Balık Refahını Değerlendirmek Için Tercih Testi için StandartLaştırılmış Protokol

Özet

Esaret altındaki hayvanların refahını değerlendirmenin temel bir yönü, hayvanların istediklerini alıp almadıklarını sormaktır. Burada, zebra balığında(Danio rerio)çevresel zenginleşmenin varlığı/yokluğu ve akan suya erişim açısından konut tercihini belirlemek için bir protokol sıyoruz.

Özet

Hayvan refahı değerlendirme teknikleri, söz konusu hayvanın özel ihtiyaçlarını ve isteklerini dikkate almaya çalışır. Zenginleştirme sağlamak (konut ortamında fiziksel nesnelerin veya konspesifiklerin eklenmesi) genellikle esir hayvanlara kimya da neyle etkileşimde bulunduklarını ve zamanlarını nasıl geçirdiklerini seçme fırsatı vermek için bir yoldur. Ancak, genellikle esaret altında gözden kaçan su ortamının temel bir bileşeni, hayvanın fiziksel egzersiz yapmayı seçebilme yeteneğidir. Balık da dahil olmak üzere birçok hayvan için, egzersiz yaşam tarihinin önemli bir yönüdür, ve beyin ve davranış olumlu değişiklikler de dahil olmak üzere birçok sağlık yararları olduğu bilinmektedir. Burada esir hayvanlarda habitat tercihlerini değerlendirmek için bir yöntem salıyoruz. Protokol, farklı sucul türlerde çeşitli çevresel faktörlere (örneğin, çakıl karşı kum, canlı bitkilere karşı plastik bitkiler, düşük akış ve yüksek su akışına karşı) veya karasal türlerde kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Tercihin istatistiksel değerlendirmesi, habitatları -1 (kaçınma) ile +1 (en çok tercih edilen) arasında sıralayan Jacob'ın tercih indeksi kullanılarak yapılır. Bu bilgilerle, hayvanın tercih ettikleri yer de dahil olmak üzere refah açısından ne istediği belirlenebilir.

Giriş

Laboratuvar hayvanlarının esaret altında nasıl barındırılması gerektiğine ilişkin düzenlemeler açık ve iyi tanımlanmıştır. Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) Uluslararası, araştırma hayvanları ile çalışan tüm kurum ve kuruluşları denetler ve yönetir ve türe uygun hayvancılık ve barınma için özel yönergelere sahiptir. Örneğin, AAALAC'ın Zebrabalığının Barınma ve Bakımı Rehberi, Danio Rerio 1, zebra balıklarını esaret altında barındırırken zenginleştirmenin (konut ortamında fiziksel nesnelerin veya konspesifiklerin eklenmesi) kullanımını "şiddetle teşvik eder". Kılavuz devlet devam ediyor, "Zebrabalığı habitat taklit yapay bitkiler veya yapılar sağlanması hayvanların kendi çevreiçinde bir seçim sağlar."

Kanıtlar zenginleştirme yeni nöronların büyümesini uyarabilir düşündürmektedir (nörogenez) beynin alanlarda uzamsal bilgi işleme dahil alanlarda², ve bu nöral değişiklikler gelişmiş öğrenme yeteneği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir³. Nörogenez ve öğrenme üzerinde zenginleştirme etkileri yaygın balık^4,5,kuşlar⁶, sürüngenler⁷dahil olmak üzere çeşitli takson, arasında incelenmiştir⁸. Bu tür çalışmalar zenginleştirmenin beyin ve davranış üzerindeki etkilerini anlamak için önemli olmakla birlikte, hayvanların belirli bir çevre için diğerine göre belirli tercihlerini veya tercihlerini dikkate almazlar.

Esir hayvanların refahıdeğerlendirirken sorulması gereken temel bir soru hayvanların⁹istediklerine sahip olup olmadıklarıdır. Somut kanıtlar sağlayan bu soruyu araştırmanın bir yolu, hayvanlara öznel tercihlerini anlamamızı sağlayacak seçenekler sunmaktır. Örneğin, iki çalışma zebra balığı ya zenginleştirilmiş ya da düz bir ortama erişimi tercih olup olmadığını araştırdık, her iki çalışma zenginleştirme içeren alanlar için bir tercih gösteren^10,11. Ancak, aynı zamanda zebra balığı çevresel zenginleştirme kayıtsız görünür ileri sürülmüştür¹², bu yüzden sorunun cevabı açıkça net kesim değildir. Hayvan refahı ile ilgili tercih testi başka bir uygulama nasıl zenginleştirilmiş bir çevrenin farklı yönlerini bir hayvan yapar seçimlerde bir rol oynadığını anlamaya çalışıyor uzanır. Sadece balıklarda, farklı zenginleştirme türlerinin beyin ve davranış üzerinde diferansiyel etkileri vardır ve bu ilişki kişilik özelliklerindeki bireysel farklılıklar la daha da karmaşıktır¹³. Ayrıca, tercih testi çevresel zenginleştirme karşılaştırmalı çalışmalar için yararlı olabilir. Farklı balık türleri arasında bile, zenginleştirme saldırganlık¹⁴dahil olmak üzere davranış birçok farklı türleri üzerinde bir etkisi olduğu gösterilmiştir , cesaret¹⁵, locomotion¹⁶, ve risk alma davranışı¹⁷.

Jacob'ın tercih indeksi konut tercihlerini ölçmek için sık kullanılan istatistiksel bir testtir¹⁸. Jacob'ın tercih indeksi, tercihin -1 (kaçınma) ile +1 (en çok tercih edilen) arasında değiştiği farklı zaman noktalarında, her habitat türünde bulunan hayvan sayısına göre her farklı habitata bir değer atar. Burada jacob tercih indeksi balık konut tercihlerini araştırmak ve su ortamının iki önemli özellikleri değerlendirme örneğini kullanmak için kullanmak için bir yöntem açıklar: 1) varlığı veya zenginleştirme yokluğu; ve 2) su akışı¹⁹. Ancak protokol, farklı türler ve manzaralar (örneğin, su ve karasal) arasında çeşitli çevresel faktörlere (örneğin, bir yüzey olarak çakıl karşı kum, canlı bitkilere karşı plastik bitkiler, düşük ve yüksek su akışına karşı düşük) bakmak için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

Mevcut çalışma onaya sahiptir ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'nin hayvan bakımı ve kullanım protokollerinin tüm gerekliliklerine uygundur; 46466 sayılı IACUC.

1. Tercih cihazlarının kurulumu

1. Deneye başlamadan önce canlı hayvanları içeren tüm deneysel ve hayvancılık prosedürleri için enstitünün Hayvan Bakım Komitesi'nden (veya eşdeğer kuruluştan) onay alabilen.
2. Opak beyaz plastikten yapılmış deneysel bir tank kullanın. Bölgeler arasındaki duvarlar silikon dolgu ile yerinde sabit gri akrilik yapılır.
   NOT: Deney tankının büyüklüğü ilgi türlerinin büyüklüğüne ve kullanılan bireylerin sayısına bağlıdır (örn. 8 yetişkin zebra balığı için 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H'lik bir tank önerilir).
3. Deney tankını, test edilecek belirli habitat parametrelerine göre değişen dört bölgeye bölün. Araştırmak için zenginleşme farklı türleri örnekleri kumlu vs kayalık substrat, yapay bitkiler vs barınaklar, ya da su akışı vs yapay bitkilerin varlığı(Şekil 1)içerir.
   1. Bir ilgi parametresi olarak su akışını kullanıyorsanız, su jetleri sağlamak için küçük pompalar kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu). Pompaları, sabit ve yönlendirilmiş bir su akışı sağlayacak şekilde seçilen bir hızda ayarlayın. İlgi alanının ekolojisi ve yaşam geçmişine (örneğin, zebra balığı için 14 cm/s) göre istenilen hızı seçin.
4. Deneysel tankın ortasında, yiyeceklerin teslim edildiği merkezi bir arenaya sahiptir (Şekil 1). Her bölgeden merkezi arenaya erişim, birbirinden ayrılan duvarlardaki küçük bir açıklıktan geçer. Açılış, ilgi türlerinin engellenmeden bölgeler arasında hareket edebilecekleri kadar büyük, ancak balığın diğer bölgelerden yaşayabileceği görsel ipuçlarını azaltacak kadar küçük.
5. Bir biyofiltre ve ısıtıcı tankı her köşesine yerleştirin, ancak su akışını rahatsız etmemek ve tüm bölgeler arasında sabit bir su sıcaklığı sağlamak için deneysel alanın dışında.
6. Uzayın gerektirdiği gibi ek deneysel tanklar ayarlayın. Sıralı sapmayı sınırlamak için her deney tankındaki farklı bölgeleri döndürün. Tüm çoğaltma tankların tek düze koşullara sahip olduğundan emin olun (aynı ışık seviyeleri, su sıcaklığı, vb.)
7. Tüm bölgelerin görülebilmesi için kameraları (Malzeme Tablosu'nabakın) her deney tankının hemen üzerine tripodlara yerleştirin. Geniş açılı lenslerden kaçının ve bellek kartlarının kayıt için yeterli alana sahip olduğundan emin olun.
8. Gün doğumu ve gün batımını simüle etmek için oda aydınlatmasını kademeli olarak (örneğin, 1/2 h) 12 L: 12 D döngüsüne ayarlayın. Su sıcaklığını 25 ± 1 °C'de koruyun.

2. Yakalama, alışma ve prosedür

1. Test edilmedikleri zaman balıkları ev tanklarında tutun. Tüm test balıklarını kendi tanklarından ve deneysel tankın orta arenasında (1. Gün) net olarak test edin. Stresi azaltmak için yakalama sürelerini en aza indirin (örn. 30 s'den az).
   NOT: Balığı ev tankından stresi en aza indirebilecek deneysel tanka aktarmak için alternatif bir prosedür, balığı bir tank suyuna taşımaktır.
2. Her deney tankındaki balığın sayısını ve cinsiyetini çoğaltma tankları arasında sabit tutun ve türlerin büyüklüğüne ve ekolojiye göre seçin.
3. 1-4. günlerde balıklar farklı bölgeleri keşfetmek ve alışma ve keşfetme ye zaman harcarlar. Bu günlerde veri toplamayın.
   NOT: Belirli bir deneysel protokole bağlı olarak alışma için gün sayısını genişletin veya azaltın. Ancak, alışma süresi, işlemenin etkilerini en aza indirmek ve balıkların cihazda beslenmeye alışması için yeterli olmalıdır.
4. Alışma süresi boyunca, düzenli su kalitesi testleri (örneğin, pH, nitrat veya nitrit seviyeleri) yaparak su kalitesini yakından izleyin ve herhangi bir sorun tespit edilirse suyu değiştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
5. Su yüzeyindeki merkezi arenanın duvarına bağlı yüzen bir gıda halkası (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanarak merkezi arenada balık pulu yiyeceği (Bkz. Malzeme Tablosu)besleyin. Bir gıda halkası gıda parçacıkları merkezi arena içinde kalmak sağlar ve gıda sürüklenen nedeniyle bölgeler için bir önyargı sunmuyor.
6. Bir daldırma ağı ile deneysel tanktan kalan gıda çıkarmadan önce reklam libitum beslemek için balık 0,5 saat verin. Balıkları sabah bir, öğleden sonra bir kez besleyin.
7. 5-7. günlerdeki davranışları değerlendirin. Her sabah ve öğleden sonra beslenmeden sonra kameraları açın ve balık davranışlarını 2 saat boyunca kaydedin. 8. günde deneysel tanklardan bir daldırma ağı ile tüm balıkları çıkarın ve onları kendi tanklarına geri yerleştirin.
8. Ne kadar karter su mevcut bağlı olarak, aşağıdaki çoğaltmalar balık üzerinde stres hormonlarının herhangi bir etkisini azaltmak için taze karter suyu ile deneysel tanktaki suyun en az 1/3'ünü değiştirin.
9. Deneysel tankları o haftanın bölge rotasyon programına uygun olarak ayarlayın. Bölgeleri döndürmek, herhangi bir bölgenin birbirine göre yerleştirilmesi sonucunda meydana gelen herhangi bir davranışsal önyargı olasılığını azaltır. Sonra balık yeni bir parti ile tekrar test süreci başlar.

3. Ölçümler ve veri analizi

1. Videoları her kayıt gününün sonunda bir bilgisayara indirin. Bu, her kullanımdan önce bellek kartında yer olmasını sağlar.
2. Bölge tercihini ölçmek için video yazılımı (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın. Her 2 saat kayıt döneminde her bölgede bulunan balık sayısını 5 dakika aralıklarla manuel olarak sayın (bu sayımlarda merkezi arenayı da dahil). Video çekimlerinden erkek ve dişiler arasında ayrım mümkünse analiz sırasında balığın cinsiyetini tanımlayın.
3. Habitat tercihini analiz etmek için, her çoğaltma tankı için bölge başına ortalama balık sayısını hesaplayın (örn. 3 gün boyunca tüm verilerin ortalaması). Yapı kullanımı için tercih puanı elde etmek için Jacobs'un tercih indeksi^15'i
   
   J = (r_x − p)/[(r_x + p) – 2*r_x*p]
   
   x'in ilgi alanı olduğu yerde, r_x bölgesindeki balıkların tüm bölgelerdeki toplam balık sayısına oranı, p ise deney tankındaki tüm bölgelerin mevcut oranıdır. Dizin, maksimum tercih için +1 ve maksimum kaçınma için −1 arasında değişir.
4. Bir gözlem döneminde balıkların bölgeler arasında geçiş hızında herhangi bir değişiklik olup olmadığını belirlemek için, her gözlem periyodunun ilk ve son 5 dakikasında, bir balığın merkez arenadan her bölgeye girme sayısının toplam balık sayısına bölünerek geçiş hızını hesaplayın.
5. Balığın tüm vücudu bölgeleri ayıran açıklıktan geçtiğinde bir balığın bir bölgeye girdiğini düşünün. Her çoğaltma tankı için bir başlangıç ve bitiş ortalama anahtar lama oranını hesaplayın. Herhangi bir deneyci gözlem önyargıazaltmak için aynı deneyci tarafından tüm davranışsal gözlemler yürütmek.
6. İstatistiksel yazılımları kullanarak (bkz. Malzemeler Tablosu),ilgili istatistiksel analizler yapar. Önerilen analizler tek yönlü ANOVA içerir, tercih indeksi bağımlı değişken ve bölge olarak belirleyici değişken olarak, ve her tank için başlangıç ve bitiş ortalama anahtar hızı üzerinde eşleştirilmiş bir t-testi.
7. Her bölgenin birbiriyle karşılaştırıldığı bölge karşılaştırmalarını daha fazla araştırmak için Tukey'in çoklu karşılaştırma sonrası hoc testini uygulayın. Daha karmaşık istatistiksel analiz, zaman etkilerini, arena etkilerini, seks etkilerini ve hatta davranıştaki bireysel farklılıkları değerlendiren karışık modelleri içerir.

Sonuçlar

Biz 1) plastik bitkiler ve kumlu substrat dahil olmak üzere değişen zenginleştirme arasında bir seçim verilen zebra balıkkonut tercihlerini araştırmak için tercih testi kullanılır; ve 2) su akışı. Bunlar dört bölgeye ayrılmıştır: (i) Sadece Zenginleştirilmiş; (ii) Yalnızca Akış; (iii) Zenginleştirilmiş ve Akış; (iv) Düz; ve gıda teslim edildi Merkezi arena¹⁹. Zebrabalığı, diğer tüm bölgelerden önemli ölçüde farklı olan Zenginleştirilmiş ve Akış bölge...

Tartışmalar

Burada, balığın farklı habitat türlerine yönelik tercihlerini araştırmamızı sağlayan deneysel bir tasarım salıyoruz. Tercih testinde önemli olan bazı kritik adımlar şunlardır: 1) tek düze koşulların farklı yinelemeler (örneğin, dış sesler veya hareket, deneyci, su kimyası, ışık seviyeleri) arasında korunmasını sağlamak; 2) bölgeleri çoğaltmalar arasında döndürülür ve su önemli miktarda önyargıları azaltmak için testler arasında taze karter su ile değiştirilir sağlanması...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Aquarium Plants	Smarlin	B07PDZQ5M5
Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Experimental tanks	United State Plastic Corporation	6106
Floating food ring	SunGrow	B07M6VWH9V
Flow meter	YSI	BA1100
Jager Aquarium Thermostat Heater	Ehiem	3619090
Master Water Quality Test Kit	API	34
SPSS Statistics for Macintosh	IBM	Version 25.0
Submersible Pump, SL-	Songlong	SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee's	13405
Video camera	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (video software)	Microsoft	Windows Media Player 12