Um protocolo padronizado para testes de preferência para avaliar o bem-estar dos peixes

Resumo

Um aspecto fundamental da avaliação do bem-estar dos animais em cativeiro é perguntar se os animais têm o que querem. Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a preferência habitacional no zebrafish (Danio rerio) no que diz respeito à presença/ausência de enriquecimento ambiental e acesso ao fluxo de água.

Resumo

Técnicas de avaliação do bem-estar animal tentam levar em consideração as necessidades e desejos específicos do animal em questão. Proporcionar enriquecimento (a adição de objetos físicos ou conespecificidades no ambiente habitacional) é muitas vezes uma forma de dar aos animais em cativeiro a oportunidade de escolher com quem ou com o que interagem e como passam seu tempo. Um componente fundamental do ambiente aquático que muitas vezes é negligenciado em cativeiro, no entanto, é a capacidade do animal optar por se envolver em exercícios físicos. Para muitos animais, incluindo peixes, o exercício é um aspecto importante de sua história de vida, e é conhecido por ter muitos benefícios para a saúde, incluindo mudanças positivas no cérebro e comportamento. Aqui apresentamos um método para avaliar as preferências do habitat em animais em cativeiro. O protocolo poderia ser facilmente adaptado para olhar para uma variedade de fatores ambientais (por exemplo, cascalho versus areia como um substrato, plantas plásticas versus plantas vivas, baixo fluxo versus alto fluxo de água) em diferentes espécies aquáticas, ou para uso com espécies terrestres. A avaliação estatística da preferência é realizada utilizando o índice de preferência de Jacó, que classifica os habitats de -1 (evasão) a +1 (mais preferido). Com essas informações, pode-se determinar o que o animal quer de uma perspectiva de bem-estar social, incluindo sua localização preferida.

Introdução

Os regulamentos que regem como os animais de laboratório devem ser alojados em cativeiro são explícitos e bem definidos. A Associação de Avaliação e Acreditação da Atenção Animal Laboratorial (AAALAC) International supervisiona e gerencia todas as organizações e instituições que trabalham com animais de pesquisa e possui diretrizes específicas para a pecuária e habitação adequadas às espécies. Por exemplo, a Orientação sobre a Habitação e Cuidado de Zebrafish da AAALAC, Danio Rerio¹ "incentiva fortemente" o uso de enriquecimento (a adição de objetos físicos ou conespecificidades no ambiente habitacional) ao abrigar zebrafish em cativeiro. O guia continua a afirmar: "Fornecer plantas artificiais ou estruturas que imitam o habitat dos zebrafish permitem aos animais uma escolha dentro de seu ambiente".

Evidências sugerem que o enriquecimento pode estimular o crescimento de novos neurônios (neurogênese) em áreas do cérebro envolvidas no processamento de informações espaciais², e acredita-se que essas alterações neurais estão associadas à capacidade de aprendizagem aprimorada³. Os efeitos do enriquecimento na neurogênese e na aprendizagem têm sido amplamente estudados em várias taxas, incluindo^{peixes 4,5}, aves^6,répteis⁷e mamíferos⁸. Embora esses tipos de estudos sejam importantes para entender os efeitos do enriquecimento no cérebro e no comportamento, eles não levam em consideração as escolhas ou preferências particulares dos animais para um determinado ambiente em vez de outro.

Uma pergunta fundamental a ser questionada ao avaliar o bem-estar dos animais em cativeiro é se os animais têm ou não o que querem⁹. Uma forma de investigar essa questão que fornece evidências tangíveis é fornecer aos animais escolhas que nos permitam entender suas preferências subjetivas. Por exemplo, dois estudos investigaram se os zebrafish preferem o acesso a um ambiente enriquecido ou simples, com ambos os estudos indicando preferência por áreas que contenham enriquecimento^10,11. No entanto, também foi sugerido que os zebrafish parecem indiferentes ao enriquecimento ambiental¹², de modo que a resposta à pergunta obviamente não é clara. Outra aplicação de testes de preferência associados ao bem-estar animal se estende a tentar entender como diferentes aspectos de um ambiente enriquecido desempenham um papel nas escolhas que um animal faz. Só no peixe, diferentes tipos de enriquecimento têm efeitos diferenciais no cérebro e no comportamento, e essa relação é ainda mais complicada por diferenças individuais nos traços de personalidade¹³. Além disso, os testes de preferência podem ser úteis para estudos comparativos de enriquecimento ambiental. Mesmo em diferentes espécies de peixes, o enriquecimento tem se mostrado um efeito em muitos tipos diferentes de comportamento, incluindo agressão¹⁴, ousadia¹⁵, locomoção¹⁶, e comportamento de risco¹⁷.

