랫트에서 모노요오도아세테이트의 관절내 주사에 의해 유도된 골관절염 통증 모델

요약

이 연구는 쥐에서 모노 요오드 아세테이트의 관절 내 주사 방법을 설명하고 그로 인한 통증 관련 행동 및 조직 병리학 적 변화에 대해 논의하여 향후 적용을위한 참고 자료를 제공합니다.

초록

현재 골관절염(OA)의 동물 모델은 자발적 모델과 유도 모델로 나눌 수 있으며, 둘 다 인간 OA의 병태생리학적 변화를 시뮬레이션하는 것을 목표로 합니다. 그러나 OA 말기의 주요 증상으로 통증은 환자의 일상 생활에 영향을 미치며 사용 가능한 모델이 많지 않습니다. 모노 요오드 아세테이트 (MIA) 유도 모델은 주로 설치류에서 사용되는 가장 널리 사용되는 OA 통증 모델입니다. MIA는 글리 세르 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소의 억제제로 연골 세포 사멸, 연골 변성, 골 괴사 및 동물 행동의 측정 가능한 변화를 유발합니다. 게다가, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 전염증성 사이토카인 (IL1 β 및 TNF α)의 발현 변화는 MIA-유도 모델에서 검출될 수 있다. 이러한 변화는 인간의 OA 병리생리학적 조건과 일치하며, 이는 MIA가 측정 가능하고 성공적인 OA 통증 모델을 유도할 수 있음을 나타낸다. 이 연구는 쥐에서 MIA의 관절 내 주사 방법론을 설명하고 그로 인한 통증 관련 행동 및 조직 병리학 적 변화에 대해 논의하는 것을 목표로합니다.

서문

골관절염(OA)은 세계에서 가장 흔한 관절 질환^{으로 성인 인구의} 약 10-12%에 영향을 미칩니다1. 가장 일반적으로 관련된 관절은 무릎이며 OA는 노인,^{특히 여성에서} 더 높은 발병률을 보입니다2. 만성 질환인 OA는 연골 손실, 활액 염증, 골형성증, 기능 저하 및^{만성 통증과} 같은 증상과 함께 수십 년에 걸쳐 점진적으로 관절 부전으로 발전합니다3. 세계 보건기구 (WHO)에 따르면 OA는 여성에서 네 번째로 널리 퍼진 질병이며 남성에서 8 번째로 널리 퍼진 질병입니다. 2020년까지 골관절염^{은 인간에게} 네 번째로 장애를 일으키는 질병이 될 수 있습니다4. 그러나 현재 이용 가능한 OA 치료법은 증상만을 해결하고 관절 치환술까지 기간을 연장합니다⁵.

인간 환자의 자발적인 OA는 종종 관절 관련 통증과 같은 임상 증상을 나타내는 데 오랜 시간이 걸립니다⁶. OA의 초기 단계에서 통증은 일반적으로 간헐적이며 질병이 진행됨에 따라 더 빈번하고 심해져 환자의 주된 불만이됩니다⁷. 따라서 통증 완화 요법을 촉진하기 위해 지난 반세기 동안 OA 통증에 대한 광범위한 동물 모델이 개발되었습니다. OA 모델은 고전적으로 자발적 모델과 유도 모델로 나뉩니다. 자발적 모델에는 자연 발생 모델과 유전자 변형 모델이 포함되며,^{이는 인간에서} 일차 OA의 과정을 보다 밀접하게 시뮬레이션할 수 있습니다8. 유도된 모델은 일반적으로 두 가지 범주로 나눌 수 있다: 1) 수술 또는 다른 외상에 의해 유도된 외상후 OA; 또는 2) 연골 독성 또는 전 염증성 물질의 관절 내 주사³. 이러한 모델은 OA의 병태생리학적 연구를 위한 토대를 마련하고 통증을 줄이고 기능을 증가시키는 약물 개발에 크게 기여합니다.

최근 OA 모델링에 가장 널리 사용되는 유도제는 모노 요오드 아세테이트 (MIA)입니다. 글리 세르 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소의 억제제 인 MIA는 연골 기질의 변화, 분해, 연골 손실, 활막염 및 인간 골관절염의 병리학 적 변화와 유사한 기타 변화를 일으킬 수 있습니다⁹. MIA의 관절내 주사는 MIA 투여 후 28일에 지속적인 통증을 유발했으며, 이는 MIA 모델이 만성 침해수용성 통증^10,11,12를 조사하는데 유용할 수 있음을 나타낸다. 이 연구에서 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 무릎 관절에 0.5, 1.5 또는 3mg의 MIA가 포함 된 관절 내 주사를 받았습니다. MIA-유도된 관절 통증의 중증도는 주사 후 1, 7, 14, 21, 28 및 35일에 기계적 및 열적 민감도의 평가에 의해 측정되었다. 이를 바탕으로 주사 후 28 일에 보행 패턴과 조직 학적 변화를 평가하기 위해 1.5mg의 MIA를 최종 농도로 선택했습니다.

