İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Özet

Bu çalışmanın amacı, kardiyomiyositleri yetişkin kalpten tekrarlıca izole etmek ve DNA içeriğini ve nükleasyonu ölçmek için bir yöntem geliştirmektir.

Özet

Erişkin memeli kalp kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinden oluşur. Histolojik kesitlerde kardiyomiyosit çekirdeklerini güvenilir bir şekilde tanımlamak zor olduğundan, birçok grup immünboyama yapmak için fiksasyondan önce uygulanabilir kardiyomiyositleri izole etmeye dayanır. Ancak, bu canlı kardiyomiyosit izolasyon teknikleri, maksimum optimizasyona rağmen numuneden numuneye doğal dalgalanmalar ile, numuneverim, canlılık ve kaliteyi en üst düzeye çıkarmak için optimizasyon gerektirir. Burada, kalbin enzimatik sindiriminden önce fiksasyonu içeren, tek tek kardiyomiyositlerin in vivo morfolojisini korurken maksimum verime yol açan tekrarlanabilir bir protokol bildiriyoruz. Ayrıca, tek tek kardiyomiyositler için çekirdek başına çekirdek ve DNA içeriği nin sayısını belirlemek için otomatik bir analiz platformu geliştirdik. Göğüs boşluğu ortaya çıktıktan sonra, kalp PBS 60 mM KCl ile perfüzyon ile diastole tutuklandı. Daha sonra kalp %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile sabitlendi ve 60 mg/mL kollajenaz çözeltisi ile sindirildi. Sindirimden sonra hücreler triturasyon ile tekilleştirildi ve kardiyomiyosit fraksiyonu diferansiyel santrifüj ile zenginleştirildi. İzole kardiyomiyositler, elde edilen popülasyonun saflığını değerlendirmek için Troponin T ve α-aktinin için boyandı. Ayrıca, DAPI boyama sonrasında kardiyomiyosit nükleasyonu ve ploidi durumunu belirlemek için bir görüntü analiz platformu geliştirdik. Görüntü tabanlı ploidy değerlendirmeler tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlara yol açtı. Böylece, bu protokol ile, maksimum verim elde ederken immünositokimya ve DNA içerik analizi sağlamak için bireysel kardiyomiyositlerin yerli morfolojisi korumak mümkündür.

Giriş

Kalp hastalığı onlarca yıldır batı ülkelerinin çoğunda ölüm önde gelen nedeni olmuştur^1,2. Kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde birçok iyileşme sağkalım geliştirilmiş olmasına rağmen, kayıp kardiyomiyosityerini şu anda hiçbir tedavi vardır. Bu nedenle kardiyomiyosit fonksiyonu, proliferasyon, apopoz ve hipertrofi ile ilgili çalışmalar bilim camiasının önemli odak noktaları olmuştur ve olmaya devam etmektedir. Yetişkin memeli kalp çok sınırlı bir rejeneratif kapasiteye sahip olduğundan, yılda az% 1 tahmini kardiyomiyosit yenileme oranı ile, güvenilir kardiyomiyosit proliferatif olayları tanımlamak için çok önemlidir^3,4. Proliferatif olayları ölçen stratejilerin çoğu, önceki veya mevcut proliferasyonu değerlendirmek için dna nükleotit analogları için boyamaya ya da aktif proliferasyonun nükleer belirteçleri için lekeye dayanır^5. Özellikle kardiyomiyosit proliferat olaylarını güvenilir bir şekilde tanımlamak önemlidir, çünkü proliferatif kardiyomiyositlerin toplam sayısı çok düşüktür^3,6. Örneğin, yılda endojen kardiyomiyosit% 1 yenileme oranına dayalı, bir yetişkin fare kalp^7,,8herhangi bir zamanda proliferatif olması için 25 ve 50 kardiyomiyositler arasında bulmak bekleyebilirsiniz . Kardiyomiyosit çekirdeklerinin tanımlanmasında herhangi bir yanlışlık yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, histolojik^bölümler9zor ve güvenilmez kanıtlanmıştır kardiyomiyosit çekirdekleri, güvenilir bir şekilde tanımlamak için önemlidir. Kardiyomiyositlerin tanımlanması, α-aktinin gibi belirteçler kullanılırken bile kardiyomiyositleri diğer hücre tiplerinden ayırt etmek zor olabileceğinden, tek hücrelerden doku kesitlerine göre çok daha doğrudur, ancak PCM1 histolojik kesitlerde kardiyomiyosit çekirdeklerinin güvenilir bir belirteci olabilir¹⁰.

Mevcut protokoller fiksasyon öncesinde canlı kardiyomiyosit izole güveniyor, hangi kardiyomiyositlerin en az% 30 ölümüne neden olduğu bilinmektedir, ve kardiyomiyosit lerin belirli popülasyonların yanlışlıkla seçimine yol açabilir¹¹. Ayrıca, bu protokolleri çoğaltılabilir sonuçlar sağlamak için optimize etmek kötü üne sahiptir. Hatta optimize izolasyon teknikleri genellikle en fazla% 65 canlı üretebilir, çubuk şeklinde kardiyomiyositler değişen verimleri^{ile 12}.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, araştırmacıların sabit kardiyomiyositleri izole etmesine olanak tanıyan bir protokol geliştirdik. Örnekler izolasyondan önce sabit olduğundan verim en üst düzeye çıkar ve in vivo morfoloji iyi korunur. Ayrıca bu protokol ile kardiyomiyositleri genellikle tedarikten hemen sonra düzeltilen klinik numunelerden ayırmak mümkündür. Ayrıca, yeni oluşturulan kardiyomiyositleri tanımlamak için, sadece diploid kardiyomiyositlerin genellikle yeni oluştuğu varsayıldığı için, tek tek kardiyomiyositlerin çekirdekasyon ve ploidi durumunu ölçmek önemlidir. Akış sitometrisi multinükleasyonu poliploidden ayırt edemez ve nispeten zaman ve kaynak yoğun bir protokoldür. Görüntülerdeki çekirdeklerin manuel olarak anahatları ve ölçümü çok düşük iş çıkışlı ve insan önyargısına yatkındır. Sabit, izole DAPI lekeli kardiyomiyosit lerin görüntülerinin otomatik olarak ölçülmesi bu sorunların her ikisini de çözer. Çekirdekleşme ve ploidi dağılımlarının görüntüleme tabanlı tayini, temel ekipmanlar kullanılarak en az zaman ve reaktifler ile elde edilebilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yapılmıştır ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Çözeltilerin ve cerrahi ekipmanların hazırlanması

1. İzolasyondan önce cerrahi ekipmanı %70 etanol solüsyonu kullanarak sterilize edin.
2. 60 mM'lik son konsantrasyonu elde etmek için 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine 2,24 g KCl ekleyin. KCl-PBS çözeltisi oda sıcaklığında saklayın. Fare başına 3 mL KCl-PBS çözeltisi kullanın.
3. Seyreltik 32% paraformaldehit (PFA) PBS ile çözelti içine nihai konsantrasyon elde etmek için 4% PFA. Fare başına PBS'de 10 mL %4 PFA hazırlayın. Seyreltilmiş PFA çözeltisi 4 °C'de 2-3 hafta boyunca cam bir kapta saklanabilir.
   NOT: Hazırlanan %4 PFA çözeltisi -20 °C'de daha uzun süre saklanabilir.
4. PBS'nin 1 mL'si 60 mg kollajenaz, tip 2'ye pbs ekleyerek fare başına 1 mL kollajenaz çözeltisi hazırlayın.

2. Perfüzyon ve kalbin fiksasyon

1. 1 L/dk oksijen akış hızı ile % 2-5 isofluran kullanarak hayvan anestezi. Hareket eksikliğini ve daha düşük solunum hızını onaylayarak anesteziyi onaylayın.
   NOT: Ötanaziden önce heparin (100-500 U/kg) enjekte etmek kan pıhtılaşmasını önleyerek hücre kalitesini ve verimini artırabilir ve böylece fiksatif ile kalbin daha verimli perfüzyonuna olanak sağlar.
2. Onaylı metodolojilere göre hayvan ötenazi.
   NOT: Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin hayvanların ötenazisi yönergelerine uyduk ve ötanazi için yerel IACUC onayı aldık.
3. Ötenazi yapılan hayvanı supine pozisyonunda yerleştirin ve uzuvları bantlayın.
4. Künt uçlu makas kullanarak kalbi ortaya çıkarmak için göğüs ten kesin. Kesilen aort ve inferior kavin.
5. 23 G kelebek iğnesi (yeniler için 26 G) ile bir infüzyon setine bağlı peristaltik pompa ile sol ventrikülden 3 mL KCl-PBS çözeltisi enjekte ederek kalbi perfüzyonlayın. Septumu delmemeye devam edin.
   NOT: Alternatif olarak, çözelti enjekte etmek için şırıngaya bağlı bir iğne kullanın.
6. 1 mL/dk'lık bir peristaltik pompa kullanarak 10 dakika boyunca %4 PFA çözeltisi enjekte ederek kalbi perfüzyonlayın.
7. Makas kullanarak tüm kalbi çıkarın. Kalbi çıkardıktan sonra, kesici diş vererek kalbin belirli bir bölgesini izole etmek mümkündür. Kalbi veya bir kısmını 1 mL %4 PFA çözeltisi içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin. 1 saat için 20-30 rpm arasında sallanan hız ile oda sıcaklığında rocker üzerinde kalp kuluçka.

3. Sabit kardiyomiyositlerin izolasyonu

1. Kalbi PBS çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Ventriküllerde kalan pfa kurtulmak için kalbi sıkın ve PBS yıkayın.
2. Sabit kalbi kollajenaz solüsyonu (60 mg/mL) içeren yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne koyun. Tüpü gecelik kuluçka için 37 °C'de kayaç (20-30 rpm) üzerine yerleştirin.
   NOT: Kuluçka süresini 1 haftaya kadar uzatın ve kalplerin fibrotik olması bekleniyorsa verimdeki olası değişimi azaltmak için koljenaz çözeltisini iki günde bir yeniler, bu da hücre dışı kollajeni sindirmek için kollajenaz sindiriminin daha uzun sürmesini gerektirebilir.
3. 35 mm Petri kabına kollajenaz çözeltisi ve kalp koyun. Forceps veya makas kullanarak kalbi 1 mm'lik parçalara ayırın.
4. 2 dakika için ayrık doku daha triturate için bir transfer pipet kullanın. Doku parçacıkları hala çanak kalır, dar açılış ile bir transfer pipet kullanın ve trituration devam. Dokunun çoğu parçalanına kadar devam edin.
   NOT: Tritürasyon üzerinde bireysel kardiyomiyositler kırmak için neden olur. Mikroskop altında düzenli olarak kontrol ederek triturate üzerinde değil emin olun.
5. 15 mL santrifüj tüpün üzerine 200-600 m naylon örgü yerleştirin.
   NOT: Hiperrofikardiyomiyositler için 200 m yerine 400 μm naylon kafes kullanılması tavsiye edilir.
6. Ayrık hücreleri içeren Petri kabına 5 mL PBS ekleyin ve çözeltiyi doku parçacıkları da dahil olmak üzere naylon kafesten filtreleyin. İlave 4 mL PBS geçirerek naylon örgüleri yıkayın.
7. Filtrelenmiş çözeltiyi 1 dk için 10-100 x g olarak santrifüj edin.
   NOT: 100 x g santrifüj% 100 saf kardiyomiyosit popülasyon verim olmaz, ve bazı non-kardiyomiyosit hücreleri dahil olması muhtemeldir.
8. Kardiyomiyosit olmayan kalp hücrelerini de lekelemek/değerlendirmek istemiyorsa süpernatant'ı atın. Boyama dan önce peleti 10 mL PBS'de yeniden askıya alın.

4. Kardiyomiyositboyama

1. Hücreleri 1 dk için 100 x g'de santrifüj ile toplayın ve 5 mL permeabilizasyon çözeltisi ekleyin (örneğin, PBS'de %0,5 Triton X-100). Rocker oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka.
   NOT: 4.1, 4.2 ve 4.4 adımlarında 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe kıyasla hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarmak daha kolay olduğundan 15 mL santrifüj tüpü kullanılır.
2. Hücreleri 1 dk için 100 x g'de santrifüj le toplayın, 5 mL bloke tampon (örneğin, %3 büyükbaş serum albumin [BSA] PBS' de) ekleyin ve bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Hücreleri 1 dk için 100 x g'de santrifüj ile toplayın ve uygun seyreltme oranıyla 1 mL primer antikor çözeltisi (PBS'de) ekleyin. Çözeltiyi optimize edilmiş koşullarda (örn. 4 °C) 1,5 mL mikrosentrifüge tüpe ve birincil antikor çözeltisinde inkübasyon kardiyomiyositlere aktarın (örn. 4 °C bir gecede).
4. Primer antikor solüsyonu olan kardiyomiyositleri 15 mL santrifüj tüpe aktarın ve 9 mL PBS ekleyin. Kardiyomiyositleri 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bir rocker üzerinde kuluçkaya yatırın.
5. 1 dk için 100 x g santrifüj ile hücreleri toplamak ve PBS 10 mL ekleyin. Kardiyomiyositleri 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bir rocker üzerinde kuluçkaya yatırın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
6. 1 dk için 100 x g santrifüj ile hücreleri toplamak ve DAPI içeren ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka, kardiyomiyosit yıkamak için adım 4.5 iki kez tekrarlama izledi.
7. Hücreleri kapak veya mikroskopuyumlu plakalar üzerine yerleştirin ve görüntülemeye devam edin.
   NOT: El yazmasında yer alan resimler 10x ve 40x hedeflerle alınmıştır. Kullanılan lazerler: DAPI için 405 nm, Alpha actinin için 561 nm ve Edu için 640 nm.

5. Kurulum görüntüleme yazılımı

NOT: Ek Dosya 1-SoftwareScreenshots.pdf kullanarak bu adımları takip edin.

1. ImageJ'in Fiji dağıtımını indirin.
2. Fiji'yi aç. Yardım > Güncelle'ye tıklayın... > Güncelleme Sitelerini Yönet. Bağımlılık eklentileri Elips Split ve Morpholibj indirmek için "IJPB-eklentileri" ve "Biomedgroup" güncelleme sitelerini kontrol edin.
3. Kapat'ıtıklatın. Fiji bağımlılıkları indirmeye başlamalıdır. Bittiğinde Fiji'yi yeniden başlatın.
4. Rstudio'u indirin ve açın.
5. Install.packages'ikopyalayın (c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) r konsolun komut satırına basın ve Enter tuşuna basın. Tüm R bağımlılıklarını yüklemek için tüm isteklere yanıt olarak "y" yazın (Ek Dosya 1'deEkran 1).

6. Görüntü niceliği

1. Fiji'yi açın ve "AnalyzeNucleation.py" (ek kod dosyası olarak verilir) Fiji'nin durum çubuğuna sürükleyin. Bu, komut dosyası düzenleme penceresi açılır. Başlatmak için sol alt köşede Çalıştır'ı tıklatın (Ek Dosya 1'deEkran Görüntüsü 2).
2. Bir iletişim kutusu açılır(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 3), çıktı veri dizininin yerini soran. Bu yazılım tarafından kullanılan tüm analiz verileri, şekiller ve diğer veriler bu klasörde depolanır. Başka, daha büyük iletişim kutusu açılır, tüm görüntü analizi ayarları görüntüler(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 4).
   1. Çözümlenecek görüntüleri içeren dizinin konumunu seçin.
   2. Normal ifadeleri kullanarak resim dosya adı biçimini girin. Normal ifadeleri kullanarak, dosya adının hangi bölümlerinin parantez içindeki satır, sütun, kanal ve (isteğe bağlı) siteye karşılık olduğunu belirten resim dosya adı biçimini girin. Ayraçların içine boşluk koymayın. Ayraçlarda dosya adı biçiminin değişken bölümlerini çevrele {}. Dosyaların kaydedilen yolu görüntüleme yazılımına bağlıdır ve bu adım ilgili bilgileri görüntü dosya adından alır.
      NOT: Örneğin, biçim dizesi
      r" Plaka 1-(? P[A-Za-z]+)(? P[0-9]+)-(? P[A-Za-z]+).tif"
      "Plaka 1-" ile başlayan ve ardından satırı gösteren bir veya daha fazla alfabetik harfle başlayan ve ardından sütunu gösteren bir veya daha fazla basamak la "-", ardından kanalı gösteren bir veya daha fazla harf ve ardından ".tif" harfini gösterir. Açı parantezinin içindeki "<>" gibi harfler değişken adlarıdır ve toplandığında otomatik olarak verilere kopyalanır. Değişken adlarından biri "" olmalıdır.
   3. Nükleer lekenin görülebildiği ve kardiyomiyositlerin görülebildiği kanalların adını belirtin. Bu adlar, normal ifade dosya adlarında "" değişkeni ile eşleşen parçadaki tam olarak olmalıdır.
   4. Virgülden ayrılmış değişken adlarını kullanarak görüntülerin nasıl gruplandırılmalı olduğunu belirtin. Belirli bir gruptaki tüm görüntüler tek bir toplu olarak açılacak ve analiz edilecektir. Örneğin, görüntüler her kuyu için kümelere bölünürse ve her satır ve sütun birleşimi için bir kuyu varsa, bu alana "satır, sütun" yazın.
      NOT: Bu gruplandırma değişkenleri biçim dizesinde kullanılan değişkenlerin bir alt kümesi olmalıdır. "Kanal"ı gruplandırma değişkeni olarak kullanmayın, bu durum ilgili kanal görüntülerini birbirinden ayırır.
   5. Görüntülerin tek bir iyi görüntüde bir araya getirilip birleştirilemediğini veya her site için ayrı olup olmadığını belirtin. Eski durumda, site dosya adı biçimi dizesinde belirtilmemelidir.
   6. Çekirdekleri arka plandan ayırmak için hangi eşik yöntemini kullanacağınızı seçin. Fiji'nin tüm standart eşik yöntemleri mevcuttur. Görüntü kümesi için en uygun olanı belirlemek için farklı eşik yöntemlerini test edin. Bu örnekte, Otsu yöntemini seçin.
   7. Eşik her site görüntüsü için yeniden hesaplanıp yeniden hesaplanmaması veya gruptaki her görüntü için aynı eşeğin kullanılıp kullanılmayacağını belirtin. Kardiyomiyosit görüntülerinin parlak olup olmadığını veya floresan belirteç kullanıp kullanmadığını belirtin.
   8. Kardiyomiyosit eşik yöntemini gösterin. Önceki adımda brightfield seçildiyse, bu eşik yöntemi kenar filtreli brightfield görüntülerine uygulanır. Eşik her site görüntüsü için yeniden hesaplanıp yeniden hesaplanmaması veya gruptaki her görüntü için aynı eşeğin kullanılıp kullanılmayacağını belirtin.
   9. Her bir kuyuyu kaplayan site görüntülerinin satır sayısını belirtin. Her bir kuyuyu kaplayan site görüntülerinin sütun sayısını belirtin. Piksellerde çekirdeklerin minimum alanını belirtin. Cömertçe düşük minimum boyut kullanın, daha yüksek ve daha kesin bir eşik analiz adımında hesaplanacaktır. Kardiyomiyositlerin minimum alanını belirtin.
   10. İstenilen ayarları seçtikten sonra Tamam'ıtıklatın.
3. Şekil 3 ve Şekil 4'te bulunanlara benzeyen görüntüler ekranda görünür ve analiz boru hattının farklı aşamalarını gösterir. Eşik ve segmentasyonun düzgün şekilde gerçekleştiğinden emin olmak için bu görüntüleri inceleyin.
4. Seçilen sonuç klasörü artık analiz verileriyle doldurulmalıdır(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 5). Analiz verileri dışındaki dosyalar, adları "cm_", "nuclei_" veya "nucleilink_" ile başlamadığı sürece bu klasöre güvenle kaydedilebilir.

7. Veri analizi

NOT: Üretilen csv dosyaları el ile analiz edilebilir. Analiz edilen her görüntü alt kümesi "nuclei(metadata).csv" adlı bir üçüz csv dosyası üretir, "nucleilink(metadata).csv", ve "cardiomiyocytes(metadata),csv", burada (meta veriler) form "_(ad)=(değer)" şeklindeki ad değeri çiftleri dizisiyle değiştirilir, burada (ad) ve (değer) daha önce verilen normal ifadeyle eşleşen dizelerden türetilen alfasayısal karakter dizileridir. (Örneğin, dosya adlarında satır ve sütun belirtilirse, "_row=F" ve "_column=8" gibi dizeleri bulunur). Her çekirdek ve çekirdek dosyasının isimsiz sol sütunu bir çekirdek kimlik numarasıdır. Nucleilink dosyasının "Min" sütunu, dedi çekirdek tamamen veya 0 aksi içerdiği kardiyomiyosit kimliğidir. Çekirdeklerin "Max" sütunu kısmen çekirdek veya 0 aksi belirtilen içerdiği en yüksek numaralı kardiyomiyosit kimliğidir. Kardiyomiyosit dosyasının "Ortalama" sütunu kardiyomiyosit kimlik numarasıdır.

1. Rstudio'da "AnalyzeMultinucleatedServer.R"yi açın (ek kod dosyası olarak sağlanmıştır).
2. Bu dosyanın üst kısmında "folderName" adlı bir değişken bulunur. Yanında bir dosya yolu var. Burada, son adımda seçilen çıktı veri klasörüne giden yolu son eğik çizgi olmadan yazın(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 6).
3. Komut dosyası düzenleme penceresinin sol üst köşesinde, Run Appetiketli yeşil bir ok olmalıdır. Bu oku tıklatın. Verilerin yüklenmesi ve uygulamanın ortaya çıkarolması biraz zaman alabilir.
4. Başlangıçta, üç gating grafikler görünür olacak, bir minimum geçerli nükleer alan eşiği belirtmek için, bir minimum geçerli nükleer ortalama yoğunluk eşiği belirtmek için, ve kardiyomiyositler için maksimum geçerli minimum feret çapını belirtmek için. Bu eşikleri ayarlamak için kaydırıcıları kullanın(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 7).
   NOT: Bu grafiklerin her birinde, geçerli çekirdeklere veya kardiyomiyositlere karşılık gelen geniş, geniş bir tepe noktası, enkaz veya hatalı parçalı kardiyomiyositleri temsil eden geniş kuyruklarla çevrili olmalıdır. Zirvelerin her birinin bir kuyruğunu kesmek için eşikleri kullanın.
5. Aşağı kaydırın. Seçili Eşikleri Uygula düğmesini tıklatın (Ek Dosya 1:Ekran Görüntüsü 7'nin alt kısmı).
6. Çizim Yoğunluğu Dağılımıdüğmesini tıklatın. Bu, her gruplandırma değişkeni için hem tüm numunenin hem de ayrı alt çizerlerin nükleer yoğunluk dağılımının çizimini işleyecektir.
   NOT: Örneğin, ve gruplandırma değişkenleri Fiji iletişim kutusundaki normal ifadeye girildiyse, yoğunluk dağılımını satıra ve sütuna göre gösteren çizimler burada görünür(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 8). Eğer aydınlatma ve boyama koşulları numunenin farklı kısımlarında sabitse, bu çizimler inanışı yla iki yoğunluk zirvesini, diploid çekirdekleri için daha dimer, uzun olanı ve tetraploid çekirdekler için daha parlak, daha kısa bir tane göstermelidir.
7. İç örneklem değişimi, bu desenin tüm örnek çiziminde görünmemesi ve sıra, sütun veya diğer gruplama değişkenine göre diploid ve tetraploid zirvelerin konumunda büyük çeşitlilik olmasına neden olur. İkinci durumda, bu varyasyonu hesaba katmak için onay kutusunu normalleştirin ve ayrı ayrı işaretleyin(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 9).
8. Ploidy Hesapla düğmesini tıklatın (Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 9). Tahmini Ploidy Dağıtım Arsadüğmesini tıklatın. Grafikler sağdaki boş pencerelerde görünür. Normalleştirilmiş tam örnek grafikte, daha önce değilse iki tepeli desen görünür olmalıdır.
9. Kaydırıcıları kullanarak diploid ve tetraploid zirveleri birbirinden ve aykırılardan izole etmek için eşikleri seçin(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 9). Aşağı kaydırın. Ploidy ve Nükleation (Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 10) hesapla düğmesine tıklayın.
10. Çizim düğmesini tıklatın ve Sonuçlar Klasörüne Kaydet. Seçili sonuç klasörüne kaydedilen çizim de bu etkileşimli pencerede görünür(Ek Dosya 1: Ekran Görüntüsü 10).

Sonuçlar

Kardiyomiyositler yukarıda açıklanan protokole göre izole edildi. Bu yöntemi kullanarak, genellikle kardiyomiyosit olmayan hücreleri kirletmeden nispeten saf olan tekil kardiyomiyositler elde edilir(Şekil 1A). Kardiyomiyositler karakteristik boyutları ve birefringence'leri nedeniyle parlak alan mikroskobu altında kolayca tanımlanırlar. Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve karşılaştırılabilir kardiyomiyosit verimleri ve kalitesi ile farklı izolasyonlardan tutarlı sonuçlar sağlar(Şekil 1B). İzole kardiyomiyositler daha fazla kullanılmadan önce 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.

Yukarıdaki protokole göre izole edilen kardiyomiyositler, kardiyomiyosit boyutunun ölçülmesi, kardiyomiyosit ploidi ve immünositokimya gibi çeşitli downstream uygulamalarda kullanılabilir. Temsili bir sonuç olarak, bu protokole göre izole edilen kardiyomiyositlerin, belirli proteinlerin lokalizasyonunu tespit etmek veya kardiyomiyosit DNA replikasyonunu saptamak için tıklama kimyası için antikorlar ve florokrom konjuge azitler kullanılarak boyanabileceğini gösterilmektedir. Örneğin, sarcomerelerin karakteristik z-line boyama deseni göstermek için α-aktinini tanıyan antikorlarla kardiyomiyositleri boyatıyoruz (Şekil 2A). Ayrı bir deneyde, sabit kardiyomiyositleri izole etmeden önce farelere timininanalog 5-Ethynyl-2'-deoksiürin (EdU) uyguladık. Kardiyomiyosit izolasyonundan sonra, standart protokoller¹³kullanarak EdU'ya battık ve mononükleli, binükleli ve üçlü kardiyomiyositlerde S fazı geçiren kardiyomiyositleri tespit edebildik (Şekil 2B).

İzolasyon yönteminin kullanımını daha da genişletmek için, entegre DNA boyamasına dayalı kardiyomiyosit ploidinin sayısallaştırılmasına olanak tanıyan bir boru hattı geliştirdik. Hücrelerin veya çekirdeklerin ploidi durumunu ölçebilmek için çekirdekleri ve kardiyomiyositleri segmente edebilmemiz gerekiyordu. Şekil 3, tek tek çekirdekleri tanımlamak için kullandığımız stratejinin bir temsilini göstermektedir. İlk olarak, orijinal görüntü DNA lekeli görüntü (Şekil 3A) yoğunluğuna göre eşikli (Şekil 3B). Burada, DNA için lekelemek için DAPI'yi kullandık, ama DNA içeriğiyle doğrusal bir korelasyon gösteren diğer nükleer boyalar işe yarayabilir. Program Fiji'nin yoğunluk eşik yöntemlerinden herhangi birinin seçilmesine izin verir, ancak bu örnekte Otsu'nun yöntemi kullanılmıştır. Görüntünün kenarına dokunan veya belirtilen minimum piksel alanı eşiğinin altında olan nükleer maskeler hariç tutulur. Sonra, elipsler nükleer maskelere uygun, tek tek çekirdekleri segmente. Şekil 3C, orijinal görüntünün üzerine kapatılan bu elipsleri gösterir. Daha sonra, maskelerde delikler doldurulur ve görüntünün pikselleri en yakın oldukları elipse göre bölgelere bölünür (Şekil 3D). Bu toprakların sınırları daha sonra nükleer kümeler aracılığıyla çizgiler çizmek için kullanılır, nükleer segmentasyon süreci bitirme(Şekil 3E).

Bir sonraki adım kardiyomiyosit lerin saptanmasıdır. Floresan lekeli hücrelere dayalı olarak elde edilen kardiyomiyosit görüntüleri için(Şekil 4A),süreç çekirdekler için çok benzer. Görüntü, seçilen eşik yöntemi tarafından hesaplanan bir yoğunluk değerine, bu durumda üçgen yöntemine göre eşlenir. Görüntünün sınırına dokunan veya belirli bir boyutun altında olan tanımlanmış kardiyomiyosit maskeleri dışlanır ve düzgün şekilde parçalı kardiyomiyosit sağlamak için maskelerde delikler doldurulur(Şekil 4B). Kardiyomiyositler çekirdeklerden daha düzensiz bir şekle sahip olduğundan, kardiyomiyosit kümelerini segmente etmek için herhangi bir girişimde bulunulmaz. Bunun yerine, bu kümeler analiz adımı sırasında yüksek minimum Feret çapına göre dışlanır. Parlak alan görüntülerinden segmentasyon biraz farklı ilerler. İlk olarak, orijinal parlak alan görüntüsü(Şekil 4C)Sobel kenar filtresi ile işlenir. Bu filtre, görüntüdeki her pikselin degradesinin mutlak değerini hesaplar. Hızlı değişikliklerin olduğu bölgelerdeki pikseller yüksek değerler alır ve görüntünün düzgün bölgelerindeki pikseller düşük değerler alır. Bu kenar filtreli görüntü daha sonra üçgen yöntemi kullanılarak yoğunluk tarafından eşlenir ve maskeli kardiyomiyositlerle sonuçlanır (Şekil 4D). Bu son derece düzensiz maskeler daha sonra düzeltilir ve 2 piksel yarıçapı olan bir daire kullanılarak morfolojik kapanış yoluyla birbirine bağlanır, bu da görüntüdeki tüm beyaz bölgeleri doldurur ve daire siyah bir bölge örtüşmeden sığmaz(Şekil 4E). Son olarak, maskelerde delikler doldurulur, sınıra dokunan bölgeler dışlanır ve kardiyomiyosit segmentasyon işlemi tamamlanır(Şekil 4F).

Anahatlarıyla yapılan segmentasyon stratejisini kullanarak, tek tek kardiyomiyositlerin çekirdekleşme durumunu belirleyebiliriz. Bu yaklaşımı kullanarak, erken postnatal zaman noktalarında outbred CD-1 farelerin kalplerinden izole edilen kardiyomiyositlerin çekirdekleşme durumunu belirledik. Yeni doğan farelerin kalpleri (yaşamın ilk günü) bu noktada kardiyomiyositlerin çoğunluğunun mononükleoz olduğunu göstermiştir(Şekil 5: neonatal). Mononükleli kardiyomiyositlerin bu yüksek sıklığı, mononükleli kardiyomiyositlerin toplam kardiyomiyosit popülasyonunun yaklaşık %25'ini oluşturan çocuk farelerde (2 haftalık) çok daha düşüktür(Şekil 5: juvenil). Son olarak, kardiyomiyositler içinde bireysel çekirdeklerin ploidi durumunu ölçebilir ve diploid veya tetraploid olup olmadığını belirleyebiliriz. Bu sonuçlar ergen farelerde tetraploid çekirdeklerin daha yüksek frekanslı olduğunu göstermektedir(Şekil 6).

Şekil 1: Fiksasyon sonrası kardiyomiyosit izolasyonunun etkinliği. (A) Çekirdekleri göstermek için DAPI ile boyanmış izole kardiyomiyositlerin temsili görüntüsü. (DAPI (mavi), Brightfield (gri)) (B) 3 aylıkken farklı farelerden izole edilen kardiyomiyositlerin verimi. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İzole kardiyomiyositlerin immünositokimyası. (A) α-aktin (α-aktinin (kırmızı) ve DAPI (mavi) için boyanmış kardiyomiyositlerin temsili görüntüsü. (B) Dahil EdU (kırmızı) ve DAPI (mavi) için boyanmış kardiyomiyositler. Mononükleli (sol), binükleonlu (orta) ve trinükleated (sağ) ve EdU pozitif olan temsili kardiyomiyositler gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Nükleer segmentasyon stratejisi. (A) Orijinal DAPI kanal görüntüsü. (B) Eşikli görüntü (bu örnekte, Otsu'nun yöntemi kullanılmıştır). (C) Orijinal DAPI lekeli görüntünün üzerine kaplanmış eşikli görüntülerden tanımlanan maskeler. (D) Voronoi tessellation nükleer maskeler dayalı. (E) Son parçalı çekirdekler, bölünmüş kümeler vurgulanır. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kardiyomiyosit segmentasyonu için strateji. (A) Orijinal floresan Troponin I lekeli kardiyomiyosit görüntü. (B) Üçgen eşli görüntü, delikleri doldurduktan ve küçük nesneleri ve sınıra dokunanlar hariç tutulduktan sonra. (C) Orijinal parlak alan kardiyomiyosit görüntüsü (D) Kenar filtreli ve üçgen eşikli kardiyomiyosit görüntüsü (E) İki piksel yarıçapla morfolojik kapanmadan sonra kenar filtreli görüntü(F) Delikleri doldurduktan ve küçük nesneleri ve sınıra dokunanları hariç tattıktan sonra aynı görüntü. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kardiyomiyositlerin çekirdek sayısına göre sınıflandırılması. Yenidoğan kalpler (1 günlük) çocuk kalplere göre daha mononükleli kardiyomiyositler içerir (14 günlük). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kardiyomiyosit DNA içeriğinin çekirdek başına dağılımı. Neonatlarda (solda) mononükleonlu CM çekirdeklerinin %13.5'i tetraploid, binükleli CM çekirdeklerinin %11.9'u tetraploiddir. Gençlerde (sağda), mononükleonlu CM çekirdeklerinin %33.9'u tetraploid, binükleonlu CM çekirdeklerinin %31.2'si tetraploiddir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Yazılım Ekran Görüntüleri. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 2: AnalyzeNucleation.py. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Tartışmalar

Kardiyomiyositler kültürde sürdürülemediğinden, mimari ve fonksiyon¹¹çalışabilmek için primer kardiyomiyositleri izole etmek önemlidir. Bu nedenle, kardiyomiyosit izolasyon teknikleri yaygın kardiyak alanda kullanılmaktadır. Amaç kardiyomiyositlerin fonksiyonel yönlerini belirlemekse, uygulanabilir kardiyomiyositleri izole etmek önemlidir. Bu canlı kardiyomiyositler de izole kardiyomiyositler üzerinde immünboyama gerçekleştirmek için kullanılabilir. Ancak, canlı kardiyomiyosit izole tekniği optimize teknik olarak zor, ve hatta en iyi teknikler genellikle sadece verim 60-65% canlı çubuk şeklinde kardiyomiyositler, ve kalan kardiyomiyositler tüm toplanmış ve ölüyor veya ölü^11,12. Burada, araştırmacıların önce kalbi düzeltmelerine ve sonra da kardiyomiyositleri etkin bir şekilde izole edebilmelerini sağlayacak bir teknik geliştirdik. Bu yeni protokol, daha önce yayınlanan protokollere göre çubuk şeklindeki kardiyomiyositlerin çok daha yüksek verimine olanak sağlar. Ayrıca, kardiyomiyositleri çekirdekleşme ve ploidiye göre otomatik olarak kategorize etmek için bir görüntüleme analiz platformu geliştirdik. Bu yeni metodolojiler ile, gruplar farklı proteinler için kardiyomiyosit leke olabilir, ve çalışma kardiyomiyosit ploidy ve çekirdekleşme durumu kalbin rejeneratif potansiyeli için vekilleri olarak.

Burada açıklanan protokol nispeten basittir ve herhangi bir gelişmiş ekipman olmadan gerçekleştirilebilir. Sindirim için kollajenaz ve kuluçka süresi miktarı kollajenaz çok bağlı olarak değişebilir, ve bunu sağlayan şirket. Bu en yaygın canlı kardiyomiyosit elde etmek için kalp sindirmek için kullanılan bu yana, kollajenaz tip 2 kullanılır. Gözlemlerimize dayanarak, fibrozis düzeyine bakılmaksızın 60 mg/mL kollajenaz tip 2 ile bir gecede kuluçkanın hemen hemen tüm fare kalpleri için en uygun olduğunu belirledik. Hücre içi proteinler sabit ve hücre dışı kollajen kadar erişilebilir değil gibi biz aşırı sindirim bir sorun olmamıştı. Ancak, kalp düzgün sindirilir değilse, daha güçlü triturasyon gerekebilir, hangi kesme stresi nedeniyle hücre parçalanmasına neden olur. Bu nedenle, triturasyon geçmeden önce kalbin düzgün sindirilmiş olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Kalbin sertliği sindirim derecesini değerlendirmek için forceps ile sıkma tarafından test edilebilir. Kollajenaz ile kuluçka sonrasında, kalpler daha az sert ve parçalamak kolay olmalıdır. Kollajenaz diğer türleri de kullanılabilir. Bir önceki raporda b ve D¹⁴kollajenlerin bir kombinasyonu kullanılmıştır.

Ayrıca, bu protokolün kalpteki toplam kardiyomiyosit sayısını değerlendirmek için kullanılabileceğine inanıyoruz^15. Ancak, amaç kalpten tüm kardiyomiyositler elde etmek ve ölçmek ise, kollajenaz çözeltisi (örneğin, 3-7 gün), kollajenaz çözeltisi günde bir kez doldurulması gereken zaman uzun süre kalpleri kuluçka önemlidir. Bu kardiyomiyosit verimi üzerinde tritürasyon derecesi etkisini ortadan kaldırarak izolasyon verimliliği tutarsızlıkları en aza indirecektir.

Ploidi ölçmek için DNA içeriğinin kullanımı yeni değildir ve on yıllardır akış sitometrisinde kullanılmaktadır. Son zamanlarda, mikroskobun da çekirdek başına DNA içeriğini tahmin etmek için de kullanılabilebileceği gösterilmiştir^16. Burada, kardiyomiyosit çekirdeklerinin ploidi ölçmek için bu stratejiyi uyguladık, yeni oluşan kardiyomiyositler için bir taşıyıcı anne olarak. Kardiyak rejenerasyon alanında dogma sadece mononükleli, diploid kardiyomiyosits sitokinez geçirebilir ve yeni kardiyomiyositler neden olmasıdır. Yeni kardiyomiyosit oluşumunu in vivo olarak ölçmek çok zor olduğundan, DNA nükleotit analogunun uygulanmasından sonra kovalanan kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve mononükleatlı, diploid kardiyomiyositlerin seviyesinin belirlenmesi kalbin yeni kardiyomiyosit üretme yeteneğinin yaklaşık olarak kullanılması¹⁷. Burada, imagej için kardiyomiyosit ploidinin kolay ölçülmesine olanak tanıyan bir makro salıyoruz. En azından, G1 zirvesinin yerini doğru bir şekilde tahmin etmek için 500 çekirdek ölçülmelidir. Boyama ve görüntüleme koşullarının görüntüplakanın her kuyusunda tutarlı olduğundan emin olmak için dikkatli olunması durumunda, tüm numune de sadece 500 çekirdeğin görüntülenmesi gerekir, aksi takdirde, görüntü grubu^18,19başına 500 çekirdek olması gerekir. Nükleasyon ve ploidin görüntüleme tabanlı ölçüm sınırlamaları, iki boyutlu görüntüler kullanırken çekirdekleri yapışık hücrelerden gerçek kardiyomiyosit çekirdeklerinden ayırt etme de zorluk içerir. Bu tür yapışık hücreler multinükleated hücre miktarının aşırı tahmin neden olabilir ve tetraploid kardiyomiyosit çekirdeği popülasyon ölçümleri doğruluğu azaltmak. Bu sorunu çözmek için olası bir strateji kardiyomiyosit nükleer marker PCM1^6,,20kullanmak olacaktır. Ancak, biz düzgün sabit hücreleri veya dokularda güvenilir PCM1 boyama elde etmek için zorluklar yaşadım.

Başka bir potansiyel sınırlama bazı nükleer leke görüntüleri önemli arka plan sitoplazmik boyama olabilir, fiji's kapsamlı önişleme olmadan yöntemlerle inşa kullanarak uygun eşik önlenmesi. Buna ek olarak, ploidy tahminleri içine bu arka plan floresan düzensiz katkısı onların doğruluğunu azaltır. Ayrıca, hücreler DNA boyama çözeltisinde yeterli süre bırakılmazsa, floresan boya çekirdekiçinde doygunluğa bağlanmaz ve nükleer entegre yoğunluk ile DNA içeriği arasında doğrusal bir ilişki olduğu varsayımı artık doğru olmayacaktır.

Bu yazılım kardiyomiyosit kümeleri segment olamaz ve bunun yerine analiz onları kaldırır unutulmamalıdır. Bu nedenle, nispeten düşük yoğunlukta (örneğin, 1000 hücre/cm²⁾kardiyomiyosit tohumu için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, yazılım uç-to-end ve uzun, tekil kardiyomiyositler dizilmiş iki kardiyomiyosit arasında ayrım yapamaz. Bu tür kümeler hatalı bir şekilde çoklu nükleasyon tahminlerini şişirebilir.

Açıklanan yöntem uygulanabilir kardiyomiyosit elde edilmesine izin vermese de ve bu nedenle dinamik hücresel süreçleri ölçmek için kullanılamasa da, amaç immünboyama yapmaksa, açıklanan yöntemin kardiyomiyosit lerin daha yüksek verimi ve morfoloji ve protein lokalizasyonu açısından daha kaliteli mevcut protokollerden üstün olduğuna inanıyoruz. Son olarak, açıklanan yöntem klinik örneklerden kardiyomiyositleri izole etmek için kullanılabilir^14,21. Açıklanan metodolojinin farklı araştırmacılarA yüksek kaliteli kardiyomiyosit ler elde etmelerinde ve yeni kardiyomiyosit oluşumu için vekil olarak çekirdekleşme ve ploidiyi ölçmede yardımcı olabileceğine inanıyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 wells plate for imaging	Corning	3340	We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging
Alpha actinin	Novus Biologicals	NBP1-32462	This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres
Blunt scissors	Fine Scissor Tools	14072-10	We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
CD-1 mice	Charles river	22	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
Collagenase 2	Worthington	LS004177	For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165-10G	For edu staining
Cy5 Picolyl Azide	Click Chemistry Tools	1177-25	Azide used for edu staining
Cytation3	BioTek	-	Used for automated imaging for DNA analysis
DAPI	Life Technologies	D3571	DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water.
donkey anti-mouse IgG-Alexa568	Life Technologies	A10037	Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes
Forceps	ROBOZ	RS-5137	We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144212	To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5
ImageJ	imagej.net/Fiji/Downloads	-	Used for analyzing images
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	255564-100G	For edu staining
Needle for infusion	TERUMO	SV*23BLK	We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection
Nikon A1R HD25	Nikon	-	Used to take confocal images of alpha actinin staining
Nylon mesh 200 micron	Elko filtering	03-200/54	Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied)
Nylon mesh 400 micron	Elko filtering	06-400/38	Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes
Phosphate Buffered Saline (1X)	Corning	21-040-CV	This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it
Potassium chloride, Granular	Mallinckrodt	6858	Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature
R	r-project.org	-	Used for data analysis of the measurements obtained from images
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5	Used to buffer EdU staining reaction