na cavidade articular. Puxe lentamente a agulha e enrole um pedaço de gaze ao redor do local da injeção para minimizar o refluxo e o vazamento. Após a recuperação da anestesia, remova a gaze.
8. Teste o comportamento relacionado com a dor aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após as injeções, conforme descrito na secção 2.

2. Avaliações comportamentais

1. Limiar de retirada mecânica (MWT)
   NOTA: O TCM foi medido pelo teste de von Frey¹³ e o observador ficou cego para as injeções que os animais haviam recebido.
   1. Coloque um rato em uma gaiola de plástico elevada (17 cm x 11 cm x 13 cm) com uma base de malha de arame suspensa 50 cm acima de uma mesa. Certifique-se de que o ambiente de teste seja silencioso e dê ao rato 30 minutos para se adaptar ao ambiente.
   2. Pressione a agulha de von Frey perpendicularmente na superfície plantar da pata traseira de cada rato. Aumente a pressão gradualmente (aproximadamente 20 g/s) e linearmente até que ocorra o levantamento da pata ou a lambida da pata.
   3. Use uma força inferior ao limite anterior para garantir que o limite seja a força mínima de retirada. Teste cada rato mais de três vezes, com pelo menos 3 a 5 minutos de intervalo.
   4. Registre a força mínima que provoca um reflexo de retirada da pata. Média dos dados como o TCM de ratos.
2. Latência de retirada térmica (TWL)
   NOTA: A TWL foi medida utilizando-se o aparelho de teste plantar (Tabela de Materiais) e o observador foi cegado para as injeções que os animais haviam recebido.
   1. Coloque uma caixa de plexiglass (60 cm x 20 cm x 14 cm, dividida em 6 compartimentos) em uma placa de vidro de 3 mm de espessura e coloque ratos na caixa (um em cada compartimento). Certifique-se de que o ambiente esteja silencioso e que a temperatura ambiente seja constante.
   2. Dê aos ratos 30 minutos para se adaptarem ao ambiente de teste.
   3. Calibre o estímulo térmico através do radiômetro infravermelho. Defina a intensidade infravermelha desejada em 70 unidades.
   4. Coloque o emissor/detector infravermelho no recipiente diretamente sob o centro da pata que está sendo testada.
   5. Pressionando o botão START . O temporizador será iniciado automaticamente. O controlador desligará automaticamente a luz infravermelha e interromperá completamente o temporizador assim que o movimento da pata ocorrer.
   6. Registre o tempo de reação quando o aparecimento de retirada da pata e lamber a pata.
      NOTA: Uma resposta positiva para o teste é considerada como retirada da pata e lambida da pata. Se apenas a retirada da pata ocorrer, deve ser considerada como um movimento voluntário do rato, em vez de uma resposta positiva.
   7. Repita o teste mais de três vezes. Média dos dados como o TWL de ratos.
      NOTA: Cada exposição de calor radiante não deve exceder 20 s. As estimulações infravermelhas na mesma pata traseira devem ter pelo menos 3 a 5 minutos de intervalo.
3. Análise do padrão de marcha
   NOTA: As análises do padrão de marcha foram medidas por meio de um sistema de imagem (Tabela de Materiais) e o observador ficou cego para as injeções que os animais haviam recebido.
   1. Ajuste o comprimento do compartimento de caminhada usando os botões em ambas as extremidades do compartimento de caminhada para um comprimento adequado para ratos (por exemplo, 61 cm).
   2. Coloque um rato no compartimento de caminhada e treine ratos para fazer corridas ininterruptas por pelo menos 5 ciclos de passos a uma velocidade de 18 cm/s antes do experimento formal.
      NOTA: Quando um rato é colocado pela primeira vez no compartimento de caminhada, a velocidade pode ser ajustada para cerca de 20 cm / s e desligada ao correr em torno de 2 s. Em seguida, defina a velocidade para 18 cm/s. Bata suavemente na parte de trás do rato com a divisória, se o rato parar ou recuar durante a caminhada. Tente reduzir a velocidade gradualmente de 18 cm/s para 10 cm/s. Se o rato eventualmente não conseguir realizar o teste, é aceitável escolher outro rato para o teste.
   3. Aumente lentamente a velocidade da esteira até atingir a velocidade alvo (18 cm/s). Capture pelo menos 5 s de vídeo de movimento contínuo do rato com a câmera de vídeo digital de alta velocidade montada abaixo da correia transparente da esteira.
   4. Teste cada rato com pelo menos 5 minutos de intervalo para obter pelo menos três corridas ininterruptas.
   5. Desenhe uma "caixa delimitadora" para definir o limite da imagem de caminhada de animais no software de imagem e insira a velocidade de execução de cada vídeo. Selecione vídeos como um grupo e processe vídeos automaticamente pelo software. Após o processamento dos vídeos, o software produzirá várias planilhas para relatar índices de marcha, incluindo postura, balanço, frenagem, propulsão, cadência, sequência de passos, etc.
   6. Calcule a área total da pata (cm²), o comprimento médio da passada (cm) e o comprimento da passada unite.
      NOTA: A área total da pata é a média da área total de quatro patas de cada grupo de ratos e a área da pata é definida como a área máxima da pata em contato com a esteira durante a fase de postura do ciclo de passos. O comprimento da passada é a distância entre os contatos iniciais da mesma pata em uma passada completa. Comprimento unitário da passada = comprimento médio da passada (cm)/comprimento do corpo (cm).