O índice de preferência de Jacob é um teste estatístico que é usado com frequência para quantificar as preferências habitacionais¹⁸. O índice de preferência de Jacob atribui um valor a cada habitat diferente com base no número de animais presentes em cada tipo de habitat em diferentes pontos de tempo, onde a preferência varia de -1 (evasão) a +1 (mais preferida). Aqui descrevemos um método de uso do índice de preferência de Jacó para investigar as preferências habitacionais em peixes e usar o exemplo de avaliação de duas características importantes do ambiente aquático: 1) a presença ou ausência de enriquecimento; e 2) o fluxo de água¹⁹. No entanto, o protocolo poderia ser facilmente adaptado para olhar para uma variedade de fatores ambientais (por exemplo, cascalho versus areia como um substrato, plantas plásticas versus plantas vivas, baixo versus alto fluxo de água) em diferentes espécies e paisagens (por exemplo, aquáticas e terrestres).

Protocolo

O presente estudo tem aprovação e cumpre todos os requisitos dos protocolos de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual da Pensilvânia; IACUC nº 46466.

1. Configuração do aparelho de preferência

1. Obter aprovação do Comitê de Cuidados Com Animais (ou organização equivalente) do instituto para todos os procedimentos experimentais e de criação envolvendo animais vivos antes de começar o experimento.
2. Use um tanque experimental feito de plástico branco opaco. As paredes entre as zonas são feitas de acrílico cinza que é fixado no lugar com selante de silício.
   NOTA: O tamanho do tanque experimental depende do tamanho das espécies de interesse e recomenda-se o número de indivíduos utilizados (por exemplo, para 8 zebrafish adultos, recomenda-se um tanque de 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H).
3. Divida o tanque experimental em quatro zonas que variam de acordo com os parâmetros específicos de habitat a serem testados. Exemplos de diferentes tipos de enriquecimento para investigar incluem substrato arenoso vs. rochoso, plantas artificiais versus abrigos, ou fluxo de água versus presença de plantas artificiais(Figura 1).
   1. Se usar o fluxo de água como parâmetro de interesse, use pequenas bombas para abastecer jatos de água (ver Tabela de Materiais). Coloque as bombas em uma velocidade escolhida para que elas forneçam um fluxo constante e direcionado de água. Escolha a velocidade desejada com base na ecologia e história da vida das espécies de interesse (por exemplo, 14 cm/s para zebrafish).
4. No meio do tanque experimental, tenha uma arena central onde a comida é entregue(Figura 1). O acesso à arena central de cada zona é através de uma pequena abertura nas paredes separadas. A abertura é grande o suficiente para que as espécies de interesse se movam entre zonas sem obstáculos, mas pequenas o suficiente para reduzir quaisquer pistas visuais que o peixe possa experimentar de outras zonas.
5. Coloque um biofiltro e um aquecedor em cada canto do tanque, mas fora da área experimental para não perturbar o fluxo de água e garantir uma temperatura constante da água em todas as zonas.
6. Configure tanques experimentais adicionais à medida que o espaço dita. Gire as diferentes zonas em cada tanque experimental para limitar qualquer viés sequencial. Certifique-se de que todos os tanques de replicação tenham condições uniformes (mesmos níveis de luz, temperatura da água, etc.)
7. Coloque as câmeras (ver Tabela de Materiais)em tripés diretamente acima de cada tanque experimental, para que todas as zonas sejam visíveis. Evite lentes de grande angular e certifique-se de que os cartões de memória tenham espaço suficiente para gravação.
8. Coloque a iluminação da sala em um gradual (por exemplo, 1/2 h) 12 L: ciclo 12 D para simular nascer do sol e pôr do sol. Mantenha a temperatura da água em 25 ± 1 °C.

2. Captura, aclimatação e procedimento

1. Mantenha peixes em tanques domésticos quando não estiverem sendo testados. Rede todos os peixes de teste de seus tanques domésticos e coloque na arena central do tanque experimental (Dia 1). Minimizar os tempos de captura para reduzir o estresse (por exemplo, menos de 30 s).
   NOTA: Um procedimento alternativo para transferir peixes de seu tanque de casa para o tanque experimental que pode minimizar o estresse é transportar o peixe em um feixe de água do tanque.
2. Mantenha o número e o sexo dos peixes em cada tanque experimental constante em tanques de replicação e escolha com base no tamanho da espécie e ecologia.
3. Nos dias 1 a 4, os peixes passam um tempo aclimatando e explorando as diferentes zonas. Não colete dados nestes dias.
   NOTA: Estender ou reduzir o número de dias para aclimatação, dependendo do protocolo experimental específico. No entanto, o período de aclimatação deve ser suficiente para minimizar os efeitos do manuseio, bem como para que o peixe esteja acostumado a se alimentar no aparelho.
4. Durante o período de aclimatação, monitore a qualidade da água de perto realizando testes regulares de qualidade da água (por exemplo, pH, nitrato ou níveis de nitrito) e substitua a água se houver algum problema (ver Tabela de Materiais).
5. Alimente os alimentos do floco de peixe (ver Mesa de Materiais) na arena central usando um anel de alimento flutuante (ver Mesa de Materiais) preso à parede da arena central na superfície da água. Um anel alimentar garante que as partículas de alimentos permaneçam dentro da arena central e não apresentem um viés para zonas devido à deriva alimentar.
6. Dê ao peixe .5 h para alimentar o libitum de anúncio antes de remover o alimento restante do tanque experimental com uma rede de mergulho. Alimente o peixe uma vez pela manhã e uma vez à tarde.
7. Avalie os comportamentos nos dias 5 e 7. Ligue as câmeras e grave comportamentos de peixe por 2h depois de cada alimentação programada de manhã e tarde. No dia 8 remover todos os peixes dos tanques experimentais com uma rede de mergulho e colocá-los de volta em seus tanques domésticos.
8. Dependendo da quantidade de água sump disponível, substitua pelo menos um 1/3 da água no tanque experimental por água fresca para reduzir quaisquer efeitos dos hormônios do estresse nos peixes nas seguintes réplicas.
9. Configure os tanques experimentais de acordo com o cronograma de rotação da zona para essa semana. A rotação das zonas diminui a chance de qualquer viés comportamental ocorrer como resultado da colocação de qualquer zona em relação uma si. Em seguida, comece o processo de teste novamente com um novo lote de peixes.

3. Medições e análise de dados

1. Baixe os vídeos para um computador no final de cada dia de gravação. Isso garante que há espaço no cartão de memória antes de cada uso.
2. Use software de vídeo (ver Tabela de Materiais) para quantificar a preferência da zona. Conte manualmente o número de peixes em cada zona em intervalos de 5 minutos em cada período de gravação de 2h (inclua a arena central nessas contagens). Defina o sexo do peixe durante a análise se a diferenciação entre machos e fêmeas é possível a partir do vídeo.
3. Para analisar a preferência do habitat, calcule o número médio de peixes por zona para cada tanque de replicação (ou seja, média de todos os dados ao longo dos 3 dias). Para obter uma pontuação de preferência para uso da estrutura, calcule o índice de preferência de Jacobs¹⁵ como
   
   J =(r_x − p)/[(r_x + p) – 2*r_x*p]
   
   onde x é a zona de interesse, r_x é a razão do peixe na zona x para o número total de peixes em todas as zonas, e p é a proporção disponível de todas as zonas no tanque experimental. O índice varia entre +1 para preferência máxima e −1 para máxima evasão.
4. Para determinar se há alguma alteração na taxa em que os peixes alternam entre as zonas durante um período de observação, calcule a taxa de switch, r_sr,no primeiro e último 5 min de cada período de observação, onde r_sr é o número de vezes que um peixe entra em cada zona da arena central, dividido pelo número total de peixes.
5. Considere um peixe ter entrado em uma zona quando todo o corpo do peixe cruza a abertura separando as zonas. Calcule uma taxa de switch média de partida e acabamento para cada tanque de replicação. Realize todas as observações comportamentais do mesmo experimentador para reduzir qualquer viés de observação experimentador.
6. Utilizando software estatístico (ver Tabela de Materiais),realizar análises estatísticas relevantes. As análises sugeridas incluem uma ANOVA unidirecional, com índice de preferência como variável dependente e zona como variável preditor, e um teste t emparelhado na taxa de switch média inicial e de acabamento para cada tanque.
7. Aplique o teste pós-hoc pós-comparação múltipla de Tukey para investigar ainda mais comparações de zonas, onde cada zona é comparada entre si. Análiseestatística mais complexa inclui modelos mistos que avaliam efeitos do tempo, efeitos de arena, efeitos sexuais ou até mesmo diferenças individuais de comportamento.

Resultados

Usamos o teste de preferência para investigar preferências de moradia em zebrafish dada uma escolha entre o enriquecimento variável, incluindo 1) plantas plásticas e substrato arenoso; e 2) fluxo de água. Estas foram divididas em quatro zonas: (i) Somente Enriquecida; (ii) Somente fluxo; (iii) Enriquecimento e Fluxo; (iv) Planície; e uma arena central onde a comida foi entregue¹⁹. Os zebrafish apresentaram a maior preferência pela zona Enriquecida e Flu, que era significativamente diferente...

Discussão

Aqui apresentamos um projeto experimental que nos permite investigar as preferências dos peixes para diferentes tipos de habitats. Algumas etapas críticas que são importantes nos testes de preferência incluem: 1) garantir que as condições uniformes sejam mantidas em diferentes réplicas (por exemplo, ruídos externos ou movimento, experimentador, química da água, níveis de luz); 2) garantir que as zonas sejam giradas entre réplicas e uma quantidade significativa de água seja substituída por água fresca entre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Aquarium Plants	Smarlin	B07PDZQ5M5
Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Experimental tanks	United State Plastic Corporation	6106
Floating food ring	SunGrow	B07M6VWH9V
Flow meter	YSI	BA1100
Jager Aquarium Thermostat Heater	Ehiem	3619090
Master Water Quality Test Kit	API	34
SPSS Statistics for Macintosh	IBM	Version 25.0
Submersible Pump, SL-	Songlong	SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee's	13405
Video camera	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (video software)	Microsoft	Windows Media Player 12