생선 복지 를 평가하기 위한 선호도 테스트를 위한 표준화된 프로토콜

요약

포로 생활에서 동물의 복지를 평가하는 근본적인 측면은 동물이 원하는 것을 가지고 있는지 묻는 것입니다. 여기서, 우리는 환경 농축의 존재/부재 및 물의 흐름에 대한 접근에 관하여 제브라피시(Daniorerio)의주거 선호도를 결정하는 프로토콜을 제시한다.

초록

동물 복지 평가 기술은 문제의 동물의 특정 요구와 욕구를 고려하려고 합니다. 농축 (주거 환경에서 물리적 개체 또는 conspecificss의 추가)를 제공하는 것은 종종 포로 동물에게 그들이 상호 작용하는 사람 또는 그들이 어떻게 시간을 보낼 지 선택할 수있는 기회를 제공하는 방법입니다. 그러나 포로 생활에서 종종 간과되는 수생 환경의 기본 구성 요소는 동물이 운동을 선택할 수있는 능력입니다. 물고기를 포함한 많은 동물의 경우, 운동은 그들의 삶의 역사의 중요한 측면이며, 뇌와 행동에 긍정적 인 변화를 포함하여 많은 건강 혜택을 가지고 알려져있다. 여기에서 우리는 포로 동물의 서식지 선호도를 평가하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 수생 종에서 다양한 환경 요인(예: 자갈 대 모래, 플라스틱 식물 대 살아있는 식물, 물의 낮은 흐름 대 높은 흐름)을 보거나 육상 종과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 선호도에 대한 통계적 평가는 서식지를 -1(회피)에서 +1(가장 선호)으로 평가하는 Jacob의 선호도 지수를 사용하여 수행됩니다. 이 정보를 통해 동물이 선호하는 위치를 포함하여 복지 관점에서 무엇을 원하는지 결정할 수 있습니다.

서문

실험실 동물을 포로로 수용하는 방법을 규제하는 규정은 명시적이고 잘 정의되어 있습니다. 실험실 동물 관리의 평가 및 인증 협회 (AAALAC) 국제 감독 및 연구 동물과 함께 작동 하는 모든 조직 및 기관을 관리 하 고 종 에 적합 한 축산 및 주택에 대 한 특정 지침을 가지고. 예를 들어, AAALAC의 제브라피쉬 하우징 및 케어에 대한 지침, Danio Rerio^1은 제브라피시를 포로로 수용할 때 농축(주거 환경에서 물리적 개체 또는 특정성을 추가하는 것)의 사용을 "강력히 권장"합니다. 가이드는 "얼룩말 어류 서식지를 모방한 인공 식물이나 구조물을 제공하면 동물이 환경 내에서 선택할 수 있습니다."

증거는 농축이 공간 정보 처리에 관여하는 뇌 의 영역에서 새로운 뉴런 (neurogenesis)의 성장을 자극 할 수 있음을 시사^2,이러한 신경 변화는 향상된 학습 능력과 관련된 것으로 생각된다³. 신경 발생 및 학습에 대한 농축의 효과는 물고기^4,5,조류^6,파충류⁷및 포유류^8을포함하여 다양한 taxa에 걸쳐 널리 연구되어 왔다. 연구의 이 모형은 두뇌와 행동에 농축의 효력을 이해하는 것이 중요하더라도, 그(것)들은 다른 위에 특정 한 환경에 대한 동물의 특정 선택 또는 환경 설정을 고려하지 않습니다.