3. Análises histopatológicas e imuno-histoquímicas

1. Eutanasiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 150 mg/kg (preparado em solução salina). Ressecar as articulações do joelho imediatamente para as análises histológicas.
2. Fixe as articulações em formalina a 10% por 24 h, descalcifique com EDTA a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 8 semanas e, em seguida, incorpore as articulações em parafina.
   CUIDADO: A formalina pode causar irritação nos olhos, pele e trato respiratório. Deve ser manuseado em um exaustor.
3. Secção das juntas embutidas em parafina com um micrótomo de 3 mm de espessura e flutuar num banho-maria a 40 °C contendo água destilada.
4. Transfira seções para lâminas de vidro. Seque as lâminas durante a noite e armazene as lâminas à temperatura ambiente (RT) para continuar a coloração seguinte.
5. Coloque as lâminas em forno a 60 °C por 4 h para desparafinizar.
6. Imergir as lâminas sucessivamente em xileno, xileno, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 80% etanol e 75% etanol por 5 min, respectivamente, no RT.
7. Cortes de coloração com hematoxilina e eosina (H&E), safranina-O (SO) e hematoxilina azul de Alcian (ABH), bem como anticorpos contra colágeno tipo II de rato (Col2), colágeno tipo X (Col10) e metaloproteinase de matriz 13 (MMP13), conforme descrito nas etapas 3.8 a 3.12.
8. Coloração H&E
   1. Enxaguar as lâminas com H₂O deionizado por 3 min. Lâminas de coloração com hematoxilina por 3 a 5 min.
   2. Enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça hematoxilina na superfície.
   3. Escorregas de coloração com eosina por 30 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça nenhuma eosina na superfície.
   4. Mergulhe slides em 0,1% de amônia por 10 a 20 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada.
   5. Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.
   6. Deslize as lâminas por resina neutra.
9. Coloração SO
   1. Enxaguar as lâminas com H₂O deionizado por 3 min. Lâminas de coloração com hematoxilina por 3 a 5 min.
   2. Diferencie rapidamente em 1% de álcool ácido (cerca de 3 s). Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça hematoxilina na superfície.
   3. Lâminas de coloração com solução Fast Green (FCF) por 5 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada.
   4. Escorregas de coloração com SO por 1 a 2 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada.
   5. Enxaguar as lâminas com ácido acético a 1% por 1 a 2 min para remover o FCF residual. Enxaguar as lâminas com H₂O deionizado por 1 min.
   6. Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.
   7. Deslize as lâminas por resina neutra.
10. Coloração ABH
    1. Enxaguar as lâminas com H₂O deionizado por 3 min. Mergulhe as lâminas em álcool ácido a 1% por 30 s e escorra brevemente em um papel toalha (não enxágue).
    2. Mergulhe slides em ABH por 1 h. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça ABH na superfície.
    3. Diferencie rapidamente em 1% de álcool ácido (cerca de 3 s). Enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada.
    4. Mergulhe as lâminas em água de amônio a 0,5% por 15 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada.
    5. Mergulhe as lâminas em etanol a 95% por 1 min. Mergulhe as lâminas em solução de eosina/laranja G por 1,5 min.
    6. Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.
    7. Deslize as lâminas por resina neutra.
11. Examinar todas as lâminas ao microscópio e classificar estatisticamente em uma escala de 0−13 por observação duplo-cega, de acordo com o sistema de pontuação de Mankin¹⁴.
12. Imuno-histoquímica
    1. Enxaguar as lâminas com H₂O deionizado por 3 min.
    2. Imergir as lâminas em citrato de sódio 0,1 M e colocar as lâminas num forno a 60 °C durante 4 h para obter o antigénio.
    3. Mergulhe slides em Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.
    4. Incubar seções em solução de H 2 O₂a 3% em metanol em RT por 10 min para bloquear_a atividade da peroxidase endógena. Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.
    5. Incubar seções com soro de cabra a 5% em PBS por 30 min no RT para bloquear qualquer ligação não específica. Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.
    6. Incubar cortes durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpos primários diluídos em PBS (1:1.000) contra colágeno tipo II (Col2), colágeno tipo X (Col10) e metaloproteinase de matriz 13 (MMP13). Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.
    7. Incubar seções com 100 μL de anticorpo secundário diluído em PBS (1:1.000) (cabra anti-camundongo secundário ou cabra anti-camundongo secundário) por 20 min no RT. Enxaguar lâminas com PBS 2x, 3 min cada.
    8. Incubar secções com 100 μL de solução de trabalho de 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Monitore a reação à medida que a reação cromogênica torna os locais do epítopo marrons.
       CUIDADO: DAB é um carcinógeno. Sempre use luvas e trabalhe em um exaustor ao trabalhar com DAB.
       NOTA: O tempo de desenvolvimento de cores pode variar de alguns segundos a 10 minutos.
    9. Assim que uma cor marrom se desenvolver nas seções, enxágue as lâminas com H 2 O_2xdeionizado, 3 min cada.
    10. Mergulhe as lâminas em hematoxilina por 1 a 2 minutos para contra-manchar as lâminas. Em seguida, enxaguar as lâminas com H₂O 3x deionizado, 1 min cada.
    11. Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.
    12. Deslize as lâminas por resina neutra.
    13. Observe a cor da coloração do anticorpo nas seções sob um microscópio.