프로토콜

동물 피험자와 관련된 절차는 절강 중국 의과 대학의 의료 규범 및 윤리위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 사용 및 관리에 관한 중국 법률에 따릅니다.

1. 무릎에 모노 요오드 아세테이트의 관절 내 주사

1. 1 주일의 순응 후, 체중이 180-200g (4-5 주령) 인 40 마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 무작위로 균등하게 4 개의 그룹 (n = 10 마리의 쥐 / 그룹)으로 나눕니다.
   참고 : 대조군의 쥐는 50μL의 식염수를 관절 내 주사하는 반면, 실험군의 쥐는 각각 50μL의 식염수에 용해 된 0.5, 1.5 또는 3mg의 MIA로 처리됩니다.
2. 주사 당일에 15, 30 및 60 mg / mL 농도의 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)에 MIA 용액을 새로 준비하고 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)에 10 % 펜토 바르비탈 용액을 준비합니다.
   주의 : MIA는 점막, 상부 호흡기, 눈, 피부 및 기타 조직에 매우 파괴적인 영향을 미칩니다. 따라서 용액을 준비 할 때 마스크와 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.
3. 60mg/kg의 케타민과 5mg/kg의 자일라진을 복강주사하여 쥐를 마취합니다(둘 다 식염수로 준비). 마취를 확인하기 위해 핀셋으로 쥐의 발가락을 부드럽게 고정하십시오.
4. 쥐를 등을 향하게하여 놓습니다. 무릎을 면도하고 알코올로 무릎 관절 주변을 닦으십시오.
5. 무릎을 90° 각도로 유지하고 슬개골 아래의 흰색 슬개건을 드러냅니다. 슬개골을 손가락 끝으로 눌러 슬개골 아래의 틈을 찾습니다.
6. 간격과 측면 슬개건의 교차점을 주사 부위로 선택하십시오. 그런 다음 26G 바늘을 약 5mm 부위에 수직으로 삽입합니다. 바늘이 관절 공간에있을 때 저항이 느껴지지 않아야합니다.
   알림: 바늘을 주사 부위에 수직으로 유지하는 것이 중요합니다.
7. 50μL의 식염수 또는 MIA 용액을 관절강에 주입합니다. 천천히 바늘을 빼내고 주사 부위 주위에 거즈 조각을 감싸 역류와 누출을 최소화하십시오. 마취 회복 후 거즈를 제거하십시오.
8. 섹션 2에 설명된 대로 주사 후 1, 7, 14, 21, 28 및 35일에 통증 관련 행동을 테스트합니다.

2. 행동 평가

1. 기계적 인출 임계 값 (MWT)
   참고 : MWT는 폰 프레이 테스트¹³ 에 의해 측정되었으며 관찰자는 동물이받은 주사에 눈이 멀었다.
   1. 테이블 위 50cm에 철망 받침대가 매달려있는 높은 플라스틱 케이지 (17cm x 11cm x 13cm)에 쥐를 놓습니다. 테스트 환경이 조용한지 확인하고 쥐가 환경에 적응할 수 있도록 30 분을줍니다.
   2. 폰 프레이 바늘을 각 쥐의 뒷발의 발바닥 표면에 수직으로 누르십시오. 발을 들어 올리거나 발을 핥을 때까지 압력을 점차적으로 (약 20g / s) 선형으로 높입니다.
   3. 임계값이 최소 인발력이 되도록 이전 임계값보다 낮은 힘을 사용합니다. 각 쥐를 최소 3-5분 간격으로 3회 이상 테스트합니다.
   4. 발 철수 반사를 유도하는 최소 힘을 기록합니다. 데이터를 쥐의 MWT로 평균화한다.
2. 열 인출 대기 시간(TWL)
   참고: TWL은 발바닥 테스트 장치(재료 표)를 사용하여 측정되었으며 관찰자는 동물이 받은 주사에 대해 눈을 멀게 했습니다.
   1. 3mm 두께의 유리판에 플렉시 유리 상자 (60cm x 20cm x 14cm, 6 개의 구획으로 나뉩니다)를 놓고 쥐를 상자에 넣습니다 (각 구획에 하나씩). 환경이 조용하고 실내 온도가 일정한지 확인하십시오.
   2. 쥐에게 테스트 환경에 적응할 수 있도록 30 분을줍니다.
   3. 적외선 복사계를 통해 열 자극을 보정합니다. 원하는 적외선 강도를 70 단위로 설정합니다.
   4. 적외선 방출기/감지기를 테스트 중인 발 중앙 바로 아래 컨테이너에 놓습니다.
   5. 시작 버튼을 누릅니다. 타이머가 자동으로 시작됩니다. 컨트롤러는 발의 움직임이 발생하는 즉시 자동으로 적외선을 끄고 타이머를 완전히 중지합니다.
   6. 발 철수 및 발 핥기의 출현시 반응 시간을 기록하십시오.
      알림: 검사에 대한 긍정적 인 반응은 발 철수 및 발 핥기로 간주됩니다. 발 철수 만 발생하면 긍정적 인 반응보다는 쥐의 자발적인 움직임으로 간주되어야합니다.
   7. 테스트를 세 번 이상 반복하십시오. 데이터를 쥐의 TWL로 평균화합니다.
      알림: 복사열의 각 노출은 20초를 초과해서는 안 됩니다. 같은 뒷발에 대한 적외선 자극은 적어도 3-5 분 떨어져 있어야합니다.
3. 보행 패턴 분석
   참고 : 보행 패턴 분석은 이미징 시스템 (재료 표)을 사용하여 측정되었으며 관찰자는 동물이받은 주사에 눈이 멀었습니다.
   1. 보행실의 양쪽 끝에 있는 손잡이를 사용하여 보행실의 길이를 쥐에게 적합한 길이(예: 61cm)로 조정합니다.
   2. 쥐를 보행 칸에 넣고 공식 실험 전에 5cm / s의 속도로 최소 18 단계 사이클 동안 중단없이 달리도록 쥐를 훈련시킵니다.
      알림: 쥐를 보행 실에 처음 배치하면 속도를 약 20cm / s로 설정하고 약 2 초 동안 달릴 때 끌 수 있습니다. 그런 다음 속도를 18cm/s로 설정합니다. 걷는 동안 쥐가 멈추거나 후퇴하는 경우 칸막이로 쥐의 등을 부드럽게 두 드리십시오. 속도를 18cm/s에서 10cm/s로 점차 줄이십시오. 쥐가 결국 검사를 수행하지 못하면 검사를 위해 다른 쥐를 선택하는 것이 허용됩니다.
   3. 목표 속도(18cm/s)에 도달할 때까지 트레드밀의 속도를 천천히 높입니다. 투명 트레드밀 벨트 아래에 장착된 고속 디지털 비디오 카메라로 쥐의 지속적인 움직임에 대한 최소 5초 비디오를 캡처합니다.
   4. 각 쥐를 최소 5분 간격으로 테스트하여 최소 3회 중단 없는 실행을 얻습니다.
   5. "경계 상자"를 그려 이미징 소프트웨어에서 동물 보행 이미지의 경계를 정의하고 각 비디오의 실행 속도를 입력합니다. 비디오를 그룹으로 선택하고 소프트웨어에서 자동으로 비디오를 처리합니다. 비디오를 처리 한 후 소프트웨어는 자세, 스윙, 제동, 추진, 케이던스, 걸음 수 등을 포함한 보행 지수를보고하기 위해 여러 스프레드 시트를 출력합니다.
   6. 총 발 면적(cm²), 평균 보폭(cm) 및 결합 보폭 길이를 계산합니다.
      참고: 총 발 면적은 각 쥐 그룹의 4개 발의 총 면적의 평균이고 발 면적은 스텝 사이클의 자세 단계 동안 트레드밀과 접촉하는 최대 발 면적으로 정의됩니다. 보폭은 한 번의 완전한 보폭에서 동일한 발의 초기 접촉 사이의 거리입니다. 단위 보폭 = 평균 보폭(cm)/신체 길이(cm).

3. 조직병리학 및 면역조직화학적 분석

1. 150 mg / kg (식염수에서 준비)의 펜토 바르 비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 쥐를 안락사시킨다. 조직학적 분석을 위해 무릎 관절을 즉시 절제합니다.
2. 관절을 10% 포르말린에 24시간 동안 고정하고 인산염 완충 식염수(PBS)에서 10% EDTA로 8주 동안 석회질을 제거한 다음 관절을 파라핀에 삽입합니다.
   주의: 포르말린은 눈, 피부 및 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 후드에서 다루어야합니다.
3. 파라핀 포매 조인트를 마이크로톰으로 3 mm 두께로 절편하고 증류수를 함유하는 40°C 수조에 띄운다.
4. 섹션을 유리 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 밤새 건조시키고 슬라이드를 실온(RT)에서 보관하여 다음 염색을 계속합니다.
5. 슬라이드를 60°C 오븐에 4시간 동안 넣어 분리합니다.
6. 슬라이드를 RT에서 각각 5 분 동안 자일 렌, 자일 렌, 100 % 에탄올, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 80 % 에탄올 및 75 % 에탄올에 연속적으로 담그십시오.
7. 3.8-3.12 단계에 설명된 바와 같이 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), 사프라닌-O (SO) 및 알시안 블루 헤마톡실린(ABH) 뿐만 아니라 래트 유형 II 콜라겐(Col2), X형 콜라겐(Col10) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 13(MMP13)에 대한 항체로 절편을 염색합니다.
8. H&E 염색
   1. 탈이온화된_H2O로 슬라이드를 3분 동안 헹굽니다. 헤마톡실린으로 슬라이드를 3-5분 동안 염색합니다.
   2. 표면에 헤마톡실린이 남지 않을 때까지 탈이온화된_H2O3x로 슬라이드를 각각 1분씩 헹굽니다.
   3. 30 초 동안 에오신으로 슬라이드를 얼룩지게하십시오. 그런 다음 표면에 에오신이 남지 않을 때까지 탈이온화된_H2O3x로 슬라이드를 각각 1분씩 헹굽니다.
   4. 슬라이드를 0.1 % 암모니아에 10-20 초 동안 담그십시오. 이어서, 슬라이드를 탈이온화된_H2O3x로 각각 1분씩 헹구었다.
   5. 슬라이드를 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌, 자일 렌 및 크실렌에 각각 1 분 동안 연속적으로 담그십시오.
   6. 중성 수지로 슬라이드를 커버슬립합니다.
9. SO 염색
   1. 탈이온화된_H2O로 슬라이드를 3분 동안 헹굽니다. 헤마톡실린으로 슬라이드를 3-5분 동안 염색합니다.
   2. 1 % 산성 알코올 (약 3 초)로 빠르게 구별하십시오. 그런 다음 표면에 헤마톡실린이 남지 않을 때까지 탈이온화된_H2O3x로 슬라이드를 각각 1분씩 헹굽니다.
   3. 패스트 그린(FCF) 용액으로 슬라이드를 5분 동안 염색합니다. 이어서, 슬라이드를 탈이온화된_H2O3x로 각각 1분씩 헹구었다.
   4. SO로 슬라이드를 1-2분 동안 염색합니다. 이어서, 슬라이드를 탈이온화된_H2O3x로 각각 1분씩 헹구었다.
   5. 슬라이드를 1% 아세트산으로 1-2분 동안 헹구어 잔류 FCF를 제거합니다. 탈이온화된_H2O로 슬라이드를 1분 동안 헹굽니다.
   6. 슬라이드를 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌, 자일 렌 및 크실렌에 각각 1 분 동안 연속적으로 담그십시오.
   7. 중성 수지로 슬라이드를 커버슬립합니다.
10. ABH 염색
    1. 탈이온화된_H2O로 슬라이드를 3분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 1 % 산성 알코올에 30 초 동안 담그고 종이 타월로 잠시 물기를 뺍니다 (헹구지 마십시오).
    2. 슬라이드를 ABH에 1시간 동안 담그십시오. 그런 다음 표면에 ABH가 남지 않을 때까지 탈이온화된_H2O3x로 슬라이드를 각각 1분씩 헹굽니다.
    3. 1 % 산성 알코올 (약 3 초)로 빠르게 구별하십시오. 탈이온화된_H2O3x로 슬라이드를 각각 1분 동안 헹굽니다.
    4. 슬라이드를 0.5 % 암모늄 물에 15 초 동안 담그십시오. 이어서, 슬라이드를 탈이온화된_H2O3x로 각각 1분씩 헹구었다.
    5. 슬라이드를 95 % 에탄올에 1 분 동안 담그십시오. 슬라이드를 에오신/오렌지 G 용액에 1.5분 동안 담그십시오.
    6. 슬라이드를 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌, 자일 렌 및 크실렌에 각각 1 분 동안 연속적으로 담그십시오.
    7. 중성 수지로 슬라이드를 커버슬립합니다.
11. 현미경으로 모든 슬라이드를 검사하고 Mankin의 채점 시스템 14에 따라 이중 맹검 관찰을 통해^0-13의 척도로 통계적으로 등급을 매깁니다.
12. 면역 조직 화학
    1. 탈이온화된_H2O로 슬라이드를 3분 동안 헹굽니다.
    2. 슬라이드를 0.1M 시트르산나트륨에 담그고 슬라이드를 60°C 오븐에 4시간 동안 두어 항원을 회수합니다.
    3. 슬라이드를 PBS의 0.3% 트리톤 X-100에 10분 동안 담그십시오. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 2x, 각각 3분 동안 헹굽니다.
    4. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해 RT에서 메탄올 중 3 % H 2 O₂용액에서 10 분 동안 절편을 배양한다. PBS로 슬라이드를 2x, 각각 3분 동안 헹굽니다.
    5. 절편을 PBS 중 5% 염소 혈청으로 RT에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다. PBS로 슬라이드를 2x, 각각 3분 동안 헹굽니다.
    6. 래트 II형 콜라겐(Col2), X형 콜라겐(Col10) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 13(MMP13)에 대한 1차 항체 100μL의 PBS 희석(1:1,000) 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 절편을 배양합니다. PBS로 슬라이드를 2x, 각각 3분 동안 헹굽니다.
    7. 절편을 100μL의 PBS-희석된(1:1,000) 2차 항체(염소 항-마우스 2차 또는 염소 항-마우스 2차)로 RT에서 20분 동안 배양합니다. PBS로 슬라이드를 2x, 각각 3분 동안 헹굽니다.
    8. 100μL의 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 작업 용액으로 절편을 배양합니다. 발색 반응이 에피토프 부위를 갈색으로 변하게 할 때 반응을 모니터링합니다.
       주의 : DAB는 발암 물질입니다. DAB로 작업할 때는 항상 장갑을 끼고 후드에서 작업하십시오.
       알림: 발색 시간은 몇 초에서 10 분까지 다를 수 있습니다.
    9. 섹션에서 갈색이 발생하자마자 탈 이온화 된 H₂O 2x로 슬라이드를 각각 3 분 동안 헹굽니다.
    10. 슬라이드를 헤마톡실린에 1-2분 동안 담그면 슬라이드가 염색됩니다. 이어서, 슬라이드를 탈이온화된_H2O3x로 각각 1분씩 헹구었다.
    11. 슬라이드를 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌, 자일 렌 및 크실렌에 각각 1 분 동안 연속적으로 담그십시오.
    12. 중성 수지로 슬라이드를 커버슬립합니다.
    13. 현미경으로 단면에서 항체 염색의 색상을 관찰하십시오.