포로 동물의 복지를 평가할 때 물어 봐야 할 근본적인 질문은 동물이 원하는 것을 가지고 있는지^{여부입니다 9}. 확실한 증거를 제공하는이 질문을 조사하는 방법은 우리가 주관적 인 환경 설정을 이해할 수있는 선택의 동물을 제공하는 것입니다. 예를 들어, 두 연구는 제브라피쉬가 농축^10,11을포함하는 영역에 대한 선호도를 나타내는 두 연구와 함께, 농축 또는 일반 환경 중 하나에 대한 액세스를 선호하는지 여부를 조사했다. 그러나, 제브라피쉬는 환경^농축12에무관심해 보이는 것이 제안되었기 때문에, 질문에 대한 답은 분명히 명확하지 않다. 동물 복지와 관련된 선호도 테스트의 또 다른 응용 프로그램은 농축 된 환경의 다른 측면이 개별 동물이 내리는 선택에 어떤 역할을하는지 이해하려고 노력합니다. 물고기 혼자에서, 농축의 다른 모형은 두뇌와 행동에 차등 효력이 있고, 이 관계는 성격 특성에 있는 개별적인 다름에 의해 더 복잡합니다^13. 또한, 환경 농축의 비교 연구에 대한 선호도 테스트가 유용 할 수 있습니다. 상이한 어종에 걸쳐서도, 농축은^침략14,대담함^15,운동^16,및 위험 감수 행동^17을포함하여 행동의 많은 다른 모형에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.

Jacob의 선호도 지수는 주택 선호도^18을정량화하는 데 자주 사용되는 통계 테스트입니다. Jacob의 선호도 지수는 선호도가 -1(회피)에서 +1(가장 선호되는)까지 다양한 시점에서 각 서식지 유형에 존재하는 동물의 수에 따라 각 서식지에 값을 할당합니다. 여기서 우리는 야곱의 선호도 지수를 사용하여 물고기의 주택 선호도를 조사하고 수생 환경의 두 가지 중요한 특성을 평가하는 예를 사용하는 방법을 설명합니다: 1) 농축의 유무; 및 2) 물의 흐름¹⁹. 그러나, 프로토콜은 다양한 종과 풍경(예: 수생 및 육상)에 걸쳐 다양한 환경 요인(예: 자갈 대 모래, 플라스틱 식물 대 살아있는 식물, 낮은 물 흐름 대 높은 물 흐름)을 보기 위해 쉽게 조정될 수 있습니다.

프로토콜

현재 연구는 승인이 있고 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 및 사용 프로토콜의 모든 요구 사항을 준수합니다. IACUC 번호 46466.

1. 선호 장치 설치

1. 실험을 시작하기 전에 살아있는 동물과 관련된 모든 실험 및 축산 절차에 대한 연구소의 동물 관리 위원회 (또는 동등한 조직)의 승인을 얻습니다.
2. 불투명 한 흰색 플라스틱으로 만든 실험 탱크를 사용합니다. 영역 사이의 벽은 실리콘 실란트와 장소에 고정 된 회색 아크릴로 만들어집니다.
   참고 : 실험 탱크의 크기는 관심종의 크기와 사용되는 개인의 수에 따라 달라집니다 (예를 들어, 8 성인 얼룩말, 76cm L x 76cm W X 30cm H의 탱크권장).
3. 실험 탱크를 테스트할 특정 서식지 매개 변수에 따라 달라지는 4개의 영역으로 나눕니다. 조사할 수 있는 다양한 유형의 농축예로는 모래 대 암석 기판, 인공 식물 대 대피소, 또는 인공 식물의 존재 대 물의 흐름이있습니다(그림 1).
   1. 물의 흐름을 관심 의 매개 변수로 사용하는 경우 작은 펌프를 사용하여 물 제트를 공급하십시오 (재료 표참조). 펌프가 일정한 방향의 물 흐름을 제공하도록 선택한 속도로 펌프를 설정합니다. 관심의 생태와 삶의 역사의 종에 따라 원하는 속도를 선택합니다 (예 : 얼룩말의 경우 14cm / s).
4. 실험 탱크의 중간에 음식이 배달되는 중앙 경기장이 있습니다(그림 1). 각 구역에서 중앙 경기장으로 가는 접근은 분리된 벽의 작은 개구부를 통해 서있습니다. 개구부는 관심 있는 종들이 방해받지 않고 구역 사이를 이동할 수 있을 만큼 크지만, 물고기가 다른 지역에서 경험할 수 있는 시각적 신호를 줄이기에 충분히 작습니다.
5. 탱크의 각 구석에 바이오 필터와 히터를 배치하지만, 물의 흐름을 방해하지 않도록 실험 영역 외부에 모든 영역에 걸쳐 일정한 수온을 보장합니다.
6. 공간 지정에 따라 추가 실험 탱크를 설정합니다. 각 실험 탱크의 다른 영역을 회전하여 순차적 바이어스를 제한합니다. 모든 복제 탱크가 균일한 조건(동일한 조도, 수온 등)을 갖도록 합니다.
7. 모든 영역이 보이도록 각 실험 탱크 바로 위에 카메라(재료 표참조)를 놓습니다. 광각 렌즈를 피하고 메모리 카드에 기록할 공간이 충분한지 확인합니다.
8. 일출과 일몰을 시뮬레이션하기 위해 점진적(예: 1/2시간) 12L: 12D 주기로 실내 조명을 설정합니다. 수온을 25 ±1 °C로 유지합니다.

2. 캡처, 적응 및 절차

1. 그들은 테스트되지 않을 때 홈 탱크에 물고기를 유지합니다. 그물 그들의 가정 탱크에서 모든 테스트 물고기와 실험 탱크의 중앙 경기장에 장소 (1 일). 캡처 시간을 최소화하여 스트레스를 줄입니다(예: 30초 미만).
   참고 : 스트레스를 최소화 할 수있는 실험 탱크로 자신의 가정 탱크에서 물고기를 전송하기위한 다른 절차는 탱크 물의 비커에 물고기를 수송하는 것입니다.
2. 복제 탱크에 걸쳐 각 실험 탱크에서 물고기의 수와 성별을 일정하게 유지하고 종의 크기와 생태에 따라 선택합니다.
3. 1-4일에는 물고기가 적응하고 다른 지역을 탐험하는 데 시간을 보냅니다. 이 날에는 데이터를 수집하지 마십시오.
   참고: 특정 실험 프로토콜에 따라 적응일 수를 연장하거나 줄입니다. 그러나 적응 기간은 취급의 영향을 최소화하고 물고기가 기기에서 먹이는 데 익숙해지도록 충분해야합니다.
4. 적응 기간 동안 정기적인 수질 검사(예: pH, 질산염 또는 아질산염 수준)를 수행하여 수질을 면밀히 모니터링하고 문제가 감지되면 물을 교체합니다(재료 표참조).
5. 중앙 아레나에서 물 표면의 중앙 아레나 벽에 부착된 부동 식품 링(재료 표참조)을 사용하여 중앙 경기장에서 생선 플레이크 식품(재료 표참조)을 먹이세요. 푸드 링은 음식 입자가 중앙 경기장 내에 머무르도록 보장하고 음식 표류로 인해 영역에 대한 편향을 제공하지 않습니다.
6. 실험 탱크에서 남은 음식을 딥 그물로 제거하기 전에 물고기에게 광고 리비텀을 먹이도록 .5 h를 제공합니다. 아침에 한 번, 오후에 한 번 물고기를 먹이.
7. 5-7일에 행동을 평가한다. 카메라를 켜고 각 예정된 아침과 오후 수유 후 2 시간 동안 물고기 행동을 기록하십시오. 8일째되는 날에는 실험용 탱크에서 모든 물고기를 딥 그물로 제거하고 홈 탱크에 다시 넣습니다.
8. 얼마나 많은 기름통 물을 사용할 수 에 따라, 다음 복제물고기에 스트레스 호르몬의 영향을 줄이기 위해 신선한 기름통 물 실험 탱크에 있는 물의 적어도 1/3을 대체.
9. 해당 주의 영역 회전 일정에 따라 실험 탱크를 설정합니다. 영역을 회전하면 서로 를 기준으로 영역을 배치한 결과로 발생하는 동작 바이어스가 발생할 가능성이 줄어듭니다. 그런 다음 새로운 생선 배치로 테스트 프로세스를 다시 시작합니다.

3. 측정 및 데이터 분석

1. 각 녹화 일의 끝에 컴퓨터에 비디오를 다운로드합니다. 이렇게 하면 모든 사용 전에 메모리 카드에 공간이 확보됩니다.
2. 비디오 소프트웨어(재료 표 참조)를사용하여 영역 기본 설정을 정량화합니다. 각 2시간 기록 기간 동안 5분 간격으로 각 구역의 물고기 수를 수동으로 계산합니다(이 카운트의 중앙 아레나 포함). 비디오 푸티지에서 수컷과 여성의 차별화가 가능한지 분석 하는 동안 물고기의 성별을 정의합니다.
3. 서식지 선호도를 분석하려면 각 복제 탱크의 영역당 평균 물고기 수를 계산합니다(즉, 3일 동안의 모든 데이터를 평균). 구조 사용에 대한 기본 설정 점수를 얻으려면 제이콥스의 선호도 지수^15를
   
   J =(r_x - p)/[(r_x + p)– 2*r_x*p]
   
   여기서 x는 관심 영역인 경우, r_x는 영역 x의 물고기 의 비율과 모든 영역에서 의 총 물고기 수이며, p는 실험 탱크의 모든 영역의 사용 가능한 비율입니다. 인덱스범위는 최대 선호도를 위해 +1과 최대 회피를 위해 -1 사이입니다.
4. 관찰 기간 동안 물고기가 영역 을 전환하는 속도에 변화가 있는지 확인하려면 모든 관찰 기간의 첫 번째 및 마지막 5 분 동안 스위치 속도, r_sr을계산하여 r_sr이 중앙 경기장에서 각 영역에 들어오는 횟수를 총 물고기 수로 나눈 값입니다.
5. 물고기의 전신이 구역을 분리하는 개구부를 통과할 때 물고기가 구역에 들어간 것을 생각해 보십시오. 각 복제 탱크에 대한 시작 및 마무리 평균 전환 속도를 계산합니다. 동일한 실험자가 모든 행동 관찰을 수행하여 실험자 관찰 편향을 줄입니다.
6. 통계 소프트웨어(재료 표 참조)를사용하여 관련 통계 분석을 수행합니다. 제안된 분석에는 선호도 지수를 종속 변수로, 영역을 예측 변수로 지정하고 각 탱크의 시작 및 종료 평균 스위치 속도에 대한 페어링된 t 검정이 포함된 단방향 ANOVA가 포함됩니다.
7. Tukey의 다중 비교 후 hoc 테스트를 적용하여 각 영역이 서로 비교되는 영역 비교를 더 자세히 조사합니다. 보다 복잡한 통계 분석에는 시간 효과, 경기장 효과, 성별 효과 또는 행동의 개별 적 차이를 평가하는 혼합 모델이 포함됩니다.

결과

우리는 1) 플라스틱 식물과 모래 기판을 포함하여 다양한 농축 중에서 선택할 수있는 제브라피시의 주택 선호도를 조사하기 위해 선호도 테스트를 사용했습니다. 및 2) 물 흐름. 이들은 네 개의 영역으로 나뉘어졌다: (i) 농축만; (ii) 흐름 만; (iii) 농축 및 흐름; (iv) 평야; 그리고 음식이 배달 된 중앙 경기장^19. Zebrafish는 다른 모든 지역(농축 전용, 흐름 전용, 평원, 중앙 투기장)과 크...

토론

여기에서 우리는 우리가 서식지의 다른 유형에 대한 물고기의 환경 설정을 조사 할 수있는 실험 디자인을 제시한다. 선호도 테스트에서 중요한 몇 가지 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 균일한 조건이 다른 복제물(예: 외부 소음 또는 움직임, 실험자, 물 화학, 광레벨)에 걸쳐 유지되도록 보장합니다. 2) 영역이 복제 물 사이에 회전하고 상당한 양의 물이 편향을 줄이기 위해 테스트 사이에 신선?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Aquarium Plants	Smarlin	B07PDZQ5M5
Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Experimental tanks	United State Plastic Corporation	6106
Floating food ring	SunGrow	B07M6VWH9V
Flow meter	YSI	BA1100
Jager Aquarium Thermostat Heater	Ehiem	3619090
Master Water Quality Test Kit	API	34
SPSS Statistics for Macintosh	IBM	Version 25.0
Submersible Pump, SL-	Songlong	SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee's	13405
Video camera	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (video software)	Microsoft	Windows Media Player 12