Un protocollo standardizzato per i test delle preferenze per valutare il benessere dei pesci

Riepilogo

Un aspetto fondamentale della valutazione del benessere degli animali in cattività è quello di chiedersi se gli animali hanno ciò che vogliono. Qui, presentiamo un protocollo per determinare la preferenza abitativa nel pesce zebra (Danio rerio) per quanto riguarda la presenza/assenza di arricchimento ambientale e l'accesso al flusso d'acqua.

Abstract

Le tecniche di valutazione del benessere degli animali cercano di tener conto delle esigenze e dei desideri specifici dell'animale in questione. Fornire arricchimento (l'aggiunta di oggetti fisici o conspecifici nell'ambiente abitativo) è spesso un modo per dare agli animali in cattività l'opportunità di scegliere chi o con cosa interagiscono e come trascorrono il loro tempo. Una componente fondamentale dell'ambiente acquatico che viene spesso trascurata in cattività, tuttavia, è la capacità per l'animale di scegliere di impegnarsi in esercizio fisico. Per molti animali, tra cui il pesce, l'esercizio fisico è un aspetto importante della loro storia della vita, ed è noto per avere molti benefici per la salute, tra cui cambiamenti positivi nel cervello e nel comportamento. Qui presentiamo un metodo per valutare le preferenze dell'habitat negli animali in cattività. Il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per esaminare una varietà di fattori ambientali (ad esempio, ghiaia contro sabbia come substrato, piante di plastica contro piante vive, basso flusso contro alto flusso di acqua) in diverse specie acquatiche o per l'uso con specie terrestri. La valutazione statistica della preferenza viene effettuata utilizzando l'indice di preferenza di Giacobbe, che classifica gli habitat da -1 (evitare) a 1 (la più preferita). Con queste informazioni, si può determinare ciò che l'animale vuole dal punto di vista del benessere, compresa la loro posizione preferita.

Introduzione

Le norme che disciplinano il modo in cui gli animali da laboratorio devono essere alloggiati in cattività sono esplicite e ben definite. L'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AAALAC) International supervisiona e gestisce tutte le organizzazioni e le istituzioni che lavorano con animali da ricerca e ha linee guida specifiche per l'allevamento e l'alloggio adatti alle specie. Ad esempio, la Guida dell'AAALAC sull'alloggio e la cura del pesce zebra, Danio Rerio¹ "incoraggia fortemente" l'uso dell'arricchimento (l'aggiunta di oggetti fisici o conspecifici nell'ambiente abitativo) quando si ospita il pesce zebra in cattività. La guida prosegue affermando: "Fornire piante artificiali o strutture che imitano l'habitat del pesce zebra consentono agli animali una scelta all'interno del loro ambiente."

Le prove suggeriscono che l'arricchimento può stimolare la crescita di nuovi neuroni (neurogenesi) in aree del cervello coinvolte nell'elaborazione di informazioni spaziali², e si pensa che questi cambiamenti neurali sono associati con una maggiore capacità di apprendimento³. Gli effetti dell'arricchimento sulla neurogenesi e l'apprendimento sono stati ampiamente studiati in vari taxa, tra cui pesci^4,5, uccelli⁶, rettili⁷e mammiferi⁸. Anche se questi tipi di studi sono importanti per comprendere gli effetti dell'arricchimento sul cervello e sul comportamento, non prendono in considerazione le scelte o le preferenze particolari degli animali per un particolare ambiente rispetto a un altro.

Una domanda fondamentale da porsi quando si valuta il benessere degli animali in cattività è se gli animali abbiano o meno quello che vogliono⁹. Un modo per indagare su questa domanda che fornisce prove tangibili è quello di fornire agli animali scelte che ci permettano di comprendere le loro preferenze soggettive. Ad esempio, due studi hanno studiato se il pesce zebra preferisca l'accesso a un ambiente arricchito o a un ambiente semplice, con entrambi gli studi che indicano una preferenza per le aree che contengono arricchimento^10,11. Tuttavia, è stato anche suggerito che il pesce zebra appaia indifferente all'arricchimento ambientale¹², quindi la risposta alla domanda non è ovviamente chiara. Un'altra applicazione dei test di preferenza associati al benessere degli animali si estende al tentativo di capire come i diversi aspetti di un ambiente arricchito svolgono un ruolo nelle scelte di un singolo animale. Solo nel pesce, diversi tipi di arricchimento hanno effetti differenziali sul cervello e sul comportamento, e questa relazione è ulteriormente complicata dalle differenze individuali nei tratti della personalit๳. Inoltre, i test di preferenza potrebbero essere utili per studi comparativi sull'arricchimento ambientale. Anche tra diverse specie di pesci, l'arricchimento ha dimostrato di avere un effetto su molti diversi tipi di comportamento, tra cui l'aggressione¹⁴, l'audacia¹⁵, la locomozione¹⁶e il comportamento di assunzione di rischi¹⁷.

L'indice delle preferenze di Jacob è un test statistico che viene spesso utilizzato per quantificare le preferenze abitative¹⁸. L'indice delle preferenze di Giacobbe assegna un valore a ogni habitat diverso in base al numero di animali presenti in ogni tipo di habitat in punti temporali diversi, dove le preferenze variano da -1 (evitare) a 1 (la maggior parte dei preferiti). Qui descriviamo un metodo per utilizzare l'indice di preferenza di Jacob per studiare le preferenze abitative nei pesci e usiamo l'esempio di valutazione di due importanti caratteristiche dell'ambiente acquatico: 1) la presenza o l'assenza di arricchimento; e 2) il flusso dell'acqua¹⁹. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per esaminare una varietà di fattori ambientali (ad esempio, ghiaia contro sabbia come substrato, piante di plastica contro piante vive, basso contro flusso d'acqua elevato) attraverso diverse specie e paesaggi (ad esempio, acquatico e terrestre).

Protocollo

Lo studio attuale ha l'approvazione e rispetta tutti i requisiti della cura degli animali e dei protocolli di utilizzo della Pennsylvania State University; IACUC n. 46466.

1. Impostazione dell'apparato di preferenza

1. Ottenere l'approvazione dal comitato per la cura degli animali dell'istituto (o da un'organizzazione equivalente) per tutte le procedure sperimentali e aassessore che coinvolgono animali vivi prima di iniziare l'esperimento.
2. Utilizzare un serbatoio sperimentale in plastica bianca opaca. Le pareti tra le zone sono fatte di acrilico grigio che è fissato in posizione con sigillante al silicio.
   NOTA: La dimensione del serbatoio sperimentale dipende dalle dimensioni delle specie di interesse e dal numero di individui utilizzati (ad esempio, per 8 pesci zebra adulti, si raccomanda un serbatoio di 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H).
3. Dividere il serbatoio sperimentale in quattro zone che variano in base ai parametri specifici dell'habitat da testare. Esempi di diversi tipi di arricchimento da indagare includono substrato sabbioso contro roccioso, piante artificiali contro rifugi, o flusso di acqua contro presenza di piante artificiali (Figura 1).
   1. Se si utilizza il flusso d'acqua come parametro di interesse, utilizzare piccole pompe per fornire getti d'acqua (vedere Tabella dei materiali). Impostare le pompe ad una velocità prescelta in modo che forniscano un flusso costante e diretto di acqua. Scegliere la velocità desiderata in base all'ecologia e alla storia della vita delle specie di interesse (ad esempio, 14 cm/s per il pesce zebra).
4. Al centro del serbatoio sperimentale, avere un'arena centrale dove viene consegnato il cibo (Figura 1). L'accesso all'arena centrale da ogni zona è attraverso una piccola apertura nelle pareti di separazione. L'apertura è abbastanza grande per le specie di interesse per spostarsi tra le zone senza ostacoli, ma abbastanza piccolo da ridurre eventuali segnali visivi che il pesce potrebbe sperimentare da altre zone.
5. Posizionare un biofiltro e un riscaldatore in ogni angolo del serbatoio, ma al di fuori dell'area sperimentale in modo da non disturbare il flusso dell'acqua e garantire una temperatura costante dell'acqua in tutte le zone.
6. Impostare serbatoi sperimentali aggiuntivi come lo spazio impone. Ruotare le diverse zone in ogni serbatoio sperimentale per limitare qualsiasi distorsione sequenziale. Assicurarsi che tutti i serbatoi di replica abbiano condizioni uniformi (stessi livelli di luce, temperatura dell'acqua, ecc.)
7. Posizionare le telecamere (vedere Tabella dei materiali)sui treppiedi direttamente sopra ogni serbatoio sperimentale, in modo che tutte le zone siano visibili. Evitare lenti grandangolari e assicurarsi che le schede di memoria hanno spazio sufficiente per la registrazione.
8. Impostare l'illuminazione della stanza su un ciclo graduale (ad esempio, 1/2 h) 12 L: 12 D per simulare l'alba e il tramonto. Mantenere la temperatura dell'acqua a 25 x 1 gradi centigradi.

2. Cattura, acclimatazione e procedura

1. Tenere i pesci nelle vasche di casa quando non sono in fase di test. Rete tutti i pesci di prova dai loro serbatoi di casa e posizionare nell'arena centrale del serbatoio sperimentale (Giorno 1). Ridurre al minimo i tempi di cattura per ridurre lo stress (ad esempio, meno di 30 s).
   NOTA: Una procedura alternativa per il trasferimento dei pesci dal serbatoio di casa al serbatoio sperimentale che può ridurre al minimo lo stress è quello di trasportare il pesce in un becher di acqua del serbatoio.
2. Mantenere il numero e il sesso del pesce in ogni serbatoio sperimentale costante attraverso serbatoi di replica e scegliere in base alla dimensione della specie e l'ecologia.
3. Nei giorni 1-4, i pesci trascorrono del tempo ad acclimatarsi ed esplorare le diverse zone. Non raccogliere dati in questi giorni.
   NOTA: Estendere o ridurre il numero di giorni per l'acclimatamento a seconda del particolare protocollo sperimentale. Tuttavia, il periodo di acclimatazione dovrebbe essere sufficiente a ridurre al minimo gli effetti della manipolazione e per abituare il pesce all'alimentazione nell'apparato.
4. Durante il periodo di acclimatazione, monitorare da vicino la qualità dell'acqua conducendo regolari test di qualità dell'acqua (ad esempio, livelli di pH, nitrato o nitrito) e sostituire l'acqua in caso di problemi (vedere Tabella dei materiali).
5. Nutrire il cibo del fiocco di pesce (vedi Tabella dei materiali)nell'arena centrale utilizzando un anello alimentare galleggiante (vedi Tabella dei materiali)attaccato alla parete dell'arena centrale sulla superficie dell'acqua. Un anello alimentare assicura che le particelle di cibo rimangano all'interno dell'arena centrale e non presentino una distorsione per le zone a causa della deriva degli alimenti.
6. Dare al pesce 0,5 h per nutrire l'ad libitum prima di rimuovere il cibo residuo dal serbatoio sperimentale con una rete di immersione. Nutrire il pesce una volta al mattino e una volta nel pomeriggio.
7. Valutare i comportamenti nei giorni 5-7. Accendere le telecamere e registrare i comportamenti dei pesci per 2 h dopo ogni alimentazione mattutina e pomeridiana programmata. Il giorno 8 rimuovere tutti i pesci dalle vasche sperimentali con una rete di immersione e rimetterli nei loro serbatoi di casa.
8. A seconda di quanta acqua pozzante è disponibile, sostituire almeno un 1/3 dell'acqua nel serbatoio sperimentale con acqua posta per ridurre gli effetti degli ormoni dello stress sui pesci nelle successive repliche.
9. Impostare i serbatoi sperimentali in conformità con il programma di rotazione della zona per quella settimana. La rotazione delle zone riduce la possibilità che si verifichino pregiudizi comportamentali a seguito del posizionamento di qualsiasi zona rispetto all'altro. Quindi iniziare di nuovo il processo di test con un nuovo lotto di pesce.

3. Misurazioni e analisi dei dati

1. Scarica i video su un computer alla fine di ogni giornata di registrazione. Questo assicura che ci sia spazio sulla scheda di memoria prima di ogni utilizzo.
2. Utilizzare il software video (vedere Tabella dei materiali) per quantificare la preferenza di zona. Contare manualmente il numero di pesci in ogni zona a intervalli di 5 min in ogni periodo di registrazione di 2 h (includere l'arena centrale in questi conteggi). Definire il sesso del pesce durante l'analisi se la differenziazione tra maschi e femmine è possibile dal filmato.
3. Per analizzare la preferenza dell'habitat, calcolare il numero medio di pesci per zona per ogni serbatoio di replica (ad esempio, la media di tutti i dati nei 3 giorni). Per ottenere un punteggio di preferenza per l'utilizzo della struttura, calcolare l'indice delle preferenze di Jacobs¹⁵ come
   
   J (r_x : p)/[(r_x , p) – 2 or_x,p]
   
   dove x è la zona di interesse, r_x è il rapporto tra il pesce nella zona x e il numero totale di pesci in tutte le zone e p è la proporzione disponibile di tutte le zone nel serbatoio sperimentale. L'indice è compreso tra 1 per la massima preferenza e 1 per evitare la massima.
4. Per determinare se ci sono cambiamenti nella velocità con cui il pesce passa da una zona all'altra durante un periodo di osservazione, calcolare il tasso di commutazione, r_sr, nel primo e nell'ultimo 5 min di ogni periodo di osservazione, dove r_sr è il numero di volte in cui un pesce entra in ogni zona dall'arena centrale, diviso per il numero totale di pesci.
5. Si consideri un pesce di essere entrato in una zona quando l'intero corpo del pesce attraversa attraverso l'apertura che separa le zone. Calcolare una velocità di commutazione media iniziale e di finitura per ogni serbatoio di replica. Eseguire tutte le osservazioni comportamentali dello stesso sperimentatore per ridurre qualsiasi distorsione di osservazione dello sperimentatore.
6. Utilizzando software statistico (vedi Tabella dei materiali),condurre analisi statistiche pertinenti. Le analisi suggerite includono un ANOVA unidirezionale, con l'indice delle preferenze come variabile dipendente e zona come variabile predittiva, e un test t accoppiato sulla velocità media di commutazione iniziale e finale per ogni serbatoio.
7. Applica il test post hoc di confronto multiplo di Tukey per analizzare ulteriormente i confronti delle zone, in cui ogni zona viene confrontata tra loro. L'analisi statistica più complessa include modelli misti che valutano gli effetti temporali, gli effetti dell'arena, gli effetti sessuali o anche le differenze individuali nel comportamento.

Risultati

Abbiamo usato il test delle preferenze per studiare le preferenze abitative nel pesce zebra data una scelta tra arricchimento variabile tra cui 1) piante di plastica e substrato sabbioso; e 2) il flusso d'acqua. Queste erano suddivise in quattro zone: (i) Solo arricchito; (ii) Solo flusso; (iii) arricchito e flusso; (iv) Pianura; e un'arena centrale dove il cibo è stato consegnato¹⁹. Il pesce zebra ha mostrato la preferenza più alta per la zona Enriched and Flow, che era significativamente diver...

Discussione

Qui presentiamo un progetto sperimentale che ci permette di indagare le preferenze dei pesci per diversi tipi di habitat. Alcuni passaggi critici importanti nei test delle preferenze includono: 1) garantire che condizioni uniformi siano mantenute in diverse repliche (ad esempio, rumori o movimenti esterni, sperimentatore, chimica dell'acqua, livelli di luce); 2) garantire che le zone siano ruotate tra le repliche e una notevole quantità di acqua venga sostituita con acqua fresca tra le prove per ridurre le distorsioni; ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Aquarium Plants	Smarlin	B07PDZQ5M5
Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Experimental tanks	United State Plastic Corporation	6106
Floating food ring	SunGrow	B07M6VWH9V
Flow meter	YSI	BA1100
Jager Aquarium Thermostat Heater	Ehiem	3619090
Master Water Quality Test Kit	API	34
SPSS Statistics for Macintosh	IBM	Version 25.0
Submersible Pump, SL-	Songlong	SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee's	13405
Video camera	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (video software)	Microsoft	Windows Media Player 12