결과

이 방법론을 사용하여 쥐에서 OA 통증 모델을 설정하고 결과 변화를 감지했습니다. MWT와 TWL은 각각 기계적 이질통과 열통과민을 반영했다. 도 1에 나타낸 바와 같이, MIA는 용량 의존적 방식으로 존재하는 기계적 이질통 및 열통각과민을 유도하였다. 놀랍게도, MWT의 감소는 21 일에서 28 일로 정점에 도달 한 다음 반등하여이 단계에서 관절 복구가 발생할 수 있음을 시사하지만 ...

토론

MIA에 의해 유도 된 OA의 쥐 모델은 잘 확립되고 널리 사용되는 모델입니다. MIA의 관절 내 주사는 초기에 중증 및 급성 염증을 유발하여 OA^17,18의 더 길고 퇴행성 단계를 유발합니다. 이 연구에서 우리는 MWT와 TWL로 통각 감도를 측정하고 이미징 시스템으로 보행 변화를 평가했습니다. 이전 보고서에 따르면 MIA를 주사하면 통각으로 이어지는 구 심성 무릎 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Collagen II antibody	Abcam(UK)	34712	Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)
Anti-Collagen X (Col10) antibody	Abcam(UK)	49945	Primary antibody for IHC
DigiGait Imaging System	Mouse Specifics (Boston, MA, USA)		Equipment for gait patterns analyses
Eosin	Sigma-Aldrich	861006	The dye for HE staining
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9002	Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody	ZSGQ-BIO (Beijing, China)	PV-9001	Secondary antibody for IHC
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3163	The dye for HE staining
MIA	Sigma-Aldrich	I4386-10G	powder
MMP13	Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)	69926	Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks.
Plantar Test apparatus	UgoBasile (Italy)	37370	Equipment for TWL assay
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)	RR037A	Extracte total RNA from cultured cells
Rotary and Sliding Microtomes	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Precise paraffin sections.
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	The dye for SO staining
Tissue-Tek VIP 5 Jr	Sakura (Japan)		Vacuum Infiltration Processor