Resultados

Com essa metodologia, estabelecemos um modelo de dor da OA no rato e detectamos as alterações resultantes. O TCM e a TWL refletiram alodinia mecânica e hiperalgesia térmica, respectivamente. Como mostra a Figura 1, a AIM induziu alodinia mecânica e hiperalgesia térmica presentes de forma dose-dependente. Notavelmente, a diminuição do TCM atingiu um pico de 21 dias para 28 dias, e depois se recuperou, sugerindo que o reparo articular pode ocorrer nesta fase, mas o TCM do grupo MIA de ...

Discussão

O modelo de OA de rato induzido por MIA é um modelo bem estabelecido e amplamente utilizado. A injeção intra-articular de AIM causa inicialmente inflamação grave e aguda, o que dá origem à fase mais longa e degenerativa da OA^17,18. Nesta pesquisa, medimos a sensibilidade nociceptiva por TCM e TWL e avaliamos as alterações da marcha com um sistema de imagem. Relatos prévios constataram que a injeção de AIM poderia elevar a sensibilidade das fibras arti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Collagen II antibody	Abcam(UK)	34712	Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)
Anti-Collagen X (Col10) antibody	Abcam(UK)	49945	Primary antibody for IHC
DigiGait Imaging System	Mouse Specifics (Boston, MA, USA)		Equipment for gait patterns analyses
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
MIA	Sigma-Aldrich	I4386-10G	powder
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks.
Plantar Test apparatus	UgoBasile (Italy)	37370	Equipment for TWL assay
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)	RR037A	Extracte total RNA from cultured cells
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections.
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor