Aislamiento de cardiomiocitos de corazones fijos para inmunocitoquímica y análisis de ploide

Resumen

El objetivo de este trabajo es desarrollar un método para aislar reproduciblemente los cardiomiocitos del corazón adulto y medir el contenido de ADN y la nucleación.

Resumen

El corazón de mamífero adulto se compone de varios tipos de células, incluyendo cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos. Dado que es difícil identificar de forma fiable los núcleos de cardiomiocitos en las secciones histológicas, muchos grupos dependen de aislar cardiomiocitos viables antes de la fijación para realizar la inmunosuchación. Sin embargo, estas técnicas de aislamiento de cardiomiocitos vivos requieren optimización para maximizar el rendimiento, la viabilidad y la calidad de las muestras, con fluctuaciones inherentes de la muestra a la muestra a pesar de la máxima optimización. Aquí, informamos de un protocolo reproducible, que implica la fijación antes de la digestión enzimática del corazón, que conduce al máximo rendimiento preservando la morfología in vivo de los cardiomiocitos individuales. Además, desarrollamos una plataforma de análisis automatizado para determinar el número de núcleos y el contenido de ADN por núcleo para los cardiomiocitos individuales. Después de exponer la cavidad torácica, el corazón fue arrestado en diástole por perfusión con 60 mM de KCl en PBS. A continuación, el corazón se fijó en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%, y luego se digerió con 60 mg/ml de solución de colagenasa. Después de las digestiones, las células se singularizaron por trituración, y la fracción de cardiomiocitos se enriqueció a través de la centrifugación diferencial. Los cardiomiocitos aislados fueron manchados para la troponina T y α-actinin para evaluar la pureza de la población obtenida. Además, desarrollamos una plataforma de análisis de imágenes para determinar la nucleación cardiomiocitos y el estado de la ploidea después de la tinción DAPI. Las evaluaciones de ploidy basadas en imágenes dieron lugar a resultados consistentes y reproducibles. Así, con este protocolo, es posible preservar la morfología nativa de los cardiomiocitos individuales para permitir el análisis de inmunocitoquímica y contenido de ADN al tiempo que se logra el máximo rendimiento.

Introducción

Las enfermedades cardíacas han sido la principal causa de muerte en la mayoría de los países occidentales durante muchas décadas^1,,2. Aunque muchas mejoras en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares han mejorado la supervivencia, actualmente no hay tratamientos que puedan reemplazar a los cardiomiocitos perdidos. Por lo tanto, los estudios relacionados con la función cardiomiocitos, la proliferación, la apoptosis y la hipertrofia han sido y siguen siendo un foco principal de la comunidad científica. Dado que el corazón adulto de los mamíferos tiene una capacidad regenerativa muy limitada, con una tasa estimada de renovación de cardiomiocitos de menos del 1% al año, es de vital importancia identificar de forma fiable los eventos proliferativos cardiomiocitos^3,,4. La mayoría de las estrategias que miden los eventos proliferativos se basan en la tinción de análogos incorporados de nucleótidos de ADN para evaluar la proliferación anterior o actual, o en la mancha de marcadores nucleares de proliferación activa⁵. Es especialmente importante identificar de forma fiable los eventos proliferativos de cardiomiocitos, ya que el número total de cardiomiocitos proliferativos es tan bajo^3,,6. Por ejemplo, sobre la base de una tasa de renovación del 1% de cardiomiocitos endógenos por año, uno puede esperar encontrar entre 25 y 50 cardiomiocitos para ser proliferativo en un momento dado en el corazón de ratón adulto^7,8. Cualquier inexactitud en la identificación de los núcleos cardiomiocitos podría conducir a resultados falsos positivos. Por lo tanto, es fundamental identificar de forma fiable los núcleos de cardiomiocitos, lo que ha resultado difícil y poco fiable de las secciones histológicas⁹. La identificación de los cardiomiocitos es mucho más precisa desde las células individuales que desde las secciones tisulares, ya que podría ser difícil distinguir los cardiomiocitos de otros tipos de células incluso cuando se utilizan marcadores como la α-actinina, aunque PCM1 podría ser un marcador fiable de núcleos de cardiomiocitos en las secciones histológicas¹⁰.

Los protocolos actuales se basan en aislar los cardiomiocitos vivos antes de la fijación, que se sabe que causa la muerte de al menos el 30% de los cardiomiocitos, y podría conducir a la selección involuntaria de poblaciones específicas de cardiomiocitos¹¹. Además, estos protocolos son notoriamente difíciles de optimizar para proporcionar resultados reproducibles. Incluso las técnicas de aislamiento optimizadas normalmente pueden producir no más del 65% de cardiomiocitos vivos en forma de varilla con diferentes rendimientos^12.

Para superar estos problemas, desarrollamos un protocolo que permite a los investigadores aislar cardiomiocitos fijos. Dado que las muestras se fijan antes del aislamiento, el rendimiento se maximiza y la morfología in vivo se conserva bien. Además, con este protocolo es posible aislar cardiomiocitos de muestras clínicas, que normalmente se fijan inmediatamente después de la adquisición. Además, para identificar los cardiomiocitos recién generados, es importante medir el estado de nucleación y ploidy de los cardiomiocitos individuales, ya que normalmente sólo se supone que los cardiomiocitos diploides se forman de nuevo. La citometría de flujo no puede distinguir la multinucleación de la poliploidía y es un protocolo relativamente de tiempo y de uso intensivo de recursos. La esbozación manual y la medición de núcleos dentro de las imágenes es de muy bajo rendimiento y propensa al sesgo humano. La cuantificación automatizada de imágenes de cardiomiocitos fijos y aislados teñidos de DAPI resuelve ambos problemas. La determinación basada en imágenes de las distribuciones de nucleación y ploidy se puede obtener con un mínimo de tiempo y reactivos utilizando equipos básicos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Minnesota (IACUC).

1. Preparación de las soluciones y equipos quirúrgicos

1. Antes del aislamiento, esterilizar el equipo quirúrgico mediante el uso de 70% solución de etanol.
2. Añadir 2,24 g de solución salina tamponada de KCl a 500 ml de fosfato (PBS) para obtener una concentración final de 60 mM. Almacene la solución KCl-PBS a temperatura ambiente. Utilice 3 ml de solución KCl-PBS por ratón.
3. Diluir 32% solución de paraformaldehído (PFA) con PBS para obtener una concentración final de 4% PFA. Preparar 10 mL de 4% de PFA en PBS por ratón. La solución de PFA diluida se puede almacenar a 4 oC durante 2-3 semanas en un recipiente de vidrio.
   NOTA: La solución preparada de 4% de PFA se puede almacenar a -20 oC durante períodos de tiempo más largos.
4. Preparar 1 ml de solución de colagenasa por ratón añadiendo 60 mg de colagenasa, tipo 2 por 1 ml de PBS.

2. Perfusión y fijación del corazón

1. Anestesiar al animal mediante el uso de 2-5% de isoflurano con un caudal de oxígeno de 1 L/min. Confirme la anestesia confirmando la falta de movimiento y la menor tasa de respiración.
   NOTA: La inyección de heparina (100-500 U/kg) antes de la eutanasia puede aumentar la calidad y el rendimiento de las células al prevenir los coágulos sanguíneos, lo que permite una perfusión más eficiente del corazón con fijación.
2. Eutanasiar al animal de acuerdo con las metodologías aprobadas.
   NOTA: Seguimos las directrices de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense para la eutanasia de los animales, y obtuvimos la aprobación local de la CIAA para la eutanasia.
3. Coloque el animal eutanizado en posición supina y pegue las extremidades extendidas.
4. Corta el pecho para exponer el corazón usando tijeras de extremo romo. Corte de aorta descendente y vena de cava inferior.
5. Perfunda el corazón inyectando 3 ml de solución de KCl-PBS a través del ventrículo izquierdo con un caudal de 3 ml/min utilizando una bomba peristáltica unida a un conjunto de perfusión con una aguja de mariposa de 23 G (26 G para neonatos). Asegúrese de no perforar el tabique.
   NOTA: Alternativamente, utilice una aguja conectada a una jeringa para inyectar soluciones.
6. Perfunda el corazón inyectando 10 ml de 4% de solución de PFA durante 10 min utilizando una bomba peristáltica a una velocidad de 1 ml/min.
7. Retire todo el corazón con tijeras. Después de extirpar el corazón, es posible aislar una región específica del corazón increiendo. Coloque el corazón, o un segmento del mismo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de solución de PFA al 4%. Incubar el corazón en el balancín a temperatura ambiente con una velocidad de balanceo entre 20-30 rpm durante 1 h.

3. Aislamiento de cardiomiocitos fijos

1. Coloque el corazón en un plato de Petri que contenga la solución PBS. Apriete el corazón para deshacerse de cualquier PFA que quede en los ventrículos, y lave en PBS.
2. Coloque el corazón fijo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga solución de colagenasa (60 mg/ml). Colocar el tubo en el balancín (20-30 rpm) a 37 oC para la incubación durante la noche.
   NOTA: Extienda el tiempo de incubación hasta 1 semana y reponga la solución de colagenasa cada dos días para reducir la posible variación en el rendimiento si se prevé que los corazones sean fibrosos, lo que podría requerir un mayor tiempo de digestión de la colagenasa para digerir colágeno extracelular.
3. Poner la solución de colagenasa y el corazón en un plato de Petri de 35 mm. Disociar el corazón en trozos de 1 mm mediante el uso de fórceps o tijeras.
4. Utilice una pipeta de transferencia para triturar aún más el tejido disociado durante 2 minutos. Si las partículas de tejido aún permanecen en el plato, utilice una pipeta de transferencia con una abertura más estrecha y continúe la trituración. Continúe hasta que la mayor parte del tejido se descomprima.
   NOTA: Sobre la trituración hace que los cardiomiocitos individuales se rompan. Asegúrese de no triturar en exceso comprobando regularmente bajo un microscopio.
5. Coloque una malla de nylon de 200-600 m sobre la abertura del tubo centrífugo de 15 ml.
   NOTA: Para los cardiomiocitos hipertrofiados, se recomienda utilizar malla de nylon de 400 m en lugar de 200 m.
6. Añadir 5 ml de PBS al plato Petri que contiene células disociadas y filtrar la solución a través de malla de nylon, incluyendo partículas de tejido. Lavar la malla de nylon pasando PBS adicional de 4 ml.
7. Centrifugar la solución filtrada a 10-100 x g durante 1 min.
   NOTA: 100 x g de centrifugación no producirá una población 100% pura de cardiomiocitos, y es probable que se incluyan algunas células no cardiomiocitos.
8. Deseche el sobrenadante a menos que uno quiera manchar/evaluar las células cardíacas no cardiomiocitos también. Resuspender el pellet en 10 ml de PBS antes de la tinción.

4. Tinción de cardiomiocitos

1. Recoger las células por centrifugación a 100 x g durante 1 min y añadir 5 ml de solución de permeabilización (por ejemplo, 0,5% Tritón X-100 en PBS). Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en el balancín.
   NOTA: Para los pasos 4.1, 4.2 y 4.4 utilice tubos centrífugos de 15 ml, ya que es más fácil retirar el sobrenadante sin alterar el pellet celular en comparación con los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Recoger las células por centrifugación a 100 x g durante 1 min, añadir 5 ml de tampón de bloqueo (por ejemplo, 3% albúmina sérica bovina [BSA] en PBS) e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en un balancín.
3. Recoger las células por centrifugación a 100 x g durante 1 min y añadir 1 ml de solución primaria de anticuerpos (en PBS) con la proporción de dilución adecuada. Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar cardiomiocitos en la solución de anticuerpos primarios en condiciones optimizadas (p. ej., 4 oC durante la noche).
4. Transfiera los cardiomiocitos con solución primaria de anticuerpos a un tubo centrífugo de 15 ml y agregue 9 ml de PBS. Incubar los cardiomiocitos durante 10 minutos a temperatura ambiente en un balancín.
5. Recoger las células por centrifugación a 100 x g durante 1 min y añadir 10 ml de PBS. Incubar los cardiomiocitos durante 10 minutos a temperatura ambiente en un balancín. Repita este paso una vez más.
6. Recoger las células por centrifugación a 100 x g durante 1 min y añadir la solución de anticuerpos secundaria que contiene DAPI. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en un balancín, seguido de repetir el paso 4.5 dos veces para lavar los cardiomiocitos.
7. Coloque las células en cubreobjetos o placas compatibles con el microscopio y proceda con imágenes.
   NOTA: Las imágenes incluidas en el manuscrito fueron tomadas con objetivos 10x y 40x. Los láseres utilizados fueron: 405 nm para DAPI, 561 nm para Actinin alfa y 640 nm para Edu.

5. Configurar software de imágenes

NOTA: Siga estos pasos utilizando Archivo Suplementario 1-SoftwareScreenshots.pdf.

1. Descargue la distribución de Fiji de ImageJ.
2. Abra Fiji. Haga clic en Ayuda > Actualizar... > Administrar sitios de actualización. Compruebe los sitios de actualización "IJPB-plugins" y "Biomedgroup" para descargar los plugins de dependencias Ellipse Split y Morpholibj.
3. Haga clic en Cerrar. Fiji debería comenzar a descargar las dependencias. Reinicie Fiji cuando haya terminado.
4. Descarga Rstudio y ábrelo.
5. Copie install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) en la línea de comandos de la consola de R y pulse la tecla Intro. Escriba "y" en respuesta a todas las solicitudes para instalar todas las dependencias de R (Captura de pantalla 1 en Archivo suplementario 1).

6. Cuantificación de imágenes

1. Abra Fiji y arrastre "AnalyzeNucleation.py" (suministrado como un archivo de código complementario) a la barra de estado de Fiji. Esto abrirá una ventana de edición de scripts. Haga clic en Ejecutar en la esquina inferior izquierda para comenzarla (Captura de pantalla 2 en Archivo suplementario 1).
2. Aparecerá un cuadro de diálogo(Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 3), preguntando por la ubicación del directorio de datos de salida. Todos los datos de análisis, cifras y otros datos utilizados por este software se almacenarán en esta carpeta. Aparecerá otro cuadro de diálogo más grande, que muestra todos los ajustes de análisis de imágenes(Archivo suplementario 1:Captura de pantalla 4).
   1. Seleccione la ubicación del directorio que contiene las imágenes que se van a analizar.
   2. Introduzca el formato de nombre de archivo de imagen mediante expresiones regulares. Escriba el formato de nombre de archivo de imagen, que indica qué partes del nombre de archivo corresponden a fila, columna, canal y (opcionalmente) sitio dentro de llaves, utilizando expresiones regulares. No coloque espacios dentro de las llaves. Rodee las partes variables del formato del nombre de archivo entre llaves. La forma en que se guardan los archivos depende del software de imágenes, y este paso recuperará la información relevante del nombre de archivo de la imagen.
      NOTA: Por ejemplo, la cadena de formato
      r" Placa 1-(? P[A-Za-z]+)(? P[0-9]+)-(? P[A-Za-z]+).tif"
      describe un nombre de archivo que comienza con "Plate 1-", que va seguido de una o más letras alfabéticas que indican la fila, que va seguida de uno o más dígitos que indican la columna, que va seguida de "-", que va seguida de una o más letras que indican el canal, que va seguido de ".tif". Las letras dentro de los corchetes angulares como "<>" son nombres de variables y se copian automáticamente en los datos cuando se recopilan. Uno de los nombres de variable debe ser ""
   3. Indique el nombre de los canales en los que la mancha nuclear es visible y donde los cardiomiocitos son visibles. Estos nombres deben ser exactamente como están en la parte que coincide con la variable "" en los nombres de archivo de expresión regular.
   4. Indique cómo se deben agrupar las imágenes utilizando nombres de variables separados por comas. Todas las imágenes dentro de un grupo determinado se abrirán y analizarán en un lote. Por ejemplo, si las imágenes se dividen en conjuntos para cada pozo y hay un pozo para cada combinación única de fila y columna, escriba "fila, columna" en este campo.
      NOTA: Estas variables de agrupación deben ser un subconjunto de las variables utilizadas en la cadena de formato. No utilice "canal" como variable de agrupación, esto separará las imágenes de canal correspondientes entre sí.
   5. Indique si las imágenes están unidas en una imagen de pozo o son independientes para cada sitio. En el primer caso, el sitio no debe indicarse en la cadena de formato de nombre de archivo.
   6. Elija el método de umbral que se utilizará para separar los núcleos del fondo. Todos los métodos de umbral estándar de Fiji están disponibles. Pruebe diferentes métodos de umbral para determinar cuál funciona mejor para el conjunto de imágenes. En este ejemplo, elija el método Otsu.
   7. Indique si se debe volver a calcular el umbral para cada imagen de sitio o si se debe utilizar el mismo umbral para cada imagen del grupo. Indique si las imágenes de cardiomiocitos son de campo brillante o utilice un marcador fluorescente.
   8. Indique el método de umbral de cardiomiocitos. Si se eligió brightfield en el paso anterior, este método de umbral se aplicará a las imágenes de campo brillante filtradas por bordes. Indique si se debe volver a calcular el umbral para cada imagen de sitio o si se debe utilizar el mismo umbral para cada imagen del grupo.
   9. Indique el número de filas de imágenes del sitio que cubren cada pozo. Indique el número de columnas de imágenes de sitio que cubren cada pozo. Indique el área mínima de núcleos en píxeles. Utilice un tamaño mínimo generosamente bajo, se calculará un umbral más alto y más preciso en el paso de análisis. Indique el área mínima de los cardiomiocitos.
   10. Después de elegir la configuración deseada, haga clic en Aceptar.
3. Las imágenes que se asemejan a las que se encuentran en la Figura 3 y la Figura 4 aparecerán en la pantalla, mostrando las diferentes etapas de la canalización de análisis. Inspeccione estas imágenes para asegurarse de que el umbral y la segmentación se están produciendo correctamente.
4. La carpeta de resultados seleccionada ahora debe rellenarse con datos de análisis(Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 5). Los archivos que no sean datos de análisis se pueden guardar de forma segura en esta carpeta siempre y cuando sus nombres no comiencen con "cm_", "nuclei_" o "nucleilink_".

7. Análisis de datos

NOTA: Los archivos csv que se producen se pueden analizar manualmente. Cada subconjunto de imágenes analizados produce un triplete de archivos csv denominados "nuclei(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" y "cardiomyocytes(metadata),csv", donde (metadatos) se sustituye por una secuencia de pares nombre-valor de la forma "_(name)-(value)", donde (nombre) y (valor) son secuencias de caracteres alfanuméricos derivados de cadenas (Por ejemplo, si la fila y la columna se indicaron en los nombres de archivo, entonces las cadenas como "_row-F" y "_column-8" estarán presentes). La columna situada más a la izquierda sin nombre de cada archivo de núcleos y núcleos es un número de ID de núcleo. La columna "Min" del archivo nucleilink es el id del cardiomiocitos que contenía dicho núcleo totalmente o 0 en caso contrario. La columna "Max" de los núcleos es la identificación del cardiomiocitos con mayor número que contenía dicho núcleo en parte, o 0 en caso contrario. La columna "Media" del archivo de cardiomiocitos es el número de identificación de cardiomiocitos.

1. Abra "AnalyzeMultinucleatedServer.R" en Rstudio (proporcionado como archivo de código suplementario).
2. En la parte superior de este archivo hay una variable denominada "folderName". Junto a él hay una ruta de archivo. Aquí, escriba la ruta de acceso a la carpeta de datos de salida seleccionada en el último paso, sin la barra diagonal final (Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 6).
3. En la esquina superior izquierda de la ventana de edición de scripts debe haber una flecha verde con la etiqueta Ejecutar aplicación. Haga clic en esta flecha. Puede tomar algún tiempo para que los datos se carguen y para que la aplicación aparezca.
4. Inicialmente, tres gráficos de gating serán visibles, uno para indicar el umbral mínimo válido de área nuclear, uno para indicar el umbral mínimo de intensidad media nuclear válido y uno para indicar el diámetro mínimo válido máximo de feret para los cardiomiocitos. Utilice los controles deslizantes para establecer estos umbrales(Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 7).
   NOTA: En cada uno de estos gráficos, debe estar presente un pico grande y amplio correspondiente a núcleos o cardiomiocitos válidos, flanqueados por colas anchas que representen desechos o cardiomiocitos segmentados erróneos. Utilice los umbrales para cortar una cola de cada uno de los picos.
5. Desplázate hacia abajo. Haga clic en el botón Aplicar umbrales seleccionados (parte inferior de Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 7).
6. Haga clic en el botón Distribución de intensidad de trazado. Esto hará que la gráfica de la distribución de la intensidad nuclear de toda la muestra y subtramas separadas para cada variable de agrupación.
   NOTA: Por ejemplo, si se han introducido variables de agrupación y en la expresión regular en el cuadro de diálogo De Fiji, las gráficas que indican la distribución de intensidad por fila y por columna aparecerán aquí (Archivo suplementario 1:Captura de pantalla 8). Si las condiciones de iluminación y tinción eran constantes en las diferentes partes de la muestra, todas estas parcelas deben mostrar claramente dos picos de intensidad, un atenuador, uno más alto para los núcleos diploide y uno más brillante y más corto para los núcleos tetraploides.
7. La variación intramuestra dará como resultado que este patrón no sea visible en toda la gráfica de muestra y que haya una gran variedad en la ubicación de los picos diploide y tetraploide por fila, columna u otra variable de agrupación. En este último caso, desplácese hacia abajo marque la casilla Normalizar por separado por grupo para tener en cuenta esta variación ( Archivo suplementario1: Captura de pantalla 9).
8. Haga clic en el botón Calcular Ploidy (Archivo Suplementario 1: Captura de pantalla 9). Haga clic en el botón Trazar distribución de Ploidy estimada. Los gráficos aparecerán en las ventanas vacías a la derecha. En el gráfico de muestra completa normalizado, el patrón de dos picos debería ser visible si no lo fuera antes.
9. Seleccione umbrales para aislar los picos diploide y tetraploide entre sí y los valores atípicos utilizando los controles deslizantes (Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 9). Desplázate hacia abajo. Haga clic en el botón Calcular Ploidy y Nucleación (Archivo Suplementario 1: Captura de pantalla 10).
10. Haga clic en el botón Trazar y guardar en la carpeta resultados. El trazado guardado en la carpeta de resultados seleccionada también aparecerá en esta ventana interactiva(Archivo suplementario 1: Captura de pantalla 10).

Resultados

Los cardiomiocitos fueron aislados de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Usando este método, normalmente obtenemos cardiomiocitos uniformemente singularizados que son relativamente puros sin contaminar las células no cardiomiocitos(Figura 1A). Los cardiomiocitos se identifican fácilmente bajo microscopía de campo brillante debido a su tamaño característico y birefringencia. Esta técnica es fácil de implementar y proporciona resultados consistentes de diferentes aislamientos con rendimientos y calidad de cardiomiocitos comparables(Figura 1B). Los cardiomiocitos aislados se pueden almacenar a 4 oC durante varias semanas antes de su uso posterior.

Los cardiomiocitos que fueron aislados de acuerdo con el protocolo anterior se pueden utilizar para diversas aplicaciones aguas abajo, tales como la medición del tamaño de los cardiomiocitos, el ploidía cardiomiocitos y la inmunocitoquímica. Como resultado representativo, mostramos que los cardiomiocitos aislados de acuerdo con este protocolo se pueden teñir utilizando anticuerpos y azidas conjugadas con fluorocromo para la química de clics para detectar la localización de proteínas específicas o para detectar la replicación del ADN de cardiomiocitos, respectivamente. Por ejemplo, teñimos cardiomiocitos con anticuerpos reconociendo α-actinin para mostrar el patrón característico de tinción de la línea z de sarcomeres (Figura 2A). En un experimento separado, administramos la timidina analógica 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) a ratones antes de aislar cardiomiocitos fijos. Después del aislamiento de cardiomiocitos, nos manchamos para incorporar EdU utilizando protocolos estándar^13,y pudimos detectar cardiomiocitos que habían sufrido fase S en cardiomiocitos mononucleados, binucleados y trinucleados(Figura 2B).

Para ampliar aún más la utilidad del método de aislamiento, desarrollamos una tubería que permite cuantificar la ploidía de cardiomiocitos basada en la tinción integrada del ADN. Para poder medir el estado de la ploidy de las células o núcleos, necesitábamos segmentar los núcleos y los cardiomiocitos. La Figura 3 muestra una representación de la estrategia que usamos para identificar núcleos individuales. En primer lugar, la imagen original de la imagen de ADN manchado (Figura 3A) se umbrala en función de la intensidad (Figura 3B). Aquí, usamos DAPI para manchar el ADN, pero cualquier otro tinte nuclear que muestre una correlación lineal con el contenido de ADN funcionaría. El programa permite elegir cualquiera de los métodos de umbral de intensidad de Fiji, pero en este ejemplo se utilizó el método de Otsu. Se excluyen las máscaras nucleares que tocan el borde de la imagen o son más pequeñas que el umbral de área de píxel mínimo especificado. Luego, las elipses se ajustan a las máscaras nucleares, segmentando núcleos individuales. La figura 3C muestra estas elipses superpuestas en la imagen original. A continuación, los agujeros se rellenan en las máscaras y los píxeles de la imagen se dividen en territorios en función de la elipse en la que son más proximales(Figura 3D). Las fronteras de estos territorios se utilizan entonces para trazar líneas a través de clusters nucleares, terminando el proceso de segmentación nuclear (Figura 3E).

El siguiente paso consiste en la detección de cardiomiocitos. Para las imágenes de cardiomiocitos que se obtienen a base de células manchadas fluorescentemente(Figura 4A), el proceso es muy similar al de los núcleos. La imagen se limita en función de un valor de intensidad calculado por el método de umbral seleccionado, en este caso el método de triángulo. Se excluyen las máscaras de cardiomiocitos identificadas que están tocando el límite de la imagen o están por debajo de un cierto tamaño y se rellenan agujeros en las máscaras para proporcionar cardiomiocitos debidamente segmentados (Figura 4B). Debido a que los cardiomiocitos tienen una forma más irregular que los núcleos, no se intenta segmentar los grupos de cardiomiocitos. En su lugar, estos clústeres se excluyen en función del diámetro mínimo alto de Feret durante el paso de análisis. La segmentación de imágenes de campo brillante se realiza de forma ligeramente diferente. En primer lugar, la imagen de campo brillante original (Figura 4C) se procesa con un filtro de borde Sobel. Este filtro calcula el valor absoluto del degradado de cada píxel dentro de la imagen. Los píxeles de las regiones con cambios rápidos reciben valores altos y píxeles en regiones suaves de la imagen que reciben valores bajos. Esta imagen filtrada por bordes se limita por intensidad, utilizando el método Triángulo, lo que resulta en cardiomiocitos enmascarados (Figura 4D). Estas máscaras altamente irregulares se suavizan y se unen entre sí mediante el cierre morfológico utilizando un círculo con un radio de 2 píxeles, que rellena todas las regiones blancas de la imagen donde el círculo no cabe sin superponerse a una región negra(Figura 4E). Finalmente, se rellenan los agujeros en las máscaras, se excluyen las regiones que tocan el borde y se eliminan pequeñas partículas, terminando el proceso de segmentación de cardiomiocitos (Figura 4F).

Usando la estrategia de segmentación esbozada, podemos entonces determinar el estado de nucleación de los cardiomiocitos individuales. Usando este enfoque, determinamos el estado de nucleación de los cardiomiocitos aislados de corazones de ratones CD-1 de razas ambulatorias en los primeros puntos de tiempo postnatales. Los corazones de ratones recién nacidos (primer día de vida) mostraron que la mayoría de los cardiomiocitos en ese momento son mononucleados(Figura 5: neonatal). Esta alta frecuencia de cardiomiocitos mononucleados es mucho menor en ratones juveniles (2 semanas de edad), donde los cardiomiocitos mononucleados conforman alrededor del 25% de la población total de cardiomiocitos(Figura 5:juvenil). Por último, podemos medir el estado de ploidy de los núcleos individuales dentro de los cardiomiocitos, y determinar si son diploide o tetraploides. Estos resultados muestran una mayor frecuencia de núcleos tetraploideos en ratones adolescentes (Figura 6).

Figura 1: Eficiencia del aislamiento de cardiomiocitos después de la fijación. (A) Imagen representativa de cardiomiocitos aislados manchados con DAPI para mostrar núcleos. (DAPI (azul), Campo brillante (gris)) (B) Rendimiento de cardiomiocitos aislados de diferentes ratones a los 3 meses de edad. Barras de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Inmunocitoquímica de cardiomiocitos aislados. (A) Imagen representativa de los cardiomiocitos manchados por α-actinin (α-actinin (rojo) y DAPI (azul)). (B) Cardiomiocitos manchados para EdU (rojo) incorporado y DAPI (azul). Se muestran cardiomiocitos representativos mononucleados (izquierda), binucleados (medio) y trinucleados (derecha) y EdU positivos. Barras de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Estrategia para la segmentación nuclear. (A) Imagen de canal DAPI original. (B) Imagen umbralada (en este ejemplo, se utilizó el método de Otsu). (C) Máscaras identificadas a partir de las imágenes umbraladas superpuestas en la imagen teñida DAPI original. (D) Teselación Voronoi a base de máscaras nucleares. (E) Núcleos segmentados finales, con racimos divididos resaltados. Barras de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Estrategia para la segmentación de cardiomiocitos. (A) Troponina fluorescente original teñida imagen de cardiomiocitos. (B) Imagen umbral de triángulo, después de rellenar agujeros y excluir objetos pequeños y aquellos que tocan el borde. (C) Imagen de cardiomiocitos de campo brillante original (D) Imagen de cardiomiocitos filtrada por bordes y umbral de triángulo (E) Imagen filtrada por borde después de un cierre morfológico con un radio de dos píxeles (F) Misma imagen después de rellenar agujeros y excluir objetos pequeños y aquellos que tocan el borde. Barras de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Clasificación de cardiomiocitos en función del número de núcleos. Los corazones neonatales (1 día de edad) contienen más cardiomiocitos mononucleados que los corazones juveniles (14 días de edad). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Distribución del contenido de ADN de cardiomiocitos por núcleo. En neonatos (izquierda), el 13,5% de los núcleos CM mononucleados son tetraploides y el 11,9% de los núcleos CM binucleados son tetraploides. En los juveniles (derecha), el 33,9% de los núcleos CM mononucleados son tetraploides y el 31,2% de los núcleos CM binucleados son tetraploides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo Suplementario 1: Capturas de pantalla de software. Haga clic aquí para ver este archivo (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Archivo Suplementario 2: AnalyzeNucleation.py. Haga clic aquí para ver este archivo (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Archivo suplementario 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Haga clic aquí para ver este archivo (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Discusión

Dado que los cardiomiocitos no se pueden mantener en el cultivo, es importante aislar los cardiomiocitos primarios para poder estudiar su arquitectura y función^11. Por lo tanto, las técnicas de aislamiento de cardiomiocitos han sido ampliamente utilizadas en el campo cardíaco. Si el objetivo es determinar los aspectos funcionales de los cardiomiocitos, es importante aislar los cardiomiocitos viables. Estos cardiomiocitos vivos también se pueden utilizar para realizar inmunosumanidades en cardiomiocitos aislados. Sin embargo, optimizar la técnica de aislar cardiomiocitos vivos es técnicamente difícil, e incluso las mejores técnicas normalmente sólo producen 60-65% cardiomiocitos vivos en forma de varilla, y los cardiomiocitos restantes están todos hinchados y muriendo o muertos^11,12. Aquí, desarrollamos una técnica que permitirá a los investigadores fijar primero el corazón, y luego aislar los cardiomiocitos eficientemente. Este nuevo protocolo permite rendimientos mucho más altos de cardiomiocitos en forma de varilla en comparación con los protocolos publicados anteriormente. Además, desarrollamos una plataforma de análisis de imágenes para clasificar los cardiomiocitos automáticamente en función de la nucleación y la ploidy. Con estas nuevas metodologías, los grupos pueden manchar los cardiomiocitos para diferentes proteínas, y estudiar la ploidy cardiomiocitos y el estado de nucleación como sustitutos del potencial regenerativo del corazón.

El protocolo descrito aquí es relativamente sencillo y se puede realizar sin ningún equipo avanzado. La cantidad de colagenasa y el tiempo de incubación para la digestión pueden variar dependiendo del lote de colagenasa, y la empresa que lo proporciona. Usamos colagenasa tipo 2, ya que esto se utiliza más ampliamente para digerir el corazón para obtener cardiomiocitos vivos. Basándonos en nuestras observaciones, determinamos que la incubación durante la noche con 60 mg/ml de colagenasa tipo 2 es óptima para casi todos los corazones de ratón independientemente del nivel de fibrosis. Nunca hemos tenido un problema de sobredigestión ya que las proteínas intracelulares son fijas y no tan accesibles como el colágeno extracelular. Sin embargo, si el corazón no se digiere adecuadamente, podría ser necesaria una trituración más vigorosa, lo que causa fragmentación celular debido al estrés de cizallamiento. Por lo tanto, es crucial asegurarse de que el corazón se digiere correctamente antes de pasar a la trituración. La rigidez del corazón se puede probar apretando con fórceps para evaluar el grado de digestión. Después de la incubación con colagenasa, los corazones deben ser menos rígidos y fáciles de desgarrar. También se pueden utilizar otros tipos de colagenasa. Un informe anterior utilizó una combinación de colagenas B y D¹⁴.

Además, creemos que este protocolo se puede utilizar para evaluar el número total de cardiomiocitos en el corazón¹⁵. Sin embargo, si el objetivo es obtener y cuantificar todos los cardiomiocitos del corazón, es importante incubar los corazones durante largos períodos de tiempo en la solución de colagenasa (por ejemplo, 3-7 días), donde la solución de colagenasa debe reponerse una vez al día. Esto minimizará las incoherencias en la eficiencia de aislamiento al eliminar el impacto del grado de trituración en el rendimiento de los cardiomiocitos.

El uso del contenido de ADN para medir la ploidy no es nuevo, y se ha utilizado en la citometría de flujo durante décadas. Recientemente, se demostró que la microscopía se puede utilizar de manera similar para estimar el contenido de ADN por núcleo¹⁶. Aquí, implementamos esta estrategia para medir la ploidía de los núcleos cardiomiocitos, como sustituto de los cardiomiocitos recién formados. El dogma en el campo de la regeneración cardíaca es que sólo los cardiomiocitos mononucleados y diploide pueden someterse a citoquinesis y dar lugar a nuevos cardocitos. Dado que es muy difícil medir la formación de nuevos cardiomiocitos in vivo, cardiomiocitos aislantes que han sido perseguidos después de la administración de un análogo de nucleótidos de ADN y determinar el nivel de cardiomiocitos mononucleados y diploides se ha utilizado como una aproximación de la capacidad del corazón para generar nuevos cardiomiocitos¹⁷. Aquí, proporcionamos una macro para ImageJ que permite la cuantificación fácil de la ploidía cardiomiocitos. Como mínimo, se deben medir 500 núcleos para alcanzar una estimación exacta de la ubicación del pico G1. Si se tiene cuidado de asegurarse de que las condiciones de tinción e imagen sean consistentes en todos los pozos de la placa de imagen, sólo 500 núcleos en toda la muestra deben ser tomados de imagen, de lo contrario, debe haber 500 núcleos por grupo de imágenes^18,19. Las limitaciones de la medición basada en imágenes de nucleación y ploidy incluyen dificultad para distinguir los núcleos de las células adherentes de los núcleos de cardiomiocitos reales, cuando se utilizan imágenes bidimensionales. Estas células adherentes podrían resultar en una sobreestimación de la cantidad de células multinucleadas y disminuir la precisión de las mediciones de la población del núcleo de cardiomiocitos tetraploide. Una posible estrategia para resolver este problema sería utilizar el marcador nuclear cardiomiocitos PCM1^6,20. Sin embargo, hemos tenido dificultades para obtener manchas confiables de PCM1 en células o tejidos correctamente fijos.

Otra limitación potencial es que algunas imágenes de manchas nucleares podrían tener una tinción citoplasma de fondo significativa, lo que impide un umbral adecuado utilizando métodos incorporados en Fiji sin un preprocesamiento extensivo. Además, la contribución irregular de esta fluorescencia de fondo en estimaciones de ploidy reduce su precisión. Además, si las células no se dejan en la solución de tinción de ADN durante el tiempo suficiente, el tinte fluorescente no se unirá a la saturación dentro de los núcleos y la suposición de una relación lineal entre la intensidad nuclear integrada y el contenido de ADN ya no será precisa.

Cabe señalar que el software no puede segmentar los grupos de cardiomiocitos y en su lugar los elimina del análisis. Por lo tanto, es de vital importancia para los cardiomiocitos de semilla a una densidad relativamente baja (por ejemplo, 1000 células/cm^2). Además, el software no puede distinguir entre dos cardiomiocitos alineados de extremo a extremo y largos, cardiomiocitos singulares. Este tipo de clústeres podrían inflar erróneamente las estimaciones de multinucleación.

Aunque el método descrito no permite la obtención de cardiomiocitos viables y por lo tanto no se puede utilizar para medir procesos celulares dinámicos, si el objetivo es realizar inmunosutención, creemos que el método descrito es superior a los protocolos existentes con mayores rendimientos de cardiomiocitos y mejor calidad en términos de morfología y localización de proteínas. Por último, el método descrito podría utilizarse para aislar cardiomiocitos de muestras clínicas^14,21. Creemos que la metodología descrita puede ayudar a diferentes investigadores a obtener cardiomiocitos de alta calidad y medir la nucleación y la ploidy como sustitutos para la formación de nuevos cardiomiocitos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 wells plate for imaging	Corning	3340	We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging
Alpha actinin	Novus Biologicals	NBP1-32462	This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres
Blunt scissors	Fine Scissor Tools	14072-10	We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
CD-1 mice	Charles river	22	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
Collagenase 2	Worthington	LS004177	For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165-10G	For edu staining
Cy5 Picolyl Azide	Click Chemistry Tools	1177-25	Azide used for edu staining
Cytation3	BioTek	-	Used for automated imaging for DNA analysis
DAPI	Life Technologies	D3571	DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water.
donkey anti-mouse IgG-Alexa568	Life Technologies	A10037	Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes
Forceps	ROBOZ	RS-5137	We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144212	To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5
ImageJ	imagej.net/Fiji/Downloads	-	Used for analyzing images
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	255564-100G	For edu staining
Needle for infusion	TERUMO	SV*23BLK	We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection
Nikon A1R HD25	Nikon	-	Used to take confocal images of alpha actinin staining
Nylon mesh 200 micron	Elko filtering	03-200/54	Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied)
Nylon mesh 400 micron	Elko filtering	06-400/38	Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes
Phosphate Buffered Saline (1X)	Corning	21-040-CV	This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it
Potassium chloride, Granular	Mallinckrodt	6858	Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature
R	r-project.org	-	Used for data analysis of the measurements obtained from images
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5	Used to buffer EdU staining reaction