Un protocolo estandarizado para las pruebas de preferencias para evaluar el bienestar de los peces

Resumen

Un aspecto fundamental de la evaluación del bienestar de los animales en cautiverio es preguntar si los animales tienen lo que quieren. Aquí, presentamos un protocolo para determinar la preferencia de vivienda en el pez cebra (Danio rerio) con respecto a la presencia/ausencia de enriquecimiento ambiental y el acceso al flujo de agua.

Resumen

Las técnicas de evaluación del bienestar animal tratan de tener en cuenta las necesidades y deseos específicos del animal en cuestión. Proporcionar enriquecimiento (la adición de objetos físicos o conespecíficos en el entorno de la vivienda) es a menudo una manera de dar a los animales cautivos la oportunidad de elegir con quién o con qué interactúan y cómo pasan su tiempo. Un componente fundamental del medio acuático que a menudo se pasa por alto en cautiverio, sin embargo, es la capacidad para que el animal elija realizar ejercicio físico. Para muchos animales, incluyendo peces, el ejercicio es un aspecto importante de su historia de vida, y se sabe que tienen muchos beneficios para la salud, incluyendo cambios positivos en el cerebro y el comportamiento. Aquí presentamos un método para evaluar las preferencias de hábitat en animales cautivos. El protocolo podría adaptarse fácilmente para examinar una variedad de factores ambientales (por ejemplo, grava frente a arena como sustrato, plantas plásticas frente a plantas vivas, bajo caudal frente a alto flujo de agua) en diferentes especies acuáticas, o para su uso con especies terrestres. La evaluación estadística de la preferencia se lleva a cabo utilizando el índice de preferencias de Jacob, que clasifica los hábitats de -1 (evitación) a +1 (la más preferida). Con esta información, se puede determinar lo que el animal quiere desde una perspectiva de bienestar, incluyendo su ubicación preferida.

Introducción

Las normas que rigen la forma en que los animales de laboratorio deben ser alojados en cautiverio son explícitas y bien definidas. La Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Animal de Laboratorio (AAALAC) International supervisa y administra todas las organizaciones e instituciones que trabajan con animales de investigación y tiene directrices específicas para la cría y la vivienda apropiadas para las especies. Por ejemplo, la Guía de la AAALAC sobre la vivienda y el cuidado del pez cebra, Danio Rerio¹ "alienta fuertemente" el uso del enriquecimiento (la adición de objetos físicos o conespecíficos en el entorno de la vivienda) cuando se aloja el pez cebra en cautiverio. La guía continúa afirmando: "Proporcionar plantas o estructuras artificiales que imitan el hábitat del pez cebra permiten a los animales una opción dentro de su entorno".

La evidencia sugiere que el enriquecimiento puede estimular el crecimiento de nuevas neuronas (neurogénesis) en áreas del cerebro implicadas en el procesamiento de información espacial^2,y se cree que estos cambios neuronales están asociados con mayor capacidad de aprendizaje³. Los efectos del enriquecimiento en la neurogénesis y el aprendizaje han sido ampliamente estudiados en varios taxones, incluyendo peces^4,5,aves⁶, reptiles^7,y mamíferos⁸. Aunque estos tipos de estudios son importantes para entender los efectos del enriquecimiento en el cerebro y el comportamiento, no tienen en cuenta las opciones o preferencias particulares de los animales para un entorno en particular sobre otro.

Una pregunta fundamental a hacer al evaluar el bienestar de los animales cautivos es si los animales tienen o no lo que quieren⁹. Una manera de investigar esta pregunta que proporciona evidencia tangible es proporcionar a los animales opciones que nos permitan entender sus preferencias subjetivas. Por ejemplo, dos estudios han investigado si el pez cebra prefiere el acceso a un entorno enriquecido o llano, con ambos estudios indicando una preferencia por las áreas que contienen enriquecimiento^10,11. Sin embargo, también se ha sugerido que el pez cebra parece indiferente al enriquecimiento ambiental^12,por lo que la respuesta a la pregunta obviamente no es clara. Otra aplicación de las pruebas de preferencias asociadas con el bienestar animal se extiende a tratar de entender cómo diferentes aspectos de un entorno enriquecido juegan un papel en las decisiones que hace un animal individual. Sólo en peces, diferentes tipos de enriquecimiento tienen efectos diferenciales sobre el cerebro y el comportamiento, y esta relación se complica aún más por las diferencias individuales en los rasgos de personalidad¹³. Además, las pruebas de preferencias podrían ser útiles para estudios comparativos de enriquecimiento ambiental. Incluso a través de diferentes especies de peces, se ha demostrado que el enriquecimiento tiene un efecto en muchos tipos diferentes de comportamiento, incluyendo la agresión^14,audacia¹⁵, locomoción^16,y comportamiento de toma de riesgos¹⁷.

El índice de preferencias de Jacob es una prueba estadística que se utiliza con frecuencia para cuantificar las preferencias de vivienda^18. El índice de preferencias de Jacob asigna un valor a cada hábitat diferente basado en el número de animales presentes en cada tipo de hábitat en diferentes puntos de tiempo, donde la preferencia oscila entre -1 (evitación) y +1 (la más preferida). Aquí describimos un método para utilizar el índice de preferencias de Jacob para investigar las preferencias de vivienda en los peces y utilizar el ejemplo de la evaluación de dos características importantes del medio acuático: 1) la presencia o ausencia de enriquecimiento; y 2) el flujo de agua¹⁹. Sin embargo, el protocolo podría adaptarse fácilmente para examinar una variedad de factores ambientales (por ejemplo, grava frente a arena como sustrato, plantas plásticas frente a plantas vivas, bajo versus alto flujo de agua) a través de diferentes especies y paisajes (por ejemplo, acuáticos y terrestres).

Protocolo

El estudio actual tiene aprobación y cumple con todos los requisitos de los protocolos de cuidado y uso de animales de la Universidad Estatal de Pensilvania; IACUC No. 46466.

1. Configuración del aparato de preferencia

1. Obtener la aprobación del Comité de Cuidado Animal del instituto (u organización equivalente) para todos los procedimientos experimentales y de cría que involucren animales vivos antes de comenzar el experimento.
2. Utilice un tanque experimental hecho de plástico blanco opaco. Las paredes entre zonas están hechas de acrílico gris que se fija en su lugar con sellador de silicio.
   NOTA: El tamaño del tanque experimental depende del tamaño de la especie de interés y del número de individuos utilizados (por ejemplo, para 8 peces cebra adultos, se recomienda un tanque de 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H).
3. Divida el tanque experimental en cuatro zonas que varían de acuerdo con los parámetros específicos del hábitat a probar. Ejemplos de diferentes tipos de enriquecimiento a investigar incluyen sustrato arenoso frente a sustrato rocoso, plantas artificiales frente a refugios, o flujo de agua frente a la presencia de plantas artificiales(Figura 1).
   1. Si utiliza el flujo de agua como parámetro de interés, utilice pequeñas bombas para suministrar chorros de agua (ver Tabla de Materiales). Ajuste las bombas a la velocidad elegida para que proporcionen un flujo constante y dirigido de agua. Elija la velocidad deseada en función de la ecología de las especies de interés y la historia de la vida (por ejemplo, 14 cm/s para el pez cebra).
4. En el centro del tanque experimental, tener una arena central donde se entregan los alimentos(Figura 1). El acceso a la arena central desde cada zona es a través de una pequeña abertura en los muros de separación. La abertura es lo suficientemente grande como para que las especies de interés se muevan entre zonas sin obstáculos, pero lo suficientemente pequeña como para reducir las señales visuales que los peces puedan experimentar de otras zonas.
5. Coloque un biofiltro y un calentador en cada esquina del tanque, pero fuera del área experimental para no perturbar el flujo de agua y asegurar una temperatura constante del agua en todas las zonas.
6. Configura tanques experimentales adicionales según lo dicte el espacio. Gire las diferentes zonas en cada tanque experimental para limitar cualquier sesgo secuencial. Asegúrese de que todos los tanques de réplica tengan condiciones uniformes (mismos niveles de luz, temperatura del agua, etc.)
7. Coloque las cámaras (consulte Tabla de materiales)en los trípodes directamente encima de cada tanque experimental, de modo que todas las zonas sean visibles. Evite las lentes de gran angular y asegúrese de que las tarjetas de memoria tengan suficiente espacio para grabar.
8. Ajuste la iluminación de la habitación en un ciclo gradual (por ejemplo, 1/2 h) 12 L: 12 D para simular el amanecer y el atardecer. Mantener la temperatura del agua a 25 oC.

2. Captura, aclimatación y procedimiento

1. Mantenga los peces en los tanques domésticos cuando no estén siendo probados. Net todos los peces de prueba de sus tanques domésticos y colocar en la arena central del tanque experimental (Día 1). Minimice los tiempos de captura para reducir el estrés (por ejemplo, menos de 30 s).
   NOTA: Un procedimiento alternativo para transferir peces de su tanque de origen al tanque experimental que puede minimizar el estrés es transportar a los peces en un vaso de agua del tanque.
2. Mantenga el número y el sexo de los peces en cada tanque experimental constantes a través de tanques de réplica y elija en función del tamaño de la especie y la ecología.
3. En los días 1–4, los peces pasan tiempo aclimatándose y explorando las diferentes zonas. No recopile datos en estos días.
   NOTA: Ampliar o reducir el número de días para la aclimatación dependiendo del protocolo experimental en particular. Sin embargo, el período de aclimatación debe ser suficiente para minimizar los efectos de la manipulación, así como para que los peces se acostumbren a alimentarse en el aparato.
4. Durante el período de aclimatación, controle de cerca la calidad del agua mediante la realización de pruebas periódicas de calidad del agua (por ejemplo, niveles de pH, nitrato o nitrito) y reemplace el agua si se detecta algún problema (ver Tabla de Materiales).
5. Alimentar los alimentos de escamas de pescado (ver Tabla de Materiales) en la arena central utilizando un anillo de comida flotante (ver Tabla de Materiales)unido a la pared de la arena central en la superficie del agua. Un anillo de alimentos garantiza que las partículas de alimentos permanezcan dentro de la arena central y no presenten un sesgo para las zonas debido a la deriva de alimentos.
6. Dar a los peces .5 h para alimentar ad libitum antes de retirar los alimentos sobrantes del tanque experimental con una red de inmersión. Alimentar a los peces una vez por la mañana y una vez por la tarde.
7. Evaluar los comportamientos en los días 5–7. Encienda las cámaras y registre los comportamientos de los peces durante 2 horas después de cada alimentación programada por la mañana y por la tarde. El día 8 retira todos los peces de los tanques experimentales con una red de inmersión y colócalos de nuevo en sus tanques domésticos.
8. Dependiendo de la cantidad de agua de sumidero disponible, reemplace al menos un 1/3 de agua en el tanque experimental con agua fresca para reducir los efectos de las hormonas del estrés en los peces en las siguientes réplicas.
9. Configure los tanques experimentales de acuerdo con el horario de rotación de la zona para esa semana. La rotación de las zonas disminuye la posibilidad de que se produzca cualquier sesgo de comportamiento como resultado de la colocación de cualquier zona en relación entre sí. A continuación, comience el proceso de prueba de nuevo con un nuevo lote de pescado.

3. Mediciones y análisis de datos

1. Descargue los vídeos en un ordenador al final de cada día de grabación. Esto garantiza que haya espacio en la tarjeta de memoria antes de cada uso.
2. Utilice el software de vídeo (consulte Tabla de materiales)para cuantificar la preferencia de zona. Cuente manualmente el número de peces en cada zona a intervalos de 5 minutos en cada período de grabación de 2 h (incluya la arena central en estos recuentos). Defina el género de los peces durante el análisis si la diferenciación entre machos y hembras es posible a partir de las imágenes de vídeo.
3. Para analizar la preferencia de hábitat, calcule el número medio de peces por zona para cada tanque de réplica (es decir, promedio de todos los datos a lo largo de los 3 días). Para obtener una puntuación de preferencia para el uso de la estructura, calcule el índice de preferencias¹⁵ de Jacobs como
   
   J (r_x á p)/[(r_x + p) – 2*r_x*p]
   
   donde x es la zona de interés, r_x es la relación entre los peces en la zona x y el número total de peces en todas las zonas, y p es la proporción disponible de todas las zonas del tanque experimental. El índice oscila entre +1 para la preferencia máxima y el número 1 para la máxima evitación.
4. Para determinar si hay algún cambio en la velocidad a la que los peces cambian entre zonas durante un período de observación, calcule la velocidad de conmutación, r_sr, en los primeros y últimos 5 min de cada período de observación, donde r_sr es el número de veces que un pez entra en cada zona desde la arena central, dividido por el número total de peces.
5. Considere que un pez ha entrado en una zona cuando todo el cuerpo del pez cruza a través de la abertura que separa las zonas. Calcule una velocidad de conmutación media de arranque y de acabado para cada tanque de réplica. Llevar a cabo todas las observaciones conductuales por el mismo experimentador para reducir cualquier sesgo de observación del experimentador.
6. Utilizando software estadístico (ver Tabla de Materiales),realizar análisis estadísticos relevantes. Los análisis sugeridos incluyen un ANOVA unidireccional, con el índice de preferencia como variable dependiente y zona como variable predictora, y una prueba t emparejada en la velocidad media de conmutación inicial y final para cada tanque.
7. Aplique la prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey para investigar más a fondo las comparaciones de zona, donde cada zona se compara entre sí. El análisis estadístico más complejo incluye modelos mixtos que evalúan los efectos del tiempo, los efectos de la arena, los efectos sexuales o incluso las diferencias individuales en el comportamiento.

Resultados

Utilizamos la prueba de preferencia para investigar las preferencias de vivienda en peces cebra dada la opción entre el enriquecimiento variable, incluyendo 1) plantas de plástico y sustrato arenoso; y 2) flujo de agua. Estos se dividieron en cuatro zonas: (i) Sólo enriquecido; (ii) Sólo flujo; (iii) Enriquecido y Flujo; (iv) Llano; y un estadio central donde se entregó comida¹⁹. El pez cebra mostró la preferencia más alta por la zona Enriquecido y Flujo, que era significativamente diferent...

Discusión

Aquí presentamos un diseño experimental que nos permite investigar las preferencias de los peces para diferentes tipos de hábitats. Algunos pasos críticos que son importantes en las pruebas de preferencias incluyen: 1) asegurar que se mantengan condiciones uniformes en diferentes réplicas (por ejemplo, ruidos o movimientos externos, experimentador, química del agua, niveles de luz); 2) garantizar que las zonas se rotan entre réplicas y que una cantidad significativa de agua se sustituye por agua fresca de sumidero...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Aquarium Plants	Smarlin	B07PDZQ5M5
Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Experimental tanks	United State Plastic Corporation	6106
Floating food ring	SunGrow	B07M6VWH9V
Flow meter	YSI	BA1100
Jager Aquarium Thermostat Heater	Ehiem	3619090
Master Water Quality Test Kit	API	34
SPSS Statistics for Macintosh	IBM	Version 25.0
Submersible Pump, SL-	Songlong	SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee's	13405
Video camera	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (video software)	Microsoft	Windows Media Player